李娜 林星月 鄧一興 李國(guó)德 武士威 胡筱敏 代嵐

（1. 沈陽(yáng)師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，遼寧沈陽(yáng) 110034；2. 沈陽(yáng)師范大學(xué)科研處，遼寧沈陽(yáng) 110034；3. 東北大學(xué)資源與土木工程學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110004；4. 沈陽(yáng)師范大學(xué)糧食學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110034）

1 引言

短程硝化在降低污水處理費(fèi)用的同時(shí)使低碳氮比廢水的高效脫氮成為可能，但短程硝化反硝化的影響因素有很多，實(shí)際應(yīng)用中單一因素的控制很難實(shí)現(xiàn)亞硝氮的積累，增加了短程硝化反硝化實(shí)現(xiàn)的難度。甲酸為揮發(fā)性脂肪酸，目前已有研究者研究了揮發(fā)性脂肪酸對(duì)硝化反應(yīng)的抑制作用，但大多是將揮發(fā)性脂肪酸作為碳源進(jìn)行研究［1-2］，在污水處理過(guò)程中，通過(guò)投加甲酸控制短程硝化的研究未見(jiàn)報(bào)道。揮發(fā)性脂肪酸作為碳源時(shí)對(duì)硝化反應(yīng)抑制作用的研究［1-2］表明，甲酸作為控制短程硝化的抑制劑原理上分析是可行的，但尚未有相關(guān)研究。本研究采用MOE（分子操作環(huán)境）作指導(dǎo)，分析甲酸對(duì)AOB（氨氧化菌）及NOB（亞硝酸鹽氧化菌）關(guān)鍵酶活性的影響，探索甲酸對(duì)短程硝化控制的可行性。

2 MOE 模擬方法

MOE 是由Chemical Computing Group（化學(xué)計(jì)算集團(tuán)公司）公司推出的，其可應(yīng)用于生物信息學(xué)、高通量研究、蛋白質(zhì)模擬、分子模擬等領(lǐng)域。通過(guò)MOE 進(jìn)行分子對(duì)接可直觀地了解蛋白質(zhì)與小分子的相互作用［3］。甲酸的2D分子結(jié)構(gòu)通過(guò)ChemDraw 2004（CS Chemoffice 2004）制得，然后導(dǎo)入MOE 軟件得到甲酸的3D 結(jié)構(gòu)。AOB 氨單加氧酶（AMO，PDB ID：4O65），AOB 羥胺氧化還原酶（HAO，PDB ID：4N4N），反硝化菌的亞硝酸鹽還原酶（Nir-Cu，PDB ID：1sjm）的X 射線晶體結(jié)構(gòu)從Research Collaboratory for Structural Bioinformatics（RCSB，結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)研究聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室）的Protein Data Bank（PDB）數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得［4］。NOB 氧化還原酶（NXRβ）的3D 模型由SWISS-MODEL（蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)）模擬得到［5］。

3 結(jié)果與討論

3.1 甲酸與4 種關(guān)鍵酶的對(duì)接結(jié)果分析

AMO 和HAO 幾乎是所有AOB 的關(guān)鍵酶，主導(dǎo)了整個(gè)細(xì)菌的代謝過(guò)程，Nir-Cu 是反硝化菌的關(guān)鍵酶，主導(dǎo)了反硝化菌的代謝過(guò)程，可從RCSB 的PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得它們的X 射線晶體結(jié)構(gòu)。NXR 是NOB的關(guān)鍵酶，但是目前其X 射線的晶體結(jié)構(gòu)還未得到，因β亞基是它的主要功能結(jié)構(gòu)，所以通過(guò)SWISSMODEL 模擬了它的β 結(jié)構(gòu)。甲酸的2D 分子結(jié)構(gòu)通過(guò)ChemDraw 2004（CS Chemoffice 2004）制得，然后導(dǎo)入MOE 軟件得到甲酸的3D 結(jié)構(gòu)。

甲酸與4 種關(guān)鍵酶的對(duì)接情況如圖1 所示，關(guān)鍵酶只顯示氨基酸骨架結(jié)構(gòu)。選取甲酸與4 種酶對(duì)接時(shí)結(jié)合鍵最為牢固的情況進(jìn)行比對(duì)，從模擬角度看，甲酸對(duì)AOB 和NOB 的影響是促進(jìn)作用的強(qiáng)弱不同，其對(duì)AOB 促進(jìn)作用最強(qiáng)，其次是反硝化菌，對(duì)NOB 的促進(jìn)作用最弱。由此推斷有甲酸存在的情況下，AOB 與反硝化菌可能會(huì)逐漸增長(zhǎng)并成為優(yōu)勢(shì)菌種。這一結(jié)論還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

圖1 甲酸與4 種關(guān)鍵酶的對(duì)接情況

3.2 甲酸對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

為進(jìn)一步驗(yàn)證MOE 模擬結(jié)果，在運(yùn)行穩(wěn)定的MBBR 中進(jìn)行投加甲酸控制短程硝化實(shí)驗(yàn)研究，投加甲酸30 d 裝置中三氮濃度變化如圖2 所示。

圖2 投加甲酸時(shí)三氮濃度隨時(shí)間的變化情況

由圖2 可以看出，投加甲酸后出水亞硝氮濃度逐漸增加，10 d 后亞硝氮積累趨于穩(wěn)定。穩(wěn)定運(yùn)行后亞硝氮積累率最高達(dá)到89.71%，平均亞硝氮積累率由23.71%增加到76.03%。氨氮去除率在投加甲酸初期有所下降，運(yùn)行穩(wěn)定后平均氨氮去除率為99.31%，運(yùn)行穩(wěn)定后甲酸的投加對(duì)氨氮的去除沒(méi)有影響。

對(duì)未投加甲酸和投加甲酸20 d 的微生物進(jìn)行高通量測(cè)序分析，結(jié)果如圖3 所示。從微生物群落分析結(jié)果可以看出，投加甲酸20 d 的微生物高通量測(cè)序分析中出現(xiàn)了亞硝化菌nitrosomonas 以及有反硝化作用的thermomonas［6］，這一結(jié)果與MOE 模擬分析結(jié)果一致。

圖3 樣品微生物群落結(jié)構(gòu)分析

4 結(jié)論

甲酸與AMO，HAO，NXR 及Nir 的MOE 分子模擬結(jié)果表明，有甲酸存在的情況下，AOB 與反硝化菌會(huì)逐漸增長(zhǎng)并成為優(yōu)勢(shì)菌種，這一結(jié)果與投加甲酸后反應(yīng)器中微生物群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致。