王穎琦 陳瑤 陳增萍

摘?要?制備了Au-core@4-巰基苯甲酸@Ag-shell核殼型納米顆粒， 結(jié)合波譜形變定量分析理論， 采用表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）定量分析了尿液和紅細(xì)胞樣本中6-硫鳥嘌呤（6-TG）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 核殼型納米顆粒和波譜形變定量分析理論相結(jié)合可以有效消除SERS增強(qiáng)基底表面的“熱點(diǎn)”數(shù)目及其分布等因素的變化對SERS信號的乘子效應(yīng)影響， 從而實(shí)現(xiàn)尿液和紅細(xì)胞樣本中6-TG的靈敏、準(zhǔn)確定量分析。本方法對6-TG的檢出限（3σ）和定量限（10σ）分別為1 nmol/L 和3 nmol/L ， 加標(biāo)回收率在95.6%～106.7%之間。相較于傳統(tǒng)的6-TG分析方法（如高效液相色譜法）， 本方法具有簡單、靈敏、快速等優(yōu)點(diǎn)， 為復(fù)雜體系中6-TG的常規(guī)定量分析提供了參考。

關(guān)鍵詞?表面增強(qiáng)拉曼光譜; 6-硫鳥嘌呤; 核殼型納米顆粒; 波譜形變定量分析理論

1?引 言

6-硫鳥嘌呤（6-TG）為抗腫瘤藥物， 可用于各類白血病， 尤其是急性白血病的治療[1]。6-TG具有一定的毒副作用， 其中骨髓抑制是最常見的不良反應(yīng)[2]。所以， 在用藥期間必須嚴(yán)格檢查病人血象， 監(jiān)測6-TG濃度。目前， 已報(bào)道的測定6-TG的方法包括高效液相色譜法[2]、液相色譜-質(zhì)譜法[3]、電化學(xué)分析法[4]和熒光分析法[5]等。這些方法存在樣品預(yù)處理繁瑣費(fèi)時或選擇性不佳等缺點(diǎn)。如使用高效液相色譜法對6-TG進(jìn)行定量分析時， 由于6-TG在紫外-可見光區(qū)的吸收不強(qiáng)， 導(dǎo)致檢出限較高， 所需樣本的體積較大。因此， 發(fā)展簡便、快速、靈敏度高、所需樣本量小的6-TG的定量分析方法具有重要意義。

表面增強(qiáng)拉曼光譜（Surface-enhanced Raman spectroscopy， SERS）是待測物分子接近或吸附在粗糙金屬納米材料表面時， 導(dǎo)致拉曼散射增強(qiáng)的一種靈敏的分析技術(shù)[6]， 具有靈敏度高、制樣簡單、檢測速度快等優(yōu)點(diǎn)。SERS屬于表面分析技術(shù)， 信號強(qiáng)度不僅取決于待測物質(zhì)的濃度， 而且與SERS增強(qiáng)基底表面的“熱點(diǎn)”數(shù)目及其分布等因素的變化有關(guān)， 從而導(dǎo)致SERS信號重現(xiàn)性較差， 其定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確度難以達(dá)到實(shí)際定量分析的要求。在實(shí)際的SERS定量分析中， 通常采用內(nèi)標(biāo)法提高SERS定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確度[7]。然而， 傳統(tǒng)內(nèi)標(biāo)法要求內(nèi)標(biāo)必須具有與待測物質(zhì)不重疊的SERS光譜峰， 這使得內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的選取比較困難。近年來， 本研究組發(fā)展和完善了一個全新的波譜定量分析理論， 即波譜形變定量分析理論[8]， 并將其與內(nèi)標(biāo)法相結(jié)合， 成功用于提高SERS定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確度[9～13]?；诓ㄗV形變定量分析理論的內(nèi)標(biāo)法僅要求內(nèi)標(biāo)的SERS光譜不與待測物質(zhì)的SERS光譜完全重疊即可， 方便了內(nèi)標(biāo)的選取。本研究嘗試將內(nèi)標(biāo)嵌入式核殼型納米顆粒與波譜形變定量分析理論相結(jié)合， 用于尿液和紅細(xì)胞中6-TG含量的快速準(zhǔn)確定量分析。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

BWS456-785H便攜式拉曼光譜儀（i-Raman， 必達(dá)泰克光電科技上海有限公司）; LC-20AT高效液相色譜儀（HPLC， 日本島津公司）， C18ODS柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）; Tecnai G2 20透射電子顯微鏡（FEI香港有限公司）。

濃HCl和濃HNO3（株洲化工研究所）;AgNO3、KCl、二水合檸檬酸三鈉（C6H5Na3O7 ·2H2O）和Zonyl FSN-100杜邦非離子全氟表面活性劑（上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）;4-巰基苯甲酸（4-MA）、 6-TG、 抗壞血酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）; 四水合氯金酸（HAuCl4·4H2O， 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）; 健康人尿液樣本由志愿者提供; 紅細(xì)胞由湖南謳睿生物科技有限公司提供， 并獲得了湖南大學(xué)生物學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)用水均為超純水（18.25 MΩ·cm， 重慶艾科浦公司純水系統(tǒng)）。所用溶劑和化學(xué)試劑均至少為分析純， 未經(jīng)純化直接使用。

2.2?嵌入內(nèi)標(biāo)分子的核殼型納米顆粒Au-core@4-MA@Ag-shell的制備

實(shí)驗(yàn)中所用玻璃器皿均在王水（HCl+HNO3， 3∶1， V/V）中浸泡8 h以上， 用水沖洗， 烘干后使用。采用傳統(tǒng)的檸檬酸三鈉還原氯金酸的方法[14]合成40 nm金納米顆粒。然后參考文獻(xiàn)報(bào)道的方法[13， 15]并稍作改進(jìn)制備Au-core@4-MA@Ag-shell。其步驟如下： 將2 mL 40 nm金納米顆粒以9000 r/min離心15 min， 濃縮至1 mL后轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中， 依次加入50 μL 0.5%（w/V）FSN穩(wěn)定劑和5 μL 10 μmol/L 4-MA溶液。反應(yīng)6 h后， 將上述溶液以9000 r/min離心15 min兩次， 去除多余的4-MA， 然后將獲得的沉淀用超純水重新分散于圓底燒瓶中。再依次加入50 μL 0.5% FSN、1 mL 1 mmol/L抗壞血酸和800 μL 1 mmol/L AgNO3溶液。反應(yīng)15 min后，9000 r/min離心15 min， 棄去上清液， 沉淀重新分散于1 mL超純水中， 于4℃避光保存， 待用。

2.3?樣品制備

稱取0.0017 g 6-TG溶于1 mL 100 mmol/L NaOH中， 得到10 mmol/L 6-TG母液， 于4℃保存， 備用。將10 mmol/L 6-TG母液用水逐級稀釋， 得到1 μmol/L 6-TG儲備液。移取不同體積的6-TG儲備液， 用水稀釋至500 μL， 得到一系列濃度的6-TG標(biāo)準(zhǔn)溶液樣本（0、0.0050、0.0100、0.0200、0.0400、0.0600、0.0800、0.1000、0.1300、0.1500、0.1800、0.2000、0.2300 μmol/L）， 其中6-TG濃度水平為0、0.0050、0.0200、0.0600、0.1000、0.1300、0.1500、0.2000和0.2300 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液組成校正樣本集， 6-TG濃度水平為0.0100、0.0400、0.0800和0.1800 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液組成驗(yàn)證樣本集。

移取1 mL健康人尿樣（HPLC未檢測出6-TG）于10 mL離心管中， 加水稀釋10倍。將50 μL尿樣上清液與不同體積的6-TG儲備液混合， 并用水稀釋至0.5 mL， 得到含有不同濃度6-TG的尿液加標(biāo)樣本（加標(biāo)濃度分別為0、0.0400、0.0900和0.1300 μmol/L）。

取健康C57BL/6小鼠的全血6 mL， 以1200 r/min離心10 min， 棄去上清液， 沉淀用2倍體積的0.9% （W/V） NaCl溶液洗滌兩次，1200 r/min 離心10 min， 用4 mL 0.9% （W/V） NaCl溶液重懸紅細(xì)胞。取1 mL紅細(xì)胞重懸液加入4 mL冰水中， 渦旋振蕩，12000 r/min離心10 min， 上清液即為紅細(xì)胞裂解液， 于-20℃保存， 待用。移取1 mL紅細(xì)胞裂解液（用HPLC未檢測出6-TG）于10 mL離心管中， 加水稀釋10倍。將50 μL如上稀釋的紅細(xì)胞裂解液與不同體積的6-TG儲備液混合， 并用水稀釋至0.5 mL， 得到含有不同濃度的6-TG紅細(xì)胞裂解液加標(biāo)樣本（加標(biāo)濃度分別為0、0.0500、0.0800和0.1500 μmol/L）。

2.4?樣本SERS光譜的采集

將10 μL樣本（標(biāo)準(zhǔn)溶液樣本、尿液加標(biāo)樣本和紅細(xì)胞裂解液加標(biāo)樣本）、10 μL核殼型納米顆粒溶液和2.5 μL 2 mol/L KCl溶液充分混合后， 吸取20 μL混合液滴入玻璃錐孔內(nèi)， 使用耦合了BAC151A拉曼影像顯微鏡采樣系統(tǒng)的便攜式拉曼光譜儀采集其SERS光譜， 拉曼位移范圍：300～1800 cm

1; 激光波長： 785 nm; 激光功率： 100 mW; 物鏡倍數(shù)： 20倍; 曝光時間： 3000 ms。每個樣本重復(fù)測量3次。

2.5?HPLC實(shí)驗(yàn)

分別移取1 mL尿液和紅細(xì)胞裂解液于10 mL離心管中， 用甲醇稀釋10倍， 超聲10 min， 放置30 min， 以7000 r/min離心20 min， 用一次性注射器吸取上清液， 用0.22 μm濾膜過濾， 得到尿液和紅細(xì)胞裂解液樣本。采用島津LC-20AT高效液相色譜儀（C18 ODS柱色譜柱; 柱溫： 32℃; 流動相： 0.1%甲酸-甲醇（80∶20， V/V）; 流速： 1 mL/min; 檢測波長： 340 nm）對尿液和紅細(xì)胞裂解液樣本中6-TG的含量進(jìn)行檢測， 6-TG保留時間為5 min。每個樣本重復(fù)檢測3次。

3?結(jié)果與討論

3.1?實(shí)驗(yàn)原理

本研究采用核殼型納米顆粒Au-core@4-MA@Ag-shell作為SERS增強(qiáng)基底對6-TG進(jìn)行定量檢測， 原理見圖1。由于內(nèi)標(biāo)物質(zhì)4-MA標(biāo)記在Au核上， Au核外表面沉積了一層Ag殼， 因此在對6-TG進(jìn)行SERS檢測過程中， 4-MA不會從SERS增強(qiáng)基底上脫附下來， 也不與6-TG競爭SERS增強(qiáng)基底表面上（即Ag殼表面）的吸附位點(diǎn)， 因此內(nèi)標(biāo)物質(zhì)4-MA的量是固定的， 在一定程度上提高了SERS技術(shù)對6-TG的檢測靈敏度。如圖2所示，1073 cm

1（CH面內(nèi)彎曲振動）和1580 cm

1（CC拉伸振動）處為Au-core@4-MA@Ag-shell核殼型顆粒中內(nèi)標(biāo)物質(zhì)4-MA的SERS特征峰[16]; 6-TG在Au-core@4-MA@Ag-shell核殼型顆粒上的SERS特征峰在916 cm

1（N1C6彎曲振動）[17]、954 cm

1（N7C8變形振動）[18]、1247 cm

1（C8N9變形振動）和1297 cm

1（嘌呤環(huán)的CN的伸縮振動）處[19]。內(nèi)標(biāo)物質(zhì)與待測物質(zhì)的SERS光譜有顯著的差異， 因此可以采用內(nèi)標(biāo)法對6-TG進(jìn)行定量檢測。

3.2?Au-core@4-MA@Ag-shell增強(qiáng)基底的表征及其穩(wěn)定性

本研究組前期研究結(jié)果表明[13]， 以40 nm金核制備的Au-core@4-MA@Ag-shell的SERS增強(qiáng)效果較好。由圖3可見， 此核殼型納米顆粒以40 nm金顆粒作為核， 厚度約4 nm的銀作為殼， 銀殼較好地包覆在金核的周圍。在進(jìn)行SERS檢測時， 加入KCl作為聚集劑， 所獲得6-TG在916 cm1處的SERS峰強(qiáng)度與內(nèi)標(biāo)4-MA在1073 cm1處的SERS峰強(qiáng)度的比值（I916/I1073）較大。因此， 在后續(xù)定量檢測實(shí)驗(yàn)中， 采用40 nm金核為基礎(chǔ)制備的Au-core@4-MA@Ag-shell作為SERS增強(qiáng)基底， 并采用KCl作為聚集劑。

將合成好的核殼型納米顆粒于4℃儲存， 放置不同時間后， 測試同一批次顆粒的SERS信號。如圖4所示， 由于存在穩(wěn)定劑Zonyl FSN-100， 且低溫避光保存， 儲存30天后， 其SERS增強(qiáng)效果變化不大， 表明此核殼型納米顆粒具有較好的穩(wěn)定性， 是優(yōu)良的SERS增強(qiáng)基底。

3.3?校正模型

如圖5所示， 隨著標(biāo)準(zhǔn)溶液樣本中6-TG濃度的逐漸增加， 6-TG在916 cm1處的SERS峰強(qiáng)度與內(nèi)標(biāo)4-MA在1073 cm1處的SERS峰強(qiáng)度的比值（I916/I1073）首先呈現(xiàn)上升的趨勢， 當(dāng)6-TG的濃度超過0.1 μmol/L后， I916/I1073逐漸減小， 而且同一個樣本的3次重復(fù)測量的信號之間的差異也十分明顯。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的主要原因在于進(jìn)行SERS檢測時無法控制增強(qiáng)基底Au-core@4-MA@Ag-shell表面的“熱點(diǎn)”數(shù)目及其分布， “熱點(diǎn)”數(shù)目及其分布的變化對樣本SERS光譜信號的影響難以通過簡單地計(jì)算兩個SERS峰強(qiáng)度的比值而有效地消除。

為了消除進(jìn)行SERS增強(qiáng)基底表面的“熱點(diǎn)”數(shù)目及其分布的變化對6-TG樣本SERS光譜信號的影響， 本研究采用前期提出的如下波譜形變定量分析理論（Spectral shape deformation， SSD）[8]對6-TG樣本的表面增強(qiáng)拉曼光譜進(jìn)行定量分析。

xk=bk·（c6-TG，k·r6-TG+c4-mA，k·r4-MA）+dk; （k=1，2，…，K）（1）

其中， xk為第k個校正樣本的SERS光譜; c6-TG，k為第k個校正樣本中6-TG的濃度; c4-MA，k為核殼型納米顆粒中標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)4-MA的濃度; r6-TG和r4-MA分別代表6-TG和4-MA單位濃度的SERS響應(yīng);

模型參數(shù)bk表示SERS增強(qiáng)基底表面的“熱點(diǎn)”數(shù)目及其分布等因素的變化對第k個校正樣本的SERS光譜信號強(qiáng)度產(chǎn)生的乘子效應(yīng); dk表示背景干擾等對第k個校正樣本SERS光譜信號產(chǎn)生的非乘子效應(yīng)。由于內(nèi)標(biāo)物4-MA的濃度c4-MA為常量， 以上SSD模型中校正樣本的參數(shù)bk （k=1，2，…，K）可以用改進(jìn)光程估計(jì)與糾正的方法（Modified optical path length estimation and correction， OPLECm）[20]進(jìn)行估算。獲得模型參數(shù)bk（k=1，2，…， K）后， 采用多元線性回歸方法（Partial least squares， PLS）[21]在xk與bk之間， 以及xk與bkc6-TG， k之間建立

兩個校正模型。獲得待測樣本的SERS光譜xtest后， 樣本中6-TG的濃度可以由第二個校正模型的預(yù)測值除以第一個校正模型的預(yù)測值獲得。

SSD校正模型建立在校正集樣本的SERS光譜數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上， 校正模型的最優(yōu)參數(shù)值是根據(jù)校正模型對驗(yàn)證集樣本的預(yù)測均方根誤差最小這一標(biāo)準(zhǔn)確定的。圖6為SSD校正模型對校正集和驗(yàn)證集中6-TG濃度的預(yù)測結(jié)果。SSD模型對校正集和驗(yàn)證集的定量分析結(jié)果的均方根誤差分別為0.008和0.010 μmol/L， 對驗(yàn)證集的定量分析結(jié)果的平均相對預(yù)測誤差為11.3%。上述結(jié)果表明， SSD校正模型能有效地消除SERS增強(qiáng)基底表面的“熱點(diǎn)”數(shù)目及其分布等因素的變化對SERS定量分析結(jié)果的不利影響。值得指出的是， 當(dāng)6-TG的濃度為0.23 μmol/L時， SSD模型的預(yù)測結(jié)果比實(shí)際濃度稍有偏低， 這主要是因?yàn)榇藭r吸附在增強(qiáng)基底Au-core@4-MA@Ag-shell表面上的6-TG接近飽和。進(jìn)一步增加樣本中6-TG的濃度不會引起樣本SERS信號的顯著變化， 因此， 可認(rèn)為在本實(shí)驗(yàn)檢測條件下， SSD校正模型對6-TG的檢測上限約為0.23 μmol/L。

3.4?生物樣本中6-TG的定量分析結(jié)果

表1為采用SSD校正模型對尿液加標(biāo)樣本和紅細(xì)胞裂解液加標(biāo)樣本中的6-TG的定量分析結(jié)果。對于未添加6-TG的尿液和紅細(xì)胞裂解液樣本（采用HPLC方法未檢出6-TG）， SSD校正模型未檢出6-TG; 對于添加了6-TG的尿液和紅細(xì)胞裂解液樣本， SSD校正模型定量分析結(jié)果的回收率在95.6%～106.7%之間。結(jié)果表明， Au-core@4-MA@Ag-shell納米顆粒與SSD校正模型相結(jié)合能夠?qū)崿F(xiàn)復(fù)雜生物樣本（如尿液、紅細(xì)胞裂解液等）中6-TG的準(zhǔn)確定量分析， 檢測限（3σ）和定量限（10σ）分別約為1 nmol/L和3 nmol/L， 定量檢測濃度范圍為0.003～0.23 μmol/L; 待測樣本基質(zhì)的變化和SERS增強(qiáng)基底表面的“熱點(diǎn)”數(shù)目及其分布的變化對定量分析結(jié)果沒有顯著影響。

有文獻(xiàn)報(bào)道高效液相色譜法對6-TG的檢出限約為0.02 mg/L（約0.1 μmol/L）[22]。相比于高效液相色譜法， 本方法對6-TG的檢出限更低。雖然文獻(xiàn)中的其它方法（如液相色譜-質(zhì)譜法[3]、電化學(xué)分析法[4]和熒光分析法[5]等）對6-TG也具有較高的檢測靈敏度， 但這些方法均需要對樣本進(jìn)行較為繁瑣、耗時的前處理或復(fù)雜的分離過程。本方法具有樣品前處理簡單、檢測時間短等優(yōu)點(diǎn)， 有望發(fā)展成為一種簡單、快速、靈敏的檢測6-硫鳥嘌呤的新方法。

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Quantification of 6-Thioguanine in Biological Samples

by Spectral Shape Deformation Quantitative Theory

Combined with Core-shell Nanoparticles

WANG Ying-Qi1， CHEN Yao*2， CHEN Zeng-Ping*1

1（State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics，College of Chemistry and Chemical Engineering，

Hunan University，Changsha 410082，China）

2（Hunan Key Lab of Biomedical Materials and Devices，College of Life Sciences and Chemistry，

Hunan University of Technology，Zhuzhou 412008，China）

Abstract?The core-shell nanoparticles （i.e.，Au-core@4-mercaptobenzoic acid@Ag-shell） were combined with spectral shape deformation （SSD） quantitative model for quantification of 6-thioguanine （6-TG） in urine and red blood cell lysate samples. Experimental results showed that the combination of core-shell nanoparticles with SSD model could effectively remove the detrimental multiplicative effects on samples' surface enhanced Raman spectroscopy （SERS） signals caused by the variations of the number of “hot spots” and their distribution near/on the surfaces of SERS enhancing substrates，and hence realized the accurate quantitative determination of 6-TG in urine and red blood cell lysate samples with recovery of 95.6%-106.7%. The limit of detection （3σ） and limit of quantification （10σ） for 6-TG were estimated to be about 1 and 3 nmol/L，respectively. Compared with conventional methods for analysis of 6-TG such as high performance liquid chromatography （HPLC），the proposed method had many advantages such as simplicity，rapidity and high sensitivity，and had great potential in routine quantitative analysis of 6-TG in complex samples.

Keywords?Surface enhanced Raman spectroscopy;6-Thioguanine;Core-shell nanoparticles;Spectral shape deformation quantitative theory

（Received 13 July 2019;accepted 3 December 2019）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 21705044，21775038） and the Natural Science Foundation of Hunan Province，China （No. 2018JJ3114）.