鄧穎，白義鳳，楊蘭，王林，周曉剛

0 引言

胰腺癌（pancreatic cancer,PC）是一種起源于胰腺腺管上皮細胞的惡性程度極高的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率呈明顯上升趨勢，盡管胰腺癌在手術(shù)、放療、化療、免疫治療等領(lǐng)域取得了一些進展[1]，但由于缺乏敏感度和特異性的早期診斷指標、大部分患者發(fā)現(xiàn)時已是中晚期，患者一般情況差，難以耐受有效的治療手段[2]。因此，尋找胰腺癌早期診斷及療效評估生物標志物，對于改善預(yù)后及提高患者生存具有十分重要的意義。

環(huán)狀RNA（circRNA）是一類特殊的非編碼RNA分子，呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不受RNA外切酶影響，表達穩(wěn)定，不易降解[3]。近年研究表明，circRNA分子富含miRNA結(jié)合位點，在細胞中起到miRNA海綿的作用，進而解除miRNA對其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表達水平。通過與疾病關(guān)聯(lián)miRNA相互作用，circRNA在疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，circRNA參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，與腫瘤的預(yù)后相關(guān)[5]。然而關(guān)于circRNAs在胰腺癌中的作用機制尚未完全闡明。課題組前期通過基因芯片在胰腺癌組織及癌旁組織中檢測差異表達的circRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Circ_0001946在胰腺癌組織中高表達。然而關(guān)于Circ_0001946在胰腺癌中的作用目前少見報道，本研究旨在探討Circ_0001946在胰腺癌患者中的表達及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 標本來源

經(jīng)醫(yī)院倫理委員會的批準，所有患者簽署了書面知情同意書。收集2014年1月—2018年12月于四川省人民醫(yī)院確診的胰腺癌患者癌組織及配對癌旁組織55例，同時收集患者的血清標本。所有胰腺癌組織及配對的癌旁組織均經(jīng)病理學確診。所有患者術(shù)前均未接受過放化療和（或）中藥抗腫瘤。所有切除的新鮮組織標本均立即用液氮冷凍直至使用。同時收集30例健康體檢者的血清標本作為對照。所有入選病例確診后即刻用含抗凝劑的紫色采血管采集10 ml靜脈血4℃冷藏30 min后，室溫下3 000 r/min離心15 min，留取上層血清，置于-80℃冰箱備用。

1.2 隨訪

所有患者出院后均進行了隨訪。隨訪起點為手術(shù)或病理活檢日期，末次隨訪時間為2019年4月30日，至隨訪截止日，生存15例，死亡37例，失訪3例。

1.3 qRT-PCR法分析Circ_0001946的表達水平

TRIzol法提取組織及血清標本中總RNA。將提取的總RNA，參照AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用2×SYBR Green PCR Master Mix，以cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR。PCR反應(yīng)在定量PCR反應(yīng)儀上進行。三次獨立實驗后得到的數(shù)據(jù)運用公式RQ=2-ΔΔCt進行分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。Circ_0001946在血清及組織標本中的差異表達采用t檢驗分析。Circ_0001946與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系使用Chi-Square檢驗；Kaplan-Meier法分析Circ_0001946的表達與生存時間及預(yù)后的關(guān)系，應(yīng)用單因素及多因素Cox比例風險模型分析影響胰腺癌預(yù)后的因素，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Circ_0001946在胰腺癌組織及血清中的表達

qRT-PCR法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組比較，Circ_0001946在胰腺癌患者組織及血清中的表達明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（均P=0.000），見圖1A～B。

2.2 血清Circ_0001946的表達與患者臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)血清Circ_0001946的平均表達水平，將其分為Circ_0001946高表達組（≥8.430）及低表達組（＜8.430）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Circ_0001946的表達與患者的性別（P=0.911）、年齡（P=0.567）、CEA的表達（P=0.509）無關(guān)；與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.015）、CA199的表達（P=0.000）、疾病分期（P=0.027）及脈管癌栓（P=0.000）明顯相關(guān)，見表1。

2.3 胰腺癌患者生存分析

Kaplan-Meier法分析發(fā)現(xiàn)高表達Circ_0001946的患者中位無進展生存時間及總生存時間均較低表達者明顯縮短，差異有統(tǒng)計學意義（均P=0.000），見圖2。

2.4 血清Circ_0001946與CA199的相關(guān)性研究

進一步分析發(fā)現(xiàn)血清Circ_0001946與CA199的表達量呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.765,P=0.000），見圖3。

2.5 血清Circ_0001946診斷胰腺癌的效能

ROC曲線分析血清Circ_0001946診斷胰腺癌的生物效能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ROC曲線下面積為0.805（95%CI:0.754～0.927,P=0.000），見圖4。

2.6 單因素及多因素分析影響胰腺癌患者預(yù)后因素

單因素及多因素Cox比例風險模型分析結(jié)果顯示，疾病分期（P=0.007）、Circ_0001946表達（P=0.004）及脈管癌栓（P=0.014）是胰腺癌患者預(yù)后的獨立影響因素，見表2。

3 討論

胰腺癌臨床表現(xiàn)隱匿，由于缺乏敏感度和特異性的早期診斷指標，因此早期診斷困難，發(fā)現(xiàn)時已是中晚期，預(yù)后極差[6]，是癌癥相關(guān)死亡的主要原因[7]。尋找胰腺癌早期診治的新靶標，對于改善預(yù)后及提高患者生存時間具有重要的臨床意義。

圖1 qRT-PCR法檢測Circ_0001946在胰腺癌患者組織(A)及血清(B)中的表達Figure 1 Circ_0001946 expression in tissues(A) and serum(B) of pancreatic carcinoma patients detected by qRT-PCR

表1 胰腺癌患者血清Circ_0001946的表達與臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Correlation between Circ_0001946 expression and clinicopathological features of pancreatic cancer patients

圖2 Circ_0001946的表達與胰腺癌患者中位無進展生存時間及總生存時間的關(guān)系Figure 2 Relation of Circ_0001946 expression with median progression-free survival(PFS) and overall survival(OS) of pancreatic cancer patients

圖3 血清Circ_0001946的表達與CA199的相關(guān)性Figure 3 Correlation between Circ_0001946 expression and CA199 in serum of pancreatic cancer patients

圖4 ROC曲線分析血清Circ_0001946診斷胰腺癌的生物效能Figure 4 ROC curve analysis of biological potential of serum Circ_0001946 in diagnosis of pancreatic cancer

表2 Cox比例風險模型分析影響胰腺癌患者OS的臨床病理因素Table 2 Univariate and multivariate analyses of clinicopathological features for OS of pancreatic carcinoma patients

環(huán)狀RNA（circRNA）是一種不同于線性RNA的新型RNA，由于其表達具有組織特異性，表達量較大，在組織或體液中穩(wěn)定存在，使circRNA成為較理想的疾病早期診斷和預(yù)后評估生物標志物[8]。研究發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA ciRS-7通過調(diào)控mir-7介導(dǎo)的EGFR/STAT3信號通路，促進胰腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移[9]。環(huán)狀RNA circ_0030235高表達是胰腺導(dǎo)管腺癌的不良預(yù)后的預(yù)測因素，并通過海綿miR-1253和miR-1294促進細胞的進展[10]。circZMYM2與miR-335-5p競爭性結(jié)合，調(diào)控胰腺癌中的JMJD2C的表達，促進胰腺癌的進展[11]。環(huán)狀RNA circRHOT1的上調(diào)可促進胰腺癌細胞增殖和侵襲[12]。環(huán)狀RNA circ_0007534通過海綿吸附miR-625和miR-892b調(diào)控胰腺癌細胞增殖、凋亡和侵襲，是胰腺導(dǎo)管腺癌預(yù)后不良的影響因素[13]。環(huán)狀RNA PDE8A通過miR-338/MACC1/MET通路促進胰腺癌的侵襲性生長[14]。通過激活miR-874-3p和抑制PLK1表達，從而下調(diào)環(huán)狀RNA hsa_circ_0000977的表達，抑制胰腺導(dǎo)管腺癌的進展[15]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Circ_0001946在胰腺癌患者組織和血清中高表達；高表達Circ_0001946的患者總生存時間及無進展生存時間均較低表達者明顯縮短；血清Circ_0001946作為診斷胰腺癌血清標志物的曲線下面積為0.805（95%CI:0.754～0.927）。Cox比例風險模型分析提示，Circ_0001946表達是胰腺癌患者預(yù)后的獨立影響因素。以上研究結(jié)果提示Circ_0001946在胰腺癌患者組織中高表達，與患者的預(yù)后相關(guān)，可能是潛在的胰腺癌患者預(yù)后標志物和治療靶點。