王平，楊文秀，周杰，馮江龍，林超群

0 引言

雙表達(dá)大B細(xì)胞淋巴瘤（double-expression large B-cell lymphoma,DEL）臨床上以MYC/BCL2雙表達(dá)最為常見，占彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）的19%～34%[1-2]，已有較多研究證實DEL患者臨床預(yù)后和治療效果相對較差，且易發(fā)展為復(fù)發(fā)/難治性大B細(xì)胞淋巴瘤[3-6]。染色體9p24.2上CD274基因編碼的PD-L1是程序性細(xì)胞死亡蛋白-1（programmed cell death 1,PD-1）的配體，其相互結(jié)合可以介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞獲得免疫逃逸能力[7-8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)MYC可以結(jié)合PD-L1的啟動子，促進其表達(dá)，從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展；具有協(xié)同作用的原癌基因MYC、BCL2可能是影響PD-L1蛋白表達(dá)的上游基因，三者在淋巴瘤的發(fā)病機制中發(fā)揮了重要作用[9-11]。本研究收集了一組大B細(xì)胞淋巴瘤病例，通過qPCR技術(shù)、免疫組織化學(xué)雙標(biāo)記和普通免疫組織化學(xué)染色法、臨床病理資料收集和隨訪，分析PD-L1表達(dá)與DEL的關(guān)系及其與患者預(yù)后的關(guān)系，并探討PD-L1表達(dá)在DEL臨床預(yù)后評估中的價值。

1 資料與方法

1.1 病例收集

收集貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科2010年1月1日至2017年12月31日期間確診的DLBCL病例，將臨床病理資料相對完整、腫瘤組織充足的90例病例納入實驗研究。

1.2 主要試劑

PD-L1單抗購于美國Abcam公司，單克隆一抗Pax5、MYC、BCL2和二抗試劑盒（PV-9001、SAP-9102）、EDTA修復(fù)液、AP-Red及DAB試劑盒均購自北京中杉公司；RNA提取試劑盒（FFPE RNA）購自廈門艾德公司；SYBR Green熒光染料（TaKaRa RR820A）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa RR47A）、內(nèi)參均購于美國TaKaRa公司；PD-L1引物購于上海生工公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色及分組

采用PV二步法檢測MYC、BCL2蛋白表達(dá):MYC、BCL2以扁桃體組織為陽性對照；以PBS（pH7.35）代替一抗作陰性對照；以pH（8.0）的EDTA溶液修復(fù)抗原；MYC、BCL2稀釋比均為1:200；步驟按PV-9001說明進行。

判讀標(biāo)準(zhǔn)：MYC陽性信號位于細(xì)胞核，BCL2陽性信號位于細(xì)胞質(zhì)。根據(jù)文獻[12-14]略作修改，隨機選擇10個不重復(fù)的400倍視野，每個視野隨機計數(shù)400個腫瘤細(xì)胞中陽性細(xì)胞所占比例，取10個視野的平均值作為該病例表達(dá)率。據(jù)文獻[1-4,12-14]定義MYC≥40%為高表達(dá)，BCL2≥70%為高表達(dá)。若MYC、BCL2均高表達(dá)定義為MYC/BCL2雙表達(dá)大B細(xì)胞淋巴瘤組（簡稱DEL組），余下歸為non-DEL組。

1.4 免疫組織化學(xué)雙標(biāo)記染色檢測PD-L1表達(dá)

根據(jù)試劑盒說明Pax5、PD-L1設(shè)置陽性對照為扁桃體組織，陰性對照以TBS（pH7.35）替代一抗，并以TBS作為緩沖液及沖洗液；用間接法進行雙標(biāo)記染色，染色步驟簡述如下：4 μm厚石蠟切片，脫蠟、水洗、EDTA（pH9.0）進行修復(fù)抗原，消除內(nèi)源性過氧化物酶后血清封閉，先進行Pax5鼠抗人單克隆抗體染色（1:300稀釋），按（SAP-9102）試劑盒說明進行Pax5標(biāo)記（AP-Red顯色），再次EDTA（pH8.0）修復(fù)后，按Pax5染色的相同步驟進行PD-L1兔抗人單克隆抗體（1:250稀釋）標(biāo)記，DAB顯色，透明封片后進行觀察和圖像分析。

判讀方法：Pax5以細(xì)胞核出現(xiàn)紅色或淺紅色顆粒為陽性表達(dá)；PD-L1以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜形成黃色或棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。參照文獻[15-16]分析：同MYC、BCL2一樣統(tǒng)計腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)率（10個高倍視野平均值），定義腫瘤細(xì)胞雙標(biāo)記陽性細(xì)胞≥30%（細(xì)胞質(zhì)或膜著黃色、核著紅色）為腫瘤細(xì)胞PD-L1陽性（PD-L1+）；在PD-L1陰性的病例中，若腫瘤微環(huán)境細(xì)胞（主要為腫瘤組織浸潤T細(xì)胞tumorinfiltrating lymphocytes,TILs）PD-L1表達(dá)率≥20%，定義為微環(huán)境PD-L1陽性[15]，即mPD-L1+。

1.5 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、qPCR方法

RNA的提取、檢測及反轉(zhuǎn)錄：取8 μm組織進行脫蠟、去除二甲苯、蛋白酶消化至清亮后，按RNA提取試劑盒說明進行RNA提取，最后以50 μl的DEPC水溶解RNA，核酸定量儀檢測RNA濃度及純度，取OD值（A260/A280）在1.8到2.0的RNA樣本進行實驗，按TaKaRa RR47A試劑說明于冰上進行去除基因組DNA（42℃ 2 min），于冰上配置反轉(zhuǎn)錄體系后進行反轉(zhuǎn)錄（37℃ 30 min，再加熱至85℃ 5 s），緩慢冷卻后于-80℃冰箱保存。

qPCR：使用兩步法檢測DEL組與non-DEL組PD-L1的mRNA，據(jù)TaKaRa RR820A試劑盒說明，取cDNA樣本于冰上配置SYBR Green RT-qPCR反應(yīng)體系，PD-L1引物：上游：5’-CTATGGTGGTGCCGACTACA-3’，下游：5’-TGCTTGTCCAGATGACTTCG-3’，每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，先配置總反應(yīng)體系，再分裝3個復(fù)孔；用β-actin（上游：5’-TAGTTGCGTTACA CCCTTTCTTG-3’，下游：5’-TCACCCTTCACCGTTCCAAGTTT-3’）作為內(nèi)參，于Bio-Rad CFX connect熒光定量PCR儀上進行反應(yīng)（反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 30 s，變性95℃ 5 s，退火/延伸為60℃ 30 s，50個循環(huán)），以 2-ΔΔCt值為mRNA相對表達(dá)量，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt樣本-ΔCt組內(nèi)最低值。

1.6 隨訪方法

采取電話或走訪方式，以首次確診時間為開始時間，隨訪患者首次確診以后的治療、健康、復(fù)發(fā)及生存等情況；每隔3月隨訪1次（出現(xiàn)死亡或失訪時結(jié)束該例患者隨訪），長期存活患者隨訪截至2018年12月31日。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)整理分析；mRNA相對表達(dá)量在各組間比較采用t檢驗，正態(tài)分布用（）表示，偏態(tài)分布數(shù)據(jù)經(jīng)（lg10）轉(zhuǎn)化為正態(tài)分布，并用（10lgx±10lgS）表示。計數(shù)資料統(tǒng)計采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier曲線表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

DLBCL90例，HE染色見圖1。男47例，女43例；年齡17～82歲（中位年齡58.5）；根據(jù)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果分組，28例為DEL，62例為non-DEL，見圖2。據(jù)1993年NHL國際預(yù)后指數(shù)IPI評分：0～2分49例，3～5分41例；臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期54例，Ⅲ+Ⅳ期36例。

2.2 DEL組與non-DEL組PD-L1蛋白表達(dá)情況比較

90例DLBCL腫瘤細(xì)胞和微環(huán)境中PD-L1陽性分別為22例（24.44%）和26例（28.89%），見圖3。DEL組腫瘤細(xì)胞和微環(huán)境中PD-L1陽性表達(dá)率分別為50.00%和32.14%，non-DEL組分別為12.90%和27.42%。腫瘤細(xì)胞和微環(huán)境PD-L1蛋白表達(dá)在DEL組與non-DEL組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

圖1 DLBCL的HE染色結(jié)果 (HE ×400)Figure 1 Hematoxylin-eosin staining results of diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) patients (HE ×400)

表1 DEL組與non-DEL組PD-L1蛋白表達(dá)的比較Table 1 Comparison of PD-L1 protein expression between DEL and non-DEL groups

2.3 DEL組與non-DEL組間PD-L1 mRNA相對表達(dá)量比較

qPCR檢測結(jié)果顯示DEL組（0.9862±0.49853）與non-DEL組（0.7175±0.29265）PD-L1 mRNA相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（95%CI:0.06325～0.47419,t=2.653,P=0.012）。

2.4 DEL組中PD-L1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

圖2 DLBCL免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 (PV ×400)Figure 2 Immunohistochemical results of DLBCL (PV ×400)

圖3 DLBCL中腫瘤細(xì)胞和微環(huán)境細(xì)胞PD-L1的表達(dá) (PV ×400)Figure 3 PD-L1 expression in tumor cells and microenvironment cells of DLBCL (PV ×400)

DEL組中，25例檢查血清乳酸脫氫酶（LDH）其中13例PD-L1+，8例mPD-L1+，4例mPD-L1-；24例檢查β2微球蛋白（β2-MG），其中14例PD-L1+，7例mPD-L1+，3例mPD-L1-，IPI評分0～2分組、3～5分組均為14例，Ⅰ+Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期分別為15例、13例；PD-L1+與性別、年齡、Ann Arbor分期、LDH、β2-MG無相關(guān)性，但與IPI評分和B癥狀的出現(xiàn)顯著相關(guān)（P值分別為0.007、0.021）；mPD-L1+與上述臨床病理特征均無相關(guān)性（均P＞0.05），見表2。

表2 DEL組腫瘤細(xì)胞和微環(huán)境中PD-L1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Table 2 Relation between PD-L1+,mPD-L1+ and clinicopathological characteristics of DEL patients

2.5 DEL患者預(yù)后及PD-L1蛋白表達(dá)生存分析

DEL組中，生存8例，死亡14例，失訪6例，其中復(fù)發(fā)9例；中位生存時間29月。20例接受R-CHOP治療，其余不詳；Kaplan-Meier生存分析顯示PD-L1+組患者總體生存時間（OS）明顯短于PD-L1-組（P=0.005），見圖4；mPD-L1+組患者OS明顯短于mPD-L1-組（P=0.001），見圖5。

3 討論

圖4 DEL組中PD-L1+與PD-L1-患者的生存曲線比較(P=0.005)Figure 4 Survival curves of DEL patients with PD-L1+ and PD-L1- (P=0.005)

圖5 DEL組中mPD-L1+與mPD-L1-患者的生存曲線比較(P=0.001)Figure 5 Survival curves of DEL patients with mPD-L1+and mPD-L1- (P=0.001)

盡管淋巴瘤的WHO分類還未將DEL單獨列出，但這類淋巴瘤和“雙打擊淋巴瘤”相類似，在臨床上具有獨特的臨床特點。多項研究[1-4,12-14]表明這類共表達(dá)淋巴瘤的IPI評分和腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)高，常有多個結(jié)外部位累及，患者在接受標(biāo)準(zhǔn)的R-CHOP免疫化療方案治療后復(fù)發(fā)率高，且5年生存率也較低。因此，發(fā)現(xiàn)這類DEL的理想預(yù)后評估因素和有效的治療靶點有著重要意義。

PD-L1表達(dá)與T淋巴細(xì)胞的凋亡及活化有關(guān)，其上調(diào)表達(dá)通過與浸潤T細(xì)胞表面受體PD1的結(jié)合誘導(dǎo)效應(yīng)T細(xì)胞凋亡、抑制T細(xì)胞活化，從而產(chǎn)生腫瘤生長的微環(huán)境，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[6-7]。PD-L1表達(dá)對大B細(xì)胞淋巴瘤影響的研究多集中在部位特點和細(xì)胞來源特點等方面。Kiyasu研究小組[15]統(tǒng)計1 235例臨床樣本，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞表達(dá)PD-L1在DLBCL中陽性率為11%，微環(huán)境細(xì)胞PD-L1陽性表達(dá)率為15.3%，PD-L1及mPD-L1的表達(dá)與GCB樣DLBCL和EB病毒陽性的大B細(xì)胞淋巴瘤病例顯著相關(guān)，且PD-L1+的患者總生存期（OS）低于PD-L1-的DLBCL患者。Liu等[16]檢測92例原發(fā)腸道的彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤樣本中PD-L1的表達(dá)，結(jié)果與Kiyasu研究小組的結(jié)果相似，但微環(huán)境中PD-L1的陽性率相對較高。本研究發(fā)現(xiàn)PD-L1、mPD-L1在90例大B細(xì)胞淋巴瘤中的陽性表達(dá)率分別為24.44%和28.89%，與Liu 等的研究報道相近。

有研究報道[17]DLBCL患者如果伴有PD-L1的DNA擴增、mRNA上調(diào)及蛋白高表達(dá)，其生存預(yù)后均不理想，且PD-L1蛋白表達(dá)并不完全由基因調(diào)控，可能還受腫瘤環(huán)境中的其他因素影響。Casey 團隊[9]發(fā)現(xiàn)MYC可以與PD-L1啟動子結(jié)合，直接調(diào)控PD-L1表達(dá)，沉默MYC后PD-L1蛋白表達(dá)明顯下降；Rossille研究結(jié)果[18]表明，在BCL2陽性侵襲性彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者中，血清PD-L1高表達(dá)水平患者的總體生存期（OS）明顯短于血清PD-L1低表達(dá)水平患者。本研究發(fā)現(xiàn)在MYC/BCL2共表達(dá)淋巴瘤中PD-L1、mPD-L1的陽性表達(dá)率明顯高于非共表達(dá)大B細(xì)胞淋巴瘤，且在該類淋巴瘤中PD-L1 mRNA相對表達(dá)量明顯上調(diào)。既往報道和我們的結(jié)果都提示PD-L1與MYC/BCL2蛋白表達(dá)可能存在某種關(guān)聯(lián)，它們之間可能存在一些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的“串話”。具體機制有待于進一步深入的分子、基因等方面研究探討。

本研究統(tǒng)計DEL患者臨床相關(guān)數(shù)據(jù)提示在DEL中PD-L1蛋白表達(dá)與高IPI評分和B癥狀的出現(xiàn)有關(guān)；此外，通過對28例DEL患者生存隨訪資料統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，DEL患者中PD-L1無論在腫瘤細(xì)胞表達(dá)還是在腫瘤微環(huán)境細(xì)胞中的表達(dá)，患者OS均顯著低于陰性組；這些結(jié)果都提示，PD-L1蛋白的上調(diào)表達(dá)與DEL患者不良預(yù)后相關(guān)。

作為一項回顧性的研究，本實驗存在一定的缺陷：首先因受到總樣本量收集的限制，納入研究樣本量相對較小，統(tǒng)計結(jié)果可能與大樣本的研究結(jié)果會存在一定誤差；其次，本實驗部分RNA提取使用的組織為年份較長的石蠟組織，可能提取RNA存在降解，對實驗也有一定的影響。因此，還需擴大樣本量、使用新鮮離體組織或提高各項檢測技術(shù)等來驗證我們的結(jié)果。

綜上所述，MYC/BCL2共表達(dá)大B細(xì)胞淋巴瘤中PD-L1蛋白和mRNA均上調(diào)表達(dá)，這可能與這類淋巴瘤不良預(yù)后有關(guān)，它在這類淋巴瘤預(yù)后評估中的價值還有待于進一步研究證實。