李璐，黃建鳴，馮梅，漆云翔，馬士淇，譚明宇，郎錦義

0 引言

同步放化療為局部晚期宮頸癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，然而中晚期宮頸癌5年生存率僅40%～50%[1-2]，宮頸癌放射抗性的分子機(jī)制鮮有報(bào)道。因此，研究導(dǎo)致放射抗性的分子機(jī)制可能為改善患者預(yù)后提供一個(gè)新的放射增敏策略。

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）的表達(dá)已被確定與腫瘤的生長、侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良密切相關(guān)。約80%的宮頸癌高表達(dá)EGFR，且與疾病進(jìn)展相關(guān)，但宮頸癌細(xì)胞EGFR的表達(dá)水平與預(yù)后及對放療反應(yīng)的相關(guān)性仍然有爭議或不確定的。細(xì)胞核EGFR首先在再生的肝細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，然后陸續(xù)在其他組織細(xì)胞核發(fā)現(xiàn)[3]。對于放射誘導(dǎo)的非配體依賴性EGFR核轉(zhuǎn)位通路已有初步研究但其具體機(jī)制尚未完全闡明[4]。我們前期對120例局部晚期宮頸癌同步放化療的臨床研究結(jié)果顯示，細(xì)胞核pEGFR-T654高表達(dá)是宮頸癌一個(gè)獨(dú)立的不良預(yù)后因素[5]。因此，本研究旨在探討放射對宮頸癌細(xì)胞EGFR核轉(zhuǎn)位的影響，以及阻斷放射誘導(dǎo)的EGFR核轉(zhuǎn)位是否會增加宮頸癌細(xì)胞的放射敏感度。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及培養(yǎng)

人宮頸鱗癌CaSki和人宮頸腺癌HeLa細(xì)胞株均購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。采用10%新生牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2及飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，2～3天傳代一次。

1.2 藥物與試劑

根據(jù)EGFR上的核定位序列（EGFR-NLS）設(shè)計(jì)相似性磷酸化 pEGFR-T654多肽［Ac-RKRT(PO3H2)LRRLK］和對照多肽（KKALRRQEAVNAL）（上海楚肽生物科技有限公司），純度＞98%；西妥昔單抗（Cetuximab,C225）由德國Merck KGaA公司提供；吉非替尼（Gefitinib）購于武漢貝爾卡生物醫(yī)藥有限公司；一抗和二抗分別購于美國Abcam公司和北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司（ZSGB-BIO）。

1.3 藥物預(yù)處理及放射

取指數(shù)生長期細(xì)胞，接種培養(yǎng)24 h后，分別加入pEGFR-T654多肽、pEGFR-T654對照多肽、西妥昔單抗65 nmol/L和吉非替尼2 μmol/L作用16 h，參考EGFR核轉(zhuǎn)位相關(guān)研究，本研究施予4 Gy X線照射（美國Novalis Tx 6MV直線加速器，劑量率為320 cGy/min），于放射前后10、20、40 min采用上海生工核蛋白提取試劑盒（BSP001）提取細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白，用考馬斯亮藍(lán)法（Bradford）試劑盒（Mbchem）測定蛋白含量。

1.4 免疫印跡法測定蛋白表達(dá)

按照待測蛋白分子量配制適當(dāng)?shù)姆蛛x濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），半干轉(zhuǎn)膜或濕轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉T-BST于 37℃封閉6 h，分別加入1:20 000兔抗人GAPDH單克隆抗體，1:20 000兔抗人Lamin B1單克隆抗體，1:5 000小鼠抗人EGFR單克隆抗體（貨號ab52894，批次GR41670-23），1:100小鼠抗人pEGFR-T654單克隆抗體（貨號BS4062，批次CA36131），1:2 500兔抗人DNA-PK單克隆抗體（貨號ab32566，批次GR190339-3），1:1 000兔抗人pDNA-PK-T2609單克隆抗體（貨號ab97611，批次GR61403-8），4℃孵育過夜。用T-BST洗滌3次，每次10 min，加入1:5 000辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/抗小鼠二抗，于37℃孵育1 h，再次使用T-BST洗滌3次，每次10 min。將高敏感度化學(xué)發(fā)光檢測試液（康為世紀(jì)生物科技有限公司）均勻涂抹在濾膜上，暗室反應(yīng)10 min，置ImageQuant LAS 500成像儀（美國GE公司）采集圖像并測定蛋白條帶灰度值。Western blot實(shí)驗(yàn)中選取Lamin B1作為細(xì)胞核內(nèi)蛋白表達(dá)的參照進(jìn)行分析，細(xì)胞質(zhì)采用GAPDH作為蛋白表達(dá)的參照進(jìn)行分析。

1.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期CaSki和HeLa細(xì)胞制成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，按不同放射劑量分別接種不同數(shù)量的細(xì)胞于60 mm培養(yǎng)皿中，0 Gy（200個(gè)）、0.5 Gy（200個(gè)）、1 Gy（400個(gè)）、2 Gy（1 000個(gè)）、4 Gy（4 000個(gè)）、6 Gy（10 000個(gè)）、8 Gy（20 000個(gè)），于37℃、5%CO2及飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)24 h，分別加入吉非替尼2 μmol/L，西妥昔單抗65 nmol/L作用16 h后，按照不同劑量進(jìn)行單次放射，每個(gè)照射劑量點(diǎn)設(shè)三個(gè)平皿。繼續(xù)培養(yǎng)12天后，去除培養(yǎng)基，加入0.5%結(jié)晶紫-30%甲醇固定染色30 min，低倍鏡下計(jì)數(shù)≥50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。計(jì)算克隆形成率及存活分?jǐn)?shù)，采用GraphPad Prism5.0軟件計(jì)算各組細(xì)胞存活率，以單擊多靶數(shù)學(xué)模型擬合劑量-存活曲線，求出放射生物學(xué)參數(shù)D0、Dq、N、SF2和SER值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（），組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 放射可上調(diào)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)EGFR的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，4 Gy放射后，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)EGFR的表達(dá)均呈時(shí)間依賴性增加；CaSki和HeLa細(xì)胞放射后40 min，與放射前比較細(xì)胞核內(nèi)EGFR相對表達(dá)分別上調(diào)了2.9倍（P=0.011）和4.6倍（P=0.000），細(xì)胞質(zhì)內(nèi)EGFR相對表達(dá)分別上調(diào)了2.3倍（P=0.024）和3.5倍（P=0.000），見圖1，提示放射可誘導(dǎo)CaSki和HeLa細(xì)胞核內(nèi)EGFR表達(dá)增加。

2.2 放射可上調(diào)細(xì)胞核內(nèi)pEGFR-T654和pDNAPK-T2609的表達(dá)

DNA-PK、pEGFR-T654和pDNA-PK-T2609均定位于細(xì)胞核，放射前后細(xì)胞質(zhì)中無表達(dá)。CaSki細(xì)胞放射后40 min，與放射前比較細(xì)胞核內(nèi)DNA-PK、pEGFR-T654和pDNA-PK-T2609相對表達(dá)量分別上調(diào)了3倍（P=0.002）、4.9倍（P=0.000）和3.8倍（P=0.001）。HeLa細(xì)胞放射后40 min，與放射前比較細(xì)胞核內(nèi)DNA-PK、pEGFR-T654和pDNA-PK-T2609相對表達(dá)分別上調(diào)了3.3倍（P=0.01）、4.8倍（P=0.000）、3.1倍（P=0.006），見圖2。

2.3 pEGFR-T654多肽對pEGFR-T654和pDNAPK-T2609表達(dá)的影響

為了證實(shí)阻斷pEGFR-T654及其核轉(zhuǎn)位是否降低pDNA-PK-T2609的表達(dá)，我們測定了CaSki和HeLa細(xì)胞經(jīng)pEGFR-T654多肽預(yù)處理后，細(xì)胞核內(nèi)DNA-PK、pEGFR-T654和pDNA-PK-T2609的表達(dá)水平。與對照多肽比較，pEGFR-T654多肽呈時(shí)間依賴性地顯著降低了CaSki細(xì)胞和HeLa細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)DNA-PK、pEGFR-T654和pDNA-PK-T2609的表達(dá)，見圖3。

2.4 西妥昔單抗和吉非替尼聯(lián)合放射對pEGFRT654和pDNA-PK-T2609表達(dá)的影響

西妥昔單抗和吉非替尼聯(lián)合放射均降低了CaSki細(xì)胞核中pEGFR-T654表達(dá)，提示西妥昔單抗和吉非替尼可能有阻斷宮頸鱗癌照射后EGFR654位點(diǎn)磷酸化及其核轉(zhuǎn)位的作用。同時(shí)觀察到西妥昔單抗聯(lián)合放射后細(xì)胞核pDNAPK-T2609表達(dá)水平下調(diào)，但在吉非替尼預(yù)處理組中無類似現(xiàn)象。在HeLa細(xì)胞中采用西妥昔單抗和吉非替尼聯(lián)合放射預(yù)處理后，細(xì)胞核中DNAPK、pDNA-PK-T2609和pEGFR-T654變化均不明顯，見圖4。

2.5 CaSki和HeLa細(xì)胞克隆形成分析

圖1 CaSki和HeLa細(xì)胞照射后不同時(shí)間細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核EGFR表達(dá)變化Figure 1 Relative expression of cEGFR and nEGFR in CaSki and HeLa cell lines at different time after radiation

圖2 4Gy照射后不同時(shí)間CaSki和HeLa細(xì)胞核中pEGFR-T654、DNAPK和pDNA-PK-T2609表達(dá)變化Figure 2 Relative expression of pEGFR-T654,DNA-PK and pDNAPK-T2609 in CaSki and HeLa cell lines at different time after 4 Gy radiation

圖3 多肽和對照多肽不同時(shí)間預(yù)處理后CaSki和HeLa細(xì)胞核中pEGFR-T654、DNA-PK和pDNA-PK-T2609表達(dá)變化Figure 3 Relative expression of pEGFR-T654,DNA-PK and pDNA-PK-T2609 in CaSki and HeLa cell lines with or without Thr654 inhibitory peptide

表1 不同處理組CaSki和HeLa細(xì)胞生物學(xué)參數(shù)比較Table 1 Biological parameters of CaSki and HeLa cells in different treatment groups

CaSki和HeLa細(xì)胞放射生物學(xué)參數(shù)見表1。單因素方差分析結(jié)果顯示，CaSki細(xì)胞中西妥昔單抗聯(lián)合放射組與單純放射組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PD0=0.001,PDq=0.002），吉非替尼聯(lián)合放射組與單純放射組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PD0=0.131,PDq=0.183），CaSki細(xì)胞用西妥昔單抗預(yù)處理后放射敏感度明顯增加（SF2=31.03;SER=2.34）。但HeLa細(xì)胞用西妥昔單抗（PD0=0.714,PDq=0.0481）和吉非替尼（PD0=0.826,PDq=0.279）預(yù)處理后放射敏感度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖5。

3 討論

EGFR屬于ErbB家族中的一員，也被稱作HER-1或ErbB-1。EGFR是一種跨膜糖蛋白，包括胞外配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，傳統(tǒng)的受體學(xué)說認(rèn)為EGFR是一種膜受體[6-7]，通過激活生存和增殖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對輻射的耐受性[8]，而有研究揭示EGFR的另一種放射抵抗機(jī)制：放射誘導(dǎo)EGFR轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核，與DNA損傷非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)途徑的關(guān)鍵蛋白DNA-PK相互作用，進(jìn)而促進(jìn)DNA損傷修復(fù)[9-10]。

圖5 單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活-曲線Figure 5 Dose-survival curves of CaSki and HeLa cells fitted by a single-hit multi-target model

本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌CaSki和HeLa細(xì)胞在放射前細(xì)胞核內(nèi)存在內(nèi)源性EGFR，我們分析在細(xì)胞正常培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)基中含有多種激素類因子，其中包括EGF，除了電離輻射，EGF配體[11]、高熱、缺氧、H2O2、順鉑等應(yīng)激條件均可激活EGFR核轉(zhuǎn)位[12]，導(dǎo)致在無輻射條件下細(xì)胞核內(nèi)存在EGFR，具體原因需進(jìn)一步研究。放射后EGFR表達(dá)量增多，我們推測放射可能誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞EGFR核轉(zhuǎn)位。有文獻(xiàn)觀察到放射后肺癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、口腔癌、胰腺癌、腦膠質(zhì)瘤中EGFR核轉(zhuǎn)位的現(xiàn)象[9]。細(xì)胞核EGFR、pEGFR-T654表達(dá)量顯著升高，伴隨放射后細(xì)胞核內(nèi)DNA-PK和pDNA-PK-T2609表達(dá)量相應(yīng)增加，二者具有顯著的相關(guān)性；而使用pEGFR-T654多肽后，CaSki和HeLa細(xì)胞pEGFR-T654和pDNA-PK-T2609的表達(dá)呈時(shí)間依賴性顯著降低。在我們的前期研究中也觀察到類似的現(xiàn)象[13]。對于放射誘導(dǎo)的非配體依賴性EGFR核轉(zhuǎn)位通路已有初步研究但其具體機(jī)制尚未完全闡明[4]：活化的EGFR與小窩蛋白形成EGFR/內(nèi)陷小窩復(fù)合體，通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的受體被循環(huán)利用再表達(dá)于細(xì)胞表面[14]；也可以被分選進(jìn)入內(nèi)涵體，內(nèi)涵體逆行進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)相關(guān)降解體系EGFR脫離內(nèi)涵體囊泡膜結(jié)構(gòu)，以游離形式再釋放入胞漿；也可以通過細(xì)胞內(nèi)小泡作為轉(zhuǎn)運(yùn)載體，逃避溶酶體的降解，在核膜周圍聚集[15]。核周EGFR通過核定位信號區(qū)（nuclear localization signal,NLS）與核胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白α或β形成核孔復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核[16]。NLS是一段臨近跨膜區(qū)的多元序列，含有3到5個(gè)基本殘基，這些殘基是核轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)與核胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相結(jié)合所必需的，目前認(rèn)為EGFR家族成員皆具備這樣一段保守序列。有學(xué)者通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用圖譜揭示nEGFRNLS是晚期癌癥進(jìn)化過程中EGFR癌變的動態(tài)誘導(dǎo)因子[17]。放射促發(fā)EGFR內(nèi)陷進(jìn)入到核周，隨后EGFR通過NLS核胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核，這只是短暫的核聚集，因?yàn)楹税|(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含了一個(gè)核輸出序列（nuclear export sequence,NES）使細(xì)胞核中的EGFR重新返回細(xì)胞質(zhì)。放射誘發(fā)的核蛋白激酶Cε（protein kinase C,PKC-ε）活化促發(fā)核周EGFR-T654位點(diǎn)的磷酸化，顯著改變EGFR剩余殘基的功能以及與核胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的相互作用，使轉(zhuǎn)運(yùn)過程分離，最終解釋了核轉(zhuǎn)位的機(jī)制[18]。Dittmann等[16]多項(xiàng)研究揭示放射可誘導(dǎo)PKC-ε活化，進(jìn)一步促進(jìn)EGFR在654位點(diǎn)磷酸化，有利于EGFR與核膜上的NLS序列結(jié)合介導(dǎo)核轉(zhuǎn)位，EGFR在細(xì)胞核內(nèi)聚集，激活pDNA-PK-T2609位點(diǎn)磷酸化，導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞放射抵抗。

除此之外，Jette等[19]在放射過程中觀察到EGFR和DNA-PK在細(xì)胞核內(nèi)形成復(fù)合物，復(fù)合物增強(qiáng)了DNA-PK活性和DNA的損傷修復(fù)能力。Yu等[20]提出了核EGFR/DNAPK復(fù)合物介導(dǎo)c-myc mRNA升高的機(jī)制，導(dǎo)致細(xì)胞存活和抗輻射性。Muthusami等[21]報(bào)道了核EGFR和FTS（fused toes homolog）之間的物理聯(lián)系，F(xiàn)TS是一種致癌基因，與宮頸癌細(xì)胞的抗輻射性有關(guān)[22]。因此可以初步認(rèn)為，放射誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞EGFR核轉(zhuǎn)位與細(xì)胞核內(nèi)DNA-PK存在密切關(guān)系，細(xì)胞核內(nèi)EGFR-T654位點(diǎn)磷酸化激活DNA-PK-T2609位點(diǎn)磷酸化，促進(jìn)非同源末端連接修復(fù)，是造成宮頸癌放射抵抗的原因之一。因此，阻斷EGFR核轉(zhuǎn)位將是降低由DNA-PK磷酸化介導(dǎo)的宮頸癌放射抵抗的重要靶點(diǎn)。

宮頸癌分子靶向藥物的臨床試驗(yàn)較少[23]，且無更多進(jìn)展，因此針對核內(nèi)EGFR分子靶向治療具有重要的實(shí)際意義。另外一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，EGFR靶向藥物尼妥珠單抗聯(lián)合放射促使γ-H2AX蛋白表達(dá)升高，增加射線誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂；聯(lián)合尼妥珠單抗使細(xì)胞核內(nèi)EGFR及DNA-PK表達(dá)量下降，從而阻止DNA雙鏈的修復(fù)，提高放射敏感度[24-25]。本研究結(jié)果顯示，西妥昔單抗可減少放射誘導(dǎo)的宮頸癌CaSki細(xì)胞EGFRT654核轉(zhuǎn)位，表現(xiàn)為西妥昔單抗聯(lián)合放射組較單純放射組EGFR-T654表達(dá)量降低，pDNA-PK-T2609的表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)降低，放射敏感度增加。在放射誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)位類似的研究中發(fā)現(xiàn)，西妥昔單抗與EGFR受體結(jié)合內(nèi)陷，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與小窩蛋白結(jié)合形成西妥昔單抗-小窩蛋白復(fù)合體，阻止EGFR轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核[18]，或者與DNA-PK在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成復(fù)合體從而阻斷EGFR轉(zhuǎn)運(yùn)入核，進(jìn)一步降低細(xì)胞核內(nèi)DNA-PK活性，抑制DNA損傷修復(fù)[26-27]。我們初步推測，西妥昔單抗能通過減少放射誘導(dǎo)EGFR-T654核轉(zhuǎn)位來增加放射敏感度。而目前在靶向藥物治療方面，針對核EGFR的研究尚處于基礎(chǔ)階段，有待更多的臨床試驗(yàn)。

吉非替尼是針對EGFR蛋白酪氨酸激酶的小分子抑制劑，我們進(jìn)一步探索其在宮頸癌EGFR核轉(zhuǎn)位中的作用，吉非替尼有阻斷宮頸鱗癌照射后EGFR-T654位點(diǎn)磷酸化及其核轉(zhuǎn)位的作用，但與DNA-PK無相關(guān)性。EGFR在細(xì)胞核內(nèi)除了與DNAPK相互作用，還包括作為一種新型轉(zhuǎn)錄因子與細(xì)胞周期或細(xì)胞增殖密切相關(guān)的靶基因相互作用，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[28-29]；或者直接通過磷酸化激活PCNA[30-31]，促進(jìn)DNA合成，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖。我們觀察到吉非替尼可降低CaSki和HeLa細(xì)胞存活率，在一定程度上抑制腫瘤生長，但放射后吉非替尼未顯著降低細(xì)胞核內(nèi)DNA-PK、pDNAPK-T2609表達(dá)水平。吉非替尼主要通過競爭性抑制ATP與EGFR受體酪氨酸激酶部分結(jié)合，從而抑制EGFR自身磷酸化，阻斷下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。電離輻射可激活PI3K-AKT[32]、Ras-MAPK等[33]信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這兩條通路的激活被認(rèn)為是EGFR過表達(dá)腫瘤放射抵抗的主要原因[34]。吉非替尼可能通過其他信號通路調(diào)控細(xì)胞周期和增殖，增加放射敏感度[35]，而在EGFR核轉(zhuǎn)位介導(dǎo)DNA損傷修復(fù)途徑中作用甚微。

綜上所述，EGFR-T654是放射誘導(dǎo)EGFR核轉(zhuǎn)位的關(guān)鍵作用點(diǎn)，EGFR-T654入核后激活pDNAPK-T2609，在介導(dǎo)放射抵抗中發(fā)揮著重要作用。西妥昔單抗能減少放射誘導(dǎo)EGFR-T654核轉(zhuǎn)位及DNA非同源末端連接修復(fù)的關(guān)鍵激酶pDNAPK-T2609，增加放射敏感度，但放射聯(lián)合西妥昔單抗能否成為宮頸癌治療的新模式、EGFR-T654能否作為西妥昔單抗使用的分子檢測靶點(diǎn)，尚需進(jìn)一步的臨床研究。