朱亞玲 ，易峰濤,，丁夢南，曾程，徐振華，邵志雄，謝俊杰

0 引言

在過去20年里，局部腫瘤的凍融治療已經(jīng)有了長足的發(fā)展，主要集中在肝癌[1]、轉(zhuǎn)移性癌[2]、腎癌[3]、前列腺癌[4]等實(shí)體瘤治療中。同時(shí)，越來越多的報(bào)道表明，凍融治療可以破壞腫瘤，增強(qiáng)或誘導(dǎo)細(xì)胞免疫或抗腫瘤免疫應(yīng)答[5-7]。此外，腫瘤細(xì)胞的破壞和溶解可能成為炎性反應(yīng)的重要介質(zhì)[8]。

庫普弗細(xì)胞（Kupffer cells,KCs）是數(shù)量最大的免疫細(xì)胞，占肝臟巨噬細(xì)胞的80%～90%，也是單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的重要組成部分，在肝臟巨噬細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[9]。KCs的激活與多種細(xì)胞因子的分泌密切相關(guān)，這些細(xì)胞因子參與免疫和促炎或抗炎反應(yīng)[10]。KCs自身還具有分泌炎性因子的功能，參與肝臟中各種重要的生理和病理過程，如炎性反應(yīng)、脂質(zhì)代謝、移植免疫等[11]。

因此，有必要研究凍融后KCs分泌功能的特征，幫助我們治療肝癌，促進(jìn)患者的早期康復(fù)，為肝癌凍融治療能提高自身免疫功能的學(xué)說提供理論依據(jù)。為此，本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，從兔肝中提取KCs并進(jìn)行了體外培養(yǎng)，應(yīng)用NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（PDTC）阻斷NFκB信號(hào)通路后，觀察KCs的分泌功能變化，探索凍融治療引起KCs功能變化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

NF-κB抑制劑PDTC購自美國BioVision公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；低糖DMEM完全培養(yǎng)基購自美國ATCC公司；0.4%錐蟲藍(lán)溶液購自美國Sigma公司；GAPDH購自英國Abcam公司；蛋白Marker（10～170 kDa）購自立陶宛Fermentas公司；0.45 μm PVDF膜購自美國Millipore公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、PMSF（100 mmol/L）、磷酸化蛋白酶抑制劑、5×蛋白上樣緩沖液、10×麗春紅染液和抗體洗脫液均購自武漢拓捷生物公司；Tris和甘氨酸購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（上海）；動(dòng)物麻醉劑（速眠新Ⅱ）購自中國動(dòng)物保健品有限公司（北京），其他試劑由中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科提供。

1.2 方法

1.2.1 KCs細(xì)胞懸液的制備 經(jīng)肌肉注射速眠新Ⅱ（0.2 ml/kg）麻醉后，對(duì)其進(jìn)行消毒、開腹、門靜脈暴露和固定插管并打開胸腔。根據(jù)Zeng等[12]制備KCs細(xì)胞懸液的方法，對(duì)下腔靜脈結(jié)扎后，快速切割、斷裂部分肝臟，用PBS沖洗兩次。取肝懸液離心，取上清液。充分懸浮后，將上述肝細(xì)胞懸液移入含30%和60%細(xì)胞分離液的離心管中，以800g（20℃）緩升緩降離心20 min，離心后可見乳白色細(xì)胞層。收集細(xì)胞層，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 構(gòu)建低溫和凍融壞死的腫瘤細(xì)胞攻擊KCs的細(xì)胞模型 模擬凍融治療時(shí)體內(nèi)KCs受到的主要攻擊因素是低溫和凍融壞死物質(zhì)，構(gòu)建體外細(xì)胞模型。將濃度為1×106/ml的KCs懸浮液用5 ml一次性塑料吸管分為不同的培養(yǎng)瓶，每瓶加入5 ml。實(shí)驗(yàn)分為8組，每組9瓶：（1）對(duì)照組：KCs正常培養(yǎng)37℃；（2）0℃組：模擬凍融治療時(shí)冰球邊緣溫度，將培養(yǎng)瓶置于0℃環(huán)境中20 min，取出放回37℃孵化器。5 min后，將培養(yǎng)瓶置于0℃環(huán)境中20 min，再放入37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)6 h后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；（3）5℃低溫組和10℃低溫組：模擬凍融治療時(shí)冰球邊緣距離0.5 cm和2 cm的溫度。實(shí)驗(yàn)方法與0℃組相同，但放置培養(yǎng)瓶的溫度環(huán)境不同。5℃組在5℃環(huán)境中放置2次20 min，10℃組在10℃環(huán)境中放置2次20 min；（4）凍融壞死物質(zhì)組：凍融治療后第3天將治療中心腫瘤組織（人肝癌HepG2細(xì)胞購于中國科學(xué)院上?？茖W(xué)院資源中心，于中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科內(nèi)進(jìn)行傳代培養(yǎng)）制成1%細(xì)胞懸液，在KCs培養(yǎng)瓶中加入2 ml，其余培養(yǎng)條件與對(duì)照組相同；（5）聯(lián)合刺激組：按不同溫度（0℃、5℃、10℃）放置的KCs培養(yǎng)瓶分為3組。各組再加入凍融腫瘤壞死細(xì)胞懸液，其濃度與凍融壞死物質(zhì)組相同，實(shí)驗(yàn)方法分為0℃、5℃和10℃組。

1.2.3 干預(yù)措施 以上8組各設(shè)1個(gè)平行組。將PDTC加入培養(yǎng)基中，NF-κB抑制劑最終濃度為100 μmol/L。

1.2.4 KCs分泌功能的檢測 參考文獻(xiàn)中的方法[13]，采用ELISA法檢測KCs上清液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1β）和干擾素-γ（INF-γ）的濃度。各組采用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中的IFN-γ、IL-1β、TNF-α的濃度。

1.2.5 NF-κB蛋白測定 各組培養(yǎng)6 h后，用Western blot法檢測各組NF-κB蛋白的表達(dá)，用定量軟件處理系統(tǒng)分析靶帶的吸光度值。Western blot檢測方法如文獻(xiàn)所述[14]。用鼠抗NF-κB抗體（sc-109，Santa Cruz生物技術(shù)，美國圣克魯斯州）進(jìn)行印跡檢測，計(jì)算靶帶的吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn)及方差分析；計(jì)量資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；組間比較采用單因素方差分析；組內(nèi)比較采用Friedman檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KCs分泌功能測試

（1）無抑制劑組與對(duì)照組比較：低溫組（0℃、5℃、10℃）和10℃凍融壞死物質(zhì)組培養(yǎng)1 h時(shí)KCs細(xì)胞分泌炎性因子水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），凍融壞死物質(zhì)組與聯(lián)合刺激組比較KCs細(xì)胞分泌炎性因子水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），10℃凍融壞死物質(zhì)組與對(duì)照組比較KCs細(xì)胞分泌炎性因子水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組培養(yǎng)1 h，與對(duì)照組比較（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（2）無抑制劑組KCs細(xì)胞分泌炎性因子水平與培養(yǎng)時(shí)間的相關(guān)性：隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長（1、2、3 h），炎性因子的分泌水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.750,P=0.005）。（3）抑制劑組與對(duì)照組比較：各組KCs細(xì)胞分泌炎性因子水平比較（P＞0.05），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；組內(nèi)KCs細(xì)胞分泌炎性因子水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.25,P=0.325）。（4）有抑制劑組和無抑制劑組KCs細(xì)胞分泌炎性因子水平比較，兩組在相同條件下（對(duì)照組除外）均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

KCs分泌功能結(jié)果顯示，用低溫或凍融壞死物或聯(lián)合刺激KCs后培養(yǎng)1 h，炎性因子的分泌增加（P＜0.01），低溫和凍融壞死產(chǎn)物組的聯(lián)合刺激具有疊加作用。此外，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長（1、3、6 h），炎性因子的分泌水平顯著升高（χ2=10.750,P=0.005），有級(jí)聯(lián)放大的趨勢。在PDTC存在下，8組間炎性因子的分泌水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.325）。延遲培養(yǎng)時(shí)間，各組KCs細(xì)胞分泌炎性因子水平無變化，見表1～2。

2.2 NF-κB蛋白表達(dá)

低溫刺激對(duì)NF-κB蛋白的表達(dá)無顯著影響，而對(duì)照組與低溫組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。聯(lián)合刺激組和凍融壞死物質(zhì)組NF-κB蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而抑制劑組NF-κB蛋白的表達(dá)無明顯變化，其線型幾乎呈直線狀，見圖1～3。

3 討論

KCs憑其吞噬和分泌功能，參與了肝臟多種重要的生理和病理過程，如清除壞死細(xì)胞和組織碎片，誘導(dǎo)炎性反應(yīng)、參與脂質(zhì)代謝、移植免疫等[15-17]。KCs功能受內(nèi)毒素、脂多糖、壞死組織或細(xì)胞、應(yīng)激等多種因素的影響[10]?；罨腒Cs能產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，包括TNF-α、IL-1β和INF-γ等，對(duì)靶細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用，從而發(fā)揮其生物學(xué)作用[18]。凍融治療主要利用溫度急劇變化，破壞腫瘤細(xì)胞，同時(shí)對(duì)治療區(qū)周圍組織產(chǎn)生低溫刺激，誘發(fā)機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)。而應(yīng)激和壞死腫瘤細(xì)胞釋放的如水解蛋白酶等細(xì)胞有害物均可引起KCs的變化[19]。

表1 無抑制劑組的KCs分泌功能測試結(jié)果Table 1 Test results of secretion function of Kupffer cells (KCs) without inhibitor

表2 有抑制劑組的KCs分泌功能測試結(jié)果Table 2 Test results of secretion function of KCs with inhibitor

圖1 無抑制劑時(shí)NF-κB蛋白的表達(dá)Figure 1 Expression of NF-κB protein in group without inhibitor

圖2 有抑制劑時(shí)對(duì)NF-κB蛋白表達(dá)的影響Figure 2 Effect of inhibitor on expression of NF-κB protein

圖3 NF-κB蛋白的表達(dá)Figure 3 Expression of NF-κB protein

KCs受到低溫或凍融壞死物質(zhì)刺激后，可促進(jìn)炎性因子的分泌，如TNF-α、IL-1β和INF-γ，這些炎性因子可誘導(dǎo)炎性細(xì)胞聚集、介導(dǎo)炎性反應(yīng)和清除壞死細(xì)胞或組織碎片[20]，這一反應(yīng)過程可能是凍融治療后殘存腫瘤的一個(gè)殺傷機(jī)制。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)瓶中加入NF-κB抑制劑后，低溫組、凍融壞死物質(zhì)組和聯(lián)合刺激組的炎性細(xì)胞因子水平均無變化，說明用NF-κB抑制劑可以抑制炎性因子的分泌過程。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1β和INF-γ的濃度與KCs上清液中NF-κB蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，所以凍融治療后KCs的分泌功能可能通過NF-κB信號(hào)通路調(diào)控。

NF-κB是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，調(diào)控大量參與細(xì)胞存活、炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)等重要生理過程的基因。最近有研究表明，NF-κB的組成型表達(dá)與多種類型的癌癥有關(guān)[21]。NF-κB信號(hào)通路也是炎性反應(yīng)相關(guān)的癌癥發(fā)生的重要因素[22]。本研究通過對(duì)NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的檢測，探討了KCs誘導(dǎo)炎性反應(yīng)的機(jī)制。NF-κB是細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，是細(xì)胞免疫和炎性反應(yīng)的重要組成部分[23]，它參與多種基因的表達(dá)和調(diào)控[24]。關(guān)于KCs活化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，認(rèn)為NF-κB是調(diào)節(jié)KCs活化的關(guān)鍵因素[25]，NF-κB在某些細(xì)胞信息轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著關(guān)鍵作用[26]，它是細(xì)胞活化的標(biāo)志，也是激活炎性反應(yīng)的重要因素[27]。有研究證實(shí)，NF-κB信號(hào)通路是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)[28]。如果這一信號(hào)通路在凍融治療引起的免疫功能變化中發(fā)揮類似作用，將有助于探討凍融治療后免疫功能變化的機(jī)制。其最直接的判斷方法即阻斷NF-κB信號(hào)通路。吡咯烷二硫代氨基甲酸酯在NF-κB活化通道的不同水平發(fā)揮抑制NF-κB蛋白表達(dá)的作用，從而阻斷NF-κB信號(hào)通路，阻斷是否成功可以通過檢測NF-κB信號(hào)通路中的通路終末蛋白NF-κB蛋白的表達(dá)情況判斷。

在KCs培養(yǎng)瓶中加入凍融壞死物質(zhì)，其中含有細(xì)胞毒素等刺激信號(hào)，這些信號(hào)可與KCs膜表面受體結(jié)合，如與清道夫受體（scavenger receptor,SR）結(jié)合，被吞噬到KCs內(nèi)；再經(jīng)過多級(jí)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使NF-κB的抑制蛋白（IKB）的上游激酶IKB激酶（IKB kinse,IKK）磷酸化而激活，IKK使IKB降解。P50有核定位信號(hào)，當(dāng)失去了IKB的束縛后，P50會(huì)攜載RelA（P65）向核內(nèi)遷移，P65與細(xì)胞核內(nèi)基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子區(qū)域上的順勢反應(yīng)元件結(jié)合，從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)NF-κB mRNA的產(chǎn)生，最后轉(zhuǎn)錄、產(chǎn)生和釋放各種細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-1β等）[29]。本研究檢測結(jié)果提示加入凍融壞死物質(zhì)后，NF-κB蛋白表達(dá)上調(diào)，炎性因子分泌增加，說明NF-κB信號(hào)通路的存在；而加入PDTC后，PDTC作為一種抗氧化劑，可以在NF-κB活化通道的不同水平發(fā)揮抑制NF-κB蛋白表達(dá)的作用，如阻止上游IKK磷酸化，從而阻止NF-κB信號(hào)通路，抑制NF-κB蛋白表達(dá)，導(dǎo)致炎性因子分泌減少。反向證明凍融治療后KCs的變化可能通過NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮作用。

綜上所述，凍融治療可以改變KCs周圍的微環(huán)境，刺激KCs分泌細(xì)胞因子的功能，從而誘導(dǎo)炎性反應(yīng)，清除腫瘤細(xì)胞。另外還證實(shí)KCs分泌功能變化可能是通過NF-κB信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的。