才忠民，王 歡，尚 平，王 琦，李劼若

1)廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院脊柱外科 廣州 510800 2)暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)中心 廣州 510630

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一種可定向分化為神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的多能干細(xì)胞，因具有取材方便、增殖能力強(qiáng)和免疫排斥反應(yīng)弱等特點(diǎn)，成為骨折愈合和骨再生等骨組織工程的理想種子細(xì)胞[1]，而如何使BMSCs快速向成骨細(xì)胞定向分化一直是骨損傷修復(fù)研究的熱點(diǎn)。前列腺素E2是一種由機(jī)體產(chǎn)生且分布廣泛的非肽類小分子物質(zhì)，除作為炎性介質(zhì)外，在促進(jìn)骨形成方面也發(fā)揮著重要作用[2-4]。絲裂原活化蛋白激酶是一類參與細(xì)胞分化的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases，p38MAPK)是該家族中與成骨分化關(guān)系密切的重要成員[5-6]。已有研究[7]發(fā)現(xiàn)，前列腺素E2可誘導(dǎo)BMSCs成骨分化，并推測(cè)p38MAPK信號(hào)通路可能在其中發(fā)揮重要作用。本研究以前列腺素E2和p38MAPK阻斷劑SB203580處理大鼠BMSCs，檢測(cè)細(xì)胞中堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase，ALP)、Runx2、骨橋蛋白(osteopontin,OPN)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)和核心結(jié)合因子α1(core binding factorα1,Cbfα1)mRNA的表達(dá)，探討p38MAPK信號(hào)通路是否參與了前列腺素E2誘導(dǎo)的BMSCs成骨分化。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器前列腺素E2高純度粉末購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，L-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，SB203580和Trizol試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，Triton X-100購(gòu)于北京索萊寶公司，p38MAPK、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)、β-actin抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher公司，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，RIPA蛋白裂解液、ALP檢測(cè)試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)研究所，CO2培養(yǎng)箱和酶標(biāo)儀為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品，倒置顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品，凝膠成像儀為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品，紫外分光光度計(jì)為美國(guó)MJ公司產(chǎn)品。

1.2BMSCs的分離、培養(yǎng)及分組4～6周齡SD雄性大鼠，體重80～120 g，購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。 將SD大鼠脫頸處死后，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)75%乙醇消毒，于無菌條件下取股骨和脛骨。以L-DMEM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，收集沖洗液，得到骨髓細(xì)胞懸液，采用含體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2 d換液一次。待細(xì)胞鋪滿瓶底90%時(shí)，加入2.5 g/L胰蛋白酶消化，以1∶2比例傳代，收集第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為3組?？瞻捉M細(xì)胞用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；前列腺素E2組細(xì)胞用含1×10-5g/L前列腺素E2的培養(yǎng)液培養(yǎng)；前列腺素E2+SB203580組細(xì)胞首先用SB203580處理30 min，然后加入1×10-5g/L前列腺素E2的培養(yǎng)液培養(yǎng)。分組培養(yǎng)14 d后進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.3細(xì)胞中p-p38MAPK、p38MAPK的檢測(cè)分別收集3組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液于冰上裂解30 min，離心收集上清，采用BCA法測(cè)定總蛋白的濃度及純度后，加入上樣緩沖液煮沸5 min。取變性后的總蛋白50 μg進(jìn)行SDS-PAGE。蛋白分離后電轉(zhuǎn)于PVDF膜上，浸入用TBST配制的50 g/L脫脂奶粉封閉液中處理1 h。加入p-p38MAPK、p38MAPK及β-actin抗體(稀釋度均為1∶1 000)于4 ℃反應(yīng)24 h，封閉液洗膜15 min×3次，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000)于37 ℃反應(yīng)1 h。暗室曝光，采用凝膠成像掃描系統(tǒng)分析條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4細(xì)胞中ALP活性檢測(cè)分別收集3組BMSCs，以磷酸鹽緩沖液沖洗2次，加入0.1%Triton X-100 500 μL于4 ℃反應(yīng)過夜。離心收集上清液，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，按照ALP檢測(cè)試劑盒說明書操作，檢測(cè)ALP活性，檢測(cè)波長(zhǎng)520 nm，將結(jié)果換算為金氏單位。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5細(xì)胞中ALP、Runx2、OPN、BMP-2和Cbfα1mRNA的qRT-PCR法檢測(cè)分別收集3組BMSCs，采用Trizol法提取總RNA，并以紫外分光光度計(jì)測(cè)定其純度、濃度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，以RNA為模板合成cDNA，然后行PCR。引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系：10 μL的 2×SYBR Green qPCR Mix，正、反向引物各0.5 μL， cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL。擴(kuò)增條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，循環(huán)40次。采用 2-ΔΔCt法計(jì)算目的mRNA的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。3組p-p38MAPK/p38MAPK比值、ALP活性，各目的mRNA表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.13組細(xì)胞中p-p38MAPK/p38MAPK比值的比較見圖1和表2。與空白組相比，前列腺素E2組細(xì)胞中p-p38MAPK/p38MAPK比值升高(P<0.05)；而前列腺素E2+SB203580組較前列腺素E2組降低(P<0.05)，但仍高于空白組(P<0.05)。

1：空白組；2：前列腺素E2組；3：前列腺素E2+SB203580組

2.23組細(xì)胞中ALP活性的比較ALP活性測(cè)定結(jié)果見表2。前列腺素E2組ALP活性高于空白組(P<0.05)；而前列腺素E2+SB203580組中ALP活性較前列腺素E2組降低(P<0.05)，與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 3組細(xì)胞中p-p38MAPK/p38MAPK比值及ALP活性的比較

2.33組細(xì)胞中成骨分化相關(guān)基因ALP、Runx2和OPN mRNA表達(dá)的比較見表3。與空白組相比，前列腺素E2組細(xì)胞中ALP、Runx2和OPN mRNA表達(dá)水平均升高(P<0.05)；而前列腺素E2+SB203580組3個(gè)指標(biāo)較前列腺素E2組降低(P<0.05)，其中Runx2和OPN mRNA表達(dá)水平仍高于空白組(P<0.05)。

表3 3組細(xì)胞中ALP、Runx2和OPN mRNA表達(dá)水平的比較

2.43組細(xì)胞中骨向分化調(diào)控因子BMP-2和Cbfα1mRNA表達(dá)的比較見表4。前列腺素E2組細(xì)胞中BMP-2 和Cbfα1 mRNA表達(dá)水平高于空白組。前列腺素E2+SB203580組細(xì)胞中BMP-2和Cbfα1 mRNA表達(dá)水平較前列腺素E2下降(P<0.05)，其中Cbfα1 mRNA表達(dá)水平低于空白組(P<0.05)。

表4 3組細(xì)胞中BMP-2和Cbfα1 mRNA表達(dá)水平的比較

3 討論

前列腺素E2在多種干細(xì)胞的增殖和分化過程中發(fā)揮了重要作用。前列腺素E2可通過PI3K/Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)BMP-2生成，進(jìn)而誘導(dǎo)肌腱干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[8]；可通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其向神經(jīng)元方向分化[9]；還可通過活化受體EP4增加造血干細(xì)胞的數(shù)量，調(diào)節(jié)造血系統(tǒng)的穩(wěn)定性[10]。此外，前列腺素E2還在調(diào)控骨組織形成、骨代謝、成骨細(xì)胞增殖、膠原合成和免疫調(diào)節(jié)等過程中扮演重要角色，在BMSCs的增殖和成骨分化過程中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用[7,11-12]。但目前關(guān)于前列腺素E2誘導(dǎo)BMSCs成骨分化的機(jī)制并不明確。p38MAPK信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)通路，其可通過三級(jí)級(jí)聯(lián)反應(yīng)被磷酸化激活，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育和分化等生理病理過程。已有報(bào)道[13-15]證實(shí)，p38MAPK信號(hào)通路在高糖誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡、成骨前MC3T3-E1細(xì)胞的分化以及BMSCs成骨分化過程中發(fā)揮重要作用。

ALP是成骨早期標(biāo)志物，Runx2是在骨形成早期階段監(jiān)管成骨分化和骨形成的重要轉(zhuǎn)錄因子，OPN是中后期成骨分化的重要標(biāo)志物[16]。與p38MAPK信號(hào)通路關(guān)系密切的重要的骨轉(zhuǎn)化調(diào)控因子有BMP-2和Cbfα1；前者是骨生長(zhǎng)的啟動(dòng)因子，可通過激活p38MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化[17]；后者是骨向分化特異性轉(zhuǎn)錄基因，可誘導(dǎo)多潛能間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞表型分化，激活OPN和OC等成骨基因的轉(zhuǎn)錄，抑制p38MAPK信號(hào)通路可引起Cbfα1表達(dá)下調(diào)[15,18]；兩者均是BMSCs向成骨細(xì)胞分化的重要調(diào)控因子。已有研究[18]指出，前列腺素E2可通過結(jié)合EP4受體增加間充質(zhì)干細(xì)胞中BMP-2的表達(dá)。

我們?cè)贚iu等[7]研究的基礎(chǔ)上，選用濃度為1×10-5g/L的前列腺素E2與大鼠BMSCs體外共培養(yǎng)，Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后BMSCs中p-p38MAPK/p38MAPK比值升高，ALP活性以及ALP、Runx2、OPN mRNA的表達(dá)升高，骨轉(zhuǎn)化調(diào)控因子BMP-2和Cbfα1 mRNA的表達(dá)也升高；利用p38MAPK阻斷劑SB203580阻斷BMSCs中p38MAPK的活化后，前列腺素E2誘導(dǎo)的BMSCs中p38MAPK磷酸化水平下降，ALP活性以及ALP、Runx2、OPN mRNA的表達(dá)均降低，BMP-2和Cbfα1 mRNA的表達(dá)也降低；提示p38MAPK信號(hào)通路在列腺素E2誘導(dǎo)BMSCs成骨分化過程中發(fā)揮了促進(jìn)作用，前列腺素E2可能通過激活p38MAPK信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)控BMP-2和Cbfα1的表達(dá)，從而發(fā)揮誘導(dǎo)BMSCs成骨分化的作用。

綜上所述，我們認(rèn)為p38MAPK信號(hào)通路參與了前列腺素E2誘導(dǎo)的大鼠BMSCs成骨分化的過程，其作用機(jī)制可能與上調(diào)BMP-2和Cbfα1表達(dá)有關(guān)。該研究結(jié)果為應(yīng)用前列腺素E2促進(jìn)骨折愈合和骨再生提供了參考依據(jù)，也為調(diào)控BMSCs成骨分化提供了作用靶點(diǎn)。