尹哲， 龍莎， 張嘉穎， 於懷龍， 王立強(qiáng)

(華僑大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)學(xué)院， 福建 泉州 362021)

單環(huán)刺螠(Urechisunicinctus)體長(zhǎng)色紅，是常見的底棲生物，多見于我國(guó)黃渤海沿岸U型淺水區(qū)，利用價(jià)值極高.對(duì)單環(huán)刺螠的生物研究最早集中在螠速激肽Ⅰ-Ⅷ、血凝素、腺苷酸酶等成分的提取和利用方面[1-4].王佃亮等[5]在研究單環(huán)刺螠體內(nèi)生物活性物質(zhì)的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)其具有一種纖溶活性的蛋白酶.郭金明等[6]在前人研究的基礎(chǔ)上，從單環(huán)刺螠組織液中提取出在體內(nèi)外均具有較強(qiáng)抗凝、溶栓活性及生物安全性的纖溶酶，并命名為單環(huán)刺螠纖溶酶(UFE).UFE是一種胰蛋白酶樣的絲氨酸蛋白酶，具有纖維蛋白溶解活性，能明顯延長(zhǎng)血液凝固時(shí)間，產(chǎn)生抗凝血作用[7].現(xiàn)有的研究對(duì)UFE的提取部位各異，質(zhì)量尚未均一化，導(dǎo)致文獻(xiàn)報(bào)道中結(jié)果數(shù)據(jù)的可信度與重現(xiàn)性較差.本課題組的前期研究表明，單環(huán)刺螠肌體中UFE的總蛋白質(zhì)量與季節(jié)變化有關(guān)，具有季節(jié)累積性.基于此，本文對(duì)秋季單環(huán)刺螠體腔液、體壁肌及內(nèi)臟等不同部位UFE進(jìn)行分離純化，并對(duì)其活性差異進(jìn)行研究.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

單環(huán)刺螠(山東省青島市黃島海域)，清潔級(jí)，體質(zhì)量為(40±10) g(生物學(xué)成年個(gè)體)；SD大鼠(購(gòu)自廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)為SYXK(閩)2013-0006)，SPF級(jí)，體質(zhì)量為(200±20) g，雌雄各半.

1.2 儀器與試劑

高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)；HD-21-88型核酸/蛋白質(zhì)檢測(cè)儀(上海琪特公司)；超聲波清洗機(jī)(上海市愛闊特公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；真空干燥箱(上海和呈儀器制造有限公司)；M600型凝血因子分析儀(北京中勤世帝科學(xué)儀器有限公司)；P2-4LD型冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康試驗(yàn)儀器有限公司).

凝血酶時(shí)間(TT)診斷試劑盒、凝血酶原時(shí)間(PT)診斷試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；Q-Sepharose fast flow陰離子交換層析柱(上海源葉生物科技有限公司)；硫酸根(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30.26%)、糖醛酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25.25%)、氨基糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.58%)、Folin-酚試劑、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、酪蛋白(賽默上海飛世爾科技有限公司)；SephacrylS 100凝膠柱、Sephadex G-50葡聚糖凝膠、纖維蛋白原(FIB)測(cè)定試劑(福建省泉州市華諾生物科技有限責(zé)任公司)；標(biāo)準(zhǔn)血漿(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),乏抗凝血酶-Ⅲ血漿(乏AT-Ⅲ血漿)、乏肝素輔因子-Ⅱ血漿(乏HC-Ⅱ血漿)(上海冠東生物科技有限公司)；肝素鈉(≥2 500.5 mkat·g-1，CAS登錄號(hào)為9041-08-1，安徽省合肥市博美生物科技有限公司)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 單環(huán)刺螠分組 于秋季購(gòu)買單環(huán)刺螠成蟲，選擇體表無(wú)傷痕，體態(tài)均一的健康個(gè)體，于充氣的海水(水溫為(17.6±0.3) ℃，pH值為8.01±0.02，實(shí)際鹽度為32%)中暫養(yǎng)3 d，每日換水2次，每次換1/2水.實(shí)驗(yàn)分3批(A～C批)，每批3組，每組10只.

1.3.2 單環(huán)刺螠前處理 將單環(huán)刺螠進(jìn)行以下處理:A批，剪去一端，擠出內(nèi)臟，用蒸餾水淋洗后進(jìn)行組織絞碎，紗布過(guò)濾，得內(nèi)臟勻漿液；B批，避開內(nèi)臟，在蟲體近頭端處剖開長(zhǎng)度約1 cm的小口，倒提蟲體，將體腔液瀝出，紗布過(guò)濾，得體腔液；C批，剪去一端，擠出內(nèi)臟，將剩余體壁肌用蒸餾水淋洗后進(jìn)行組織絞碎，紗布過(guò)濾，得體壁肌勻漿液.以上過(guò)程均在4 ℃下進(jìn)行，處理后于-80 ℃暫存.

1.3.3 UFE的提取純化 將3批樣品在4 ℃下融化，于3 900 r·min-1離心60 min，收集上清液，分別于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%，50%的過(guò)硫酸銨溶液中透析除鹽，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜處理后，冷凍干燥，得酶粗品.分別配制0.2 mol·L-1的酶粗品液上樣SephacrylS 100凝膠柱，以雙蒸水洗脫，收集凝膠柱最上層的淡黃色條帶組分，冷凍干燥，獲得最終酶粗品.用0.02 mol·L-1的Tris-HCl 緩沖液將酶粗品的濃度配制為0.2 mol·L-1后，按柱體積的2%(約5 mL)向Q-Sepharose 陰離子層析柱中加樣，流速為1.2 mL·min-1，使用0.5 mol·L-1的NaCl及0.02 mol·L-1的Tris-HCl緩沖液梯度洗脫；收集的洗脫液以雙蒸水為外相，3 500 D透析袋去離子后冷凍干燥，使雙蒸水溶解層析所得凍干品的質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1，按柱體積的2%(約5 mL)向Sephadex G-50凝膠柱上樣，流出速度為每秒0.2滴，每管收集4 mL流出組分，冷凍干燥.然后，分別檢測(cè)A～C批的酶活力及比活力.酶活力單位定義:在溫度為37 ℃，pH值為7.8的條件下，每分鐘水解出相當(dāng)于1 μg 酪氨酸的酶量為1個(gè)酶活力單位，即1個(gè)酶活力單位=酪氨酸質(zhì)量/水解時(shí)間×稀釋倍數(shù).比活力指單位質(zhì)量蛋白質(zhì)所具有的酶活力單位數(shù).

1.3.4 UFE酶活力的測(cè)定 用Folin-酚試劑法對(duì)酶活力進(jìn)行測(cè)定，以酪蛋白為底物.取1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的酪蛋白溶液和0.9 mL Tris-HCl緩沖液，加入0.1 mL UFE樣品溶液，混勻后，于37 ℃水浴中反應(yīng)20 min，加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的三氯乙酸溶液終止反應(yīng);靜置離心10 min，取上清液作為樣品溶液.取1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的酪蛋白溶液和0.9 mL Tris-HCl緩沖液，加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的三氯乙酸溶液，再加入0.1 mL的UFE樣品溶液，靜置離心10 min，取上清液作為對(duì)照溶液.取上述樣品溶液和1 mL對(duì)照溶液，加入5 mL Folin-酚試劑(甲)及0.5 mL Folin-酚試劑(乙)，混勻于室溫放置30 min后，在560 nm處測(cè)定其吸光度D560.以吸光度D560為縱坐標(biāo)(Y),以蛋白質(zhì)量為橫坐標(biāo)(X)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=102.65X-0.214 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8.

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)血漿、乏AT-Ⅲ血漿、乏HC-Ⅱ血漿凝固時(shí)間的測(cè)定 選擇生理鹽水作為對(duì)照組，按體積比1∶10分別向標(biāo)準(zhǔn)血漿、乏AT-Ⅲ、乏HC-Ⅱ血漿中加入4 mg·mL-1的UFE，以此作為實(shí)驗(yàn)組.將凝血酶原時(shí)間試劑和凝血酶時(shí)間試劑預(yù)溫10 min后，再將各待測(cè)組預(yù)溫5 min，通過(guò)凝血因子分析儀測(cè)定凝固時(shí)間.

1.3.6 血漿凝血因子活性的測(cè)定 選擇生理鹽水為空白對(duì)照，70 μg·mL-1肝素鈉為陽(yáng)性對(duì)照，3批UFE樣品的質(zhì)量濃度為70 μg·mL-1，使用凝血因子試劑盒測(cè)定血漿凝血因子活性.

1.3.7 大鼠血體外復(fù)鈣凝血時(shí)間的測(cè)定 選擇生理鹽水作為空白對(duì)照，2 mg·mL-1肝素鈉作為陽(yáng)性對(duì)照，氯化鈣溶液的質(zhì)量濃度分別為3，10 mg·mL-1，UFE的質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1.大鼠股動(dòng)脈取血，每5 mL血液中加入0.1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的草酸鉀溶液，以制備抗凝血.每組加入0.9 mL抗凝血，空白對(duì)照組中加入1 mL生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組中加入1 mL肝素鈉，實(shí)驗(yàn)組中加入1 mL UFE溶液，于37 ℃恒溫水浴條件下，分別加入0.1 mL不同質(zhì)量濃度的氯化鈣溶液；每隔30 s檢查血液狀態(tài)，當(dāng)血液不再流動(dòng)時(shí)，記錄凝血時(shí)間.

1.3.8 大鼠血液中鈣離子濃度的測(cè)定 選擇雌雄大鼠，正常喂養(yǎng)3 d后，實(shí)驗(yàn)組分別尾靜脈注射4，16 mg·mL-1的UFE溶液，空白對(duì)照組注射0.5 mL的生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組注射4 mg·mL-1的肝素鈉；30 min后股動(dòng)脈采血，于3 000 r·min-1離心15 min，并通過(guò)甲基-百里酚藍(lán)比色法測(cè)定上清液中鈣離子的質(zhì)量濃度[6].

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

樣品批次mavmexA批(內(nèi)臟)40.80±1.217.87±0.37B批(體腔液)40.18±1.978.80±0.25C批(體壁肌)39.75±2.3020.37±1.07

2 結(jié)果與分析

2.1 單環(huán)刺螠不同部位的分離純化

2.1.1 樣品參數(shù)統(tǒng)計(jì) 單環(huán)刺螠的基本參數(shù)統(tǒng)計(jì)(體腔液密度為1 g·cm-3),如表1所示.表1中：n為檢測(cè)次數(shù)；mav為單環(huán)刺螠的平均質(zhì)量；mex為單環(huán)刺螠提取部位的質(zhì)量.由表1可知：不同部位來(lái)源樣品的質(zhì)量不同，體腔液和內(nèi)臟占單環(huán)刺螠質(zhì)量的比例較為接近，體壁肌則為單環(huán)刺螠體質(zhì)量的主要構(gòu)成.

2.1.2 粗酶液的吸光度 不同部位來(lái)源的樣品粗酶液，如圖1所示.由圖1可知：B批樣品經(jīng)過(guò)濾、離心處理后，與另外兩批相比，顏色鮮紅，質(zhì)地粘稠.不同部位樣品經(jīng)SephacrylS 100凝膠柱后，其吸光度D560如圖2所示.由圖2可知：C批樣品蛋白的D560最低，A批次之，B批的D560最高，可達(dá)0.841.因此，體腔液的外觀及其粗酶液的D560值均優(yōu)于其他部位.

圖1 樣品粗酶液 圖2 不同部位樣品的吸光度 Fig.1 Sample crude enzyme solution Fig.2 Optical density values of sample from different parts

2.1.3 樣品純化參數(shù) 不同部位來(lái)源樣品分離純化過(guò)程中的相關(guān)參數(shù)，如圖3所示.圖3中：mt為總蛋白質(zhì)量；k為純化倍數(shù)；與A批組相比，“a”表示P<0.01；與B批組相比，“b”表示P<0.01；與C批組相比，“c”表示P<0.01.由圖3可知：不同部位來(lái)源樣品的參數(shù)存在一定差異，體腔液中提取的總蛋白質(zhì)量為39.8 mg，UFE的比活力為4 695.94 mkat·g-1，純化倍數(shù)為13.8，均高于體壁肌、內(nèi)臟中所得.

(a) 總蛋白質(zhì)量 (b) 比活力 (c) 純化倍數(shù)圖3 不同部位來(lái)源樣品分離純化過(guò)程中的相關(guān)參數(shù)Fig.3 Relevant parameters during separation and purification of samples from different parts

表2 UFE抗凝血酶活性的比較(n=6)Tab.2 Comparison of UFE antithrombin activity (n=6)

2.2 不同部位來(lái)源的UFE活性差異驗(yàn)證

2.2.1 UFE抗凝血酶活性 比較不同部位UFE的凝血酶原時(shí)間和凝血酶時(shí)間可知其抗凝血酶活性.UFE抗凝血酶活性的比較，如表2所示.表2中：tP,tT分別為凝血酶原時(shí)間和凝血酶時(shí)間；相比標(biāo)準(zhǔn)血漿， “**”表示P<0.01；相比乏AT-Ⅲ血漿，“a”表示P<0.05，“aa”表示P<0.01；相比乏HC-Ⅱ血漿，“bb”表示P<0.01.由表2可知：加入B批UFE后，標(biāo)準(zhǔn)血漿、乏AT-Ⅲ及乏HC-Ⅱ血漿的凝血酶原時(shí)間和凝血酶時(shí)間均極顯著延長(zhǎng)(P<0.01)；加入A批UFE后，標(biāo)準(zhǔn)血漿和乏HC-Ⅱ血漿的凝血酶時(shí)間極顯著性延長(zhǎng)(P<0.01)，而乏AT-Ⅲ血漿的凝血酶時(shí)間和凝血酶原時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.05)；加入C批UFE的作用不顯著.同時(shí)，分析數(shù)據(jù)可知，在相同條件下，UFE對(duì)凝血酶時(shí)間的作用更為明顯，凝血酶時(shí)間大于凝血酶原時(shí)間.

2.2.2 UFE對(duì)血漿凝血因子活性的影響 UFE對(duì)血漿凝血因子活性的影響結(jié)果，如表3所示.表3中：對(duì)照組、肝素鈉組、UFE組A批、UFE組B批、UFE組C批的纖維蛋白原(FIB)的質(zhì)量濃度分別為(2.69±0.20)，(2.09±0.19)，(2.37±0.21)，(2.23±0.34),(2.49±0.26) g·L-1，與對(duì)照組相比，肝素鈉組與3批UFE組的FIB質(zhì)量濃度均低于對(duì)照組，未達(dá)顯著水平，且不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；相比對(duì)照組，“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01；相比肝素鈉組，“a”表示P<0.05，“aa”表示P<0.01.由表3可知：UFE組B批能夠極顯著降低各凝血因子活性(P<0.01)，UFE組A批能夠極顯著降低除凝血因子Ⅱ之外的各凝血因子活性(P<0.01)，UFE組C批能夠顯著降低除凝血因子Ⅱ之外的各凝血因子活性(P<0.05).此外，與肝素鈉組相比，UFE組B批能夠極顯著地降低凝血因子Ⅱ，Ⅺ的活性(P<0.01)，對(duì)其他因子不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

凝血因子凝血因子活性對(duì)照組肝素鈉組UFE組A批UFE組B批UFE組C批因子Ⅱ102.37±5.1853.66±6.85**89.85±5.05aa74.32±5.09**aa97.63±5.19aa因子Ⅴ101.13±6.7538.13±5.92**59.48±6.35**44.86±7.73**83.25±6.82*因子Ⅶ100.53±8.5652.17±7.10**70.37±7.49**56.97±7.67**82.85±7.30*因子Ⅷ102.08±8.0451.12±6.43**58.20±6.64**48.64±6.39**69.93±7.45*因子Ⅸ101.39±5.4634.07±4.83**60.18±5.02**aa49.07±6.84**67.39±6.84*因子Ⅹ103.07±2.4748.14±5.86**65.04±5.33**56.69±6.08**88.27±8.52*因子Ⅺ101.74±5.0728.08±6.14**57.62±6.81**aa45.67±5.89**aa65.33±4.68*因子Ⅻ102.66±8.1323.06±7.61**30.09±7.47**a27.64±8.73**48.41±8.91**aa

圖4 UFE對(duì)大鼠體外復(fù)鈣凝血時(shí)間的影響Fig.4 Effect of UFE on recalcification time of rat calcium in vitro

2.2.3 UFE對(duì)大鼠血體外復(fù)鈣凝血時(shí)間的影響 UFE對(duì)大鼠血體外復(fù)鈣凝血時(shí)間的影響,如圖4所示.圖4中：ρ(CaCl2)為氯化鈣的質(zhì)量濃度.由圖4可知：與對(duì)照組相比，加入不同質(zhì)量濃度的氯化鈣溶液的肝素鈉組均能明顯延長(zhǎng)凝血時(shí)間；相較于對(duì)照組，UFE組B批對(duì)延長(zhǎng)凝血時(shí)間的影響最顯著，UFE組A批延長(zhǎng)凝血時(shí)間的效果弱于UFE組B批，強(qiáng)于UFE組C批；加入10 mg·mL-1氯化鈣的各組延長(zhǎng)凝血時(shí)間作用均強(qiáng)于3 mg·mL-1的氯化鈣的實(shí)驗(yàn)組，說(shuō)明氯化鈣的質(zhì)量濃度越高，延長(zhǎng)作用越強(qiáng)，凝血時(shí)間越長(zhǎng).

2.2.4 UFE對(duì)大鼠血液中鈣離子濃度的影響 UFE對(duì)大鼠血液中鈣離子濃度的影響，如表4所示.表4中：c(Ca2+)表示鈣離子濃度；相比對(duì)照組，“**”表示P<0.01；相比肝素鈉組，“aa”表示P<0.01.由表4可知：UFE能夠降低血液中鈣離子的濃度， 并存在濃度依賴關(guān)系，濃度越高，作用越顯著； 與對(duì)照組相比，各批UFE組能夠極顯著地降低大鼠血液中鈣離子的濃度(P<0.01)，肝素鈉組未達(dá)到顯著水平(P>0.05)；不同質(zhì)量濃度的UFE降低作用不同，UFE組B批(4，16 mg·mL-1)、UFE組A批(16 mg·mL-1)作用極顯著(P<0.01)，對(duì)鈣離子的降低作用強(qiáng)于肝素鈉組；3批UFE作用各異，UFE組B批對(duì)大鼠血液中鈣離子濃度的影響最大.

表4 UFE對(duì)大鼠血液中鈣離子濃度的影響(n=6)Tab.4 Effect of UFE on calcium ionconcentration in rat blood (n=6)

3 討論

單環(huán)刺螠的體壁、消化道和體腔液中均含有豐富的氨基酸，并包含人體需要的各種必需氨基酸[8-11].現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道中關(guān)于單環(huán)刺螠纖溶酶的來(lái)源部位各異，而具有針對(duì)性的抗凝機(jī)制研究鮮有報(bào)道，極大限制了UFE的精準(zhǔn)開發(fā)與應(yīng)用.該實(shí)驗(yàn)對(duì)不同部位纖溶酶的分離純化及活性的對(duì)比研究，驗(yàn)證了前期針對(duì)纖溶酶在體內(nèi)積累規(guī)律研究所獲得的結(jié)果.單環(huán)刺螠生殖細(xì)胞年周期發(fā)育分為增殖期、生長(zhǎng)期、成熟期、排放期和休止期，單環(huán)刺螠的小生殖期為9月中旬至10月中旬(秋季)，生殖細(xì)胞的發(fā)生主要在體腔液中進(jìn)行[12-14].該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)秋季單環(huán)刺螠體腔液中纖溶酶的總蛋白質(zhì)量豐富，故有待進(jìn)一步研究單環(huán)刺螠生殖細(xì)胞發(fā)育階段對(duì)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的影響.該實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，UFE能顯著降低血漿部分凝血因子的活性，推測(cè)UFE可能與AT-Ⅲ結(jié)合，引起AT-Ⅲ構(gòu)象的改變，使AT-Ⅲ更易與凝血因子結(jié)合，從而滅活或抑制凝血因子的活性；對(duì)HT-Ⅱ產(chǎn)生鈍化作用，使降低血漿中的凝血因子Ⅱ的作用較小.Ca2+是內(nèi)環(huán)境平衡必不可少的活性離子，Ca2+作為凝血因子Ⅳ在凝血過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[15].本研究進(jìn)一步驗(yàn)證UFE可通過(guò)降低血液中Ca2+的濃度來(lái)延長(zhǎng)大鼠血復(fù)鈣凝血時(shí)間.

通過(guò)對(duì)比不同部位提取的UFE對(duì)AT-Ⅲ、HT-Ⅱ、凝血因子和鈣離子的影響可知，體腔液、體壁肌、內(nèi)臟中的UFE在凝血作用機(jī)制方面的效應(yīng)強(qiáng)度各不相同，體腔液中提取的UFE作用最強(qiáng)；比較不同部位來(lái)源的單環(huán)刺螠纖溶酶在總蛋白質(zhì)量、活性作用方面的差異，初步證實(shí)體腔液中UFE總蛋白質(zhì)量最多，且活性優(yōu)于體壁肌及內(nèi)臟中所得酶，可以彌補(bǔ)UFE質(zhì)量穩(wěn)定性的不足.實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選擇多個(gè)單環(huán)刺螠的不同部位進(jìn)行參數(shù)比較，后續(xù)工作可增加每一部位的陰性對(duì)照來(lái)研究每個(gè)部位的專屬性.