郭書磊，魯曉民，齊建雙，魏良明，張新，韓小花，岳潤清，王振華，鐵雙貴，陳彥惠

利用RNA-Seq發(fā)掘玉米葉片形態(tài)建成相關的調(diào)控基因

郭書磊1,2，魯曉民1，齊建雙1，魏良明1，張新1，韓小花1，岳潤清1，王振華1，鐵雙貴1，陳彥惠2

（1河南省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所/河南省玉米生物學重點實驗室，鄭州 450002；2河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，鄭州 450046）

【】葉片寬度和長度等葉形特性是決定植株形態(tài)，進而影響種植密度的重要農(nóng)藝性狀，通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)篩選并挖掘玉米葉片形態(tài)建成相關的代謝路徑及調(diào)控基因，為深入認識葉片發(fā)育的分子機理和鑒定葉寬、葉長候選基因奠定基礎。以極端窄葉自交系NL409和寬葉自交系WB665為材料，利用RNA-Seq技術(shù)鑒定7葉期第七片葉近基部的差異表達基因（DEGs），通過生物信息學分析，篩選與葉片發(fā)育密切相關的代謝通路，利用qRT-PCR驗證不同激素路徑葉形相關基因的表達結(jié)果，并結(jié)合啟動子區(qū)域的序列差異挖掘葉形功能基因。分析對照（WB665）和樣品（NL409）高通量測序結(jié)果，在葉寬形成關鍵部位共篩選出5 199個DEGs，其中，2 264（43.55%）個基因表達上調(diào)，2 935（56.45%）個基因下調(diào)表達，下調(diào)基因明顯多于上調(diào)基因；GO功能富集分析表明，差異基因主要富集在細胞膜相關的細胞組分中，涉及代謝過程和細胞響應刺激；KEGG富集分析表明，差異基因主要參與到核糖體、植物激素信號轉(zhuǎn)導、苯丙烷類代謝、乙醛酸和二羧酸代謝等過程，其中核糖體、植物激素信號轉(zhuǎn)導、鞘脂類代謝下調(diào)表達基因較多的路徑與葉片發(fā)育密切相關。核糖體路徑富集到多個PRS（PRESSED FLOWER）基因，分析發(fā)現(xiàn)（）可能在調(diào)控窄葉發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。鞘脂代謝路徑富集的基因幾乎全部下調(diào)表達，引起抑制葉片發(fā)育的AP1（APETALA1）類和MAPK（Mitogen-Activated Protein Kinase）類基因上調(diào)，以及促進葉片發(fā)育的（）下調(diào)，與窄葉發(fā)育受抑制的表型一致。植物激素信號轉(zhuǎn)導路徑富集到的油菜素內(nèi)酯（BR）響應基因和赤霉素（GA）代謝基因下調(diào)，細胞分裂素（CTK）和大部分生長素（Auxin）響應基因上調(diào)，與窄葉中DELLA蛋白基因上調(diào)表達，抑制GA并促進CTK基因表達的作用模式一致。通過qRT-PCR對18個葉片發(fā)育相關基因進行分析，結(jié)果表明，其表達趨勢與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致，分析發(fā)現(xiàn)BR相關的、Auxin相關的、e以及TCP類轉(zhuǎn)錄因子/等基因與窄葉的形成密切相關。明確了一些與玉米葉片發(fā)育密切相關的代謝路徑，還發(fā)現(xiàn)植物激素間的動態(tài)平衡對葉片發(fā)育有著重要影響，尤其是生長素與油菜素內(nèi)酯、細胞分裂素與赤霉素之間的相互作用對調(diào)控葉片形態(tài)可能發(fā)揮重要作用。

玉米；葉寬；葉長；RNA-Seq；形態(tài)建成；調(diào)控基因

0 引言

【研究意義】玉米作為增產(chǎn)潛力巨大的糧食作物，對于保障糧食安全，促進農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要作用。近年來，中國玉米的種植密度維持在4.8—6.77萬株/hm2，與美國8.5—10.95萬株/hm2的種植密度存在顯著差距，提高玉米的耐密植特性，成為實現(xiàn)中國玉米高產(chǎn)突破的重要措施[1-2]。葉片是玉米進行光合作用和抗逆作用的主要營養(yǎng)器官，是耐密植理想株型的關鍵組成因素，對于植株干物質(zhì)的積累及抗逆性有非常重要的影響。對于大面積密植的農(nóng)作物，高密度條件下容易出現(xiàn)避蔭綜合癥（shade avoidance syndrome，SAS），迫使群體內(nèi)個體將能量重新分配，用于葉片和植株伸長生長，從而獲得更多的陽光，盡管避蔭反應對單個植株的適應與生存是有利的，但是由于避蔭反應會削弱植株葉片和儲藏器官的發(fā)育[3]，對提高大面積種植的作物產(chǎn)量是不利的。高密度條件下，葉片寬大的群體冠層間通風透氣性差，降低植株的抗病性，加劇病蟲害的發(fā)生，導致生物量和籽粒產(chǎn)量降低。玉米耐密植株型的合理葉寬、葉長有利于改良理想株型，減少植株的避蔭反應，使個體間競爭最小化，對提高種植密度具有重要的促進作用。葉寬、葉長等葉形特性是決定植株形態(tài)進而影響種植密度的重要農(nóng)藝性狀，因此，選育適宜高密度種植的合理葉寬、葉長玉米，是提高玉米產(chǎn)量的重要技術(shù)手段之一。雖然有大量研究揭示了玉米葉發(fā)育及形態(tài)建成的遺傳基礎，但是鮮有關于葉寬、葉長QTL克隆及調(diào)控網(wǎng)絡的研究結(jié)果[4]，利用轉(zhuǎn)錄組（RNA-seq）篩選與葉寬、葉長發(fā)育相關的調(diào)控基因，并發(fā)掘其可能的調(diào)控路徑，對葉寬、葉長主效基因研究及耐密株型設計育種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】葉片的發(fā)育起始于莖頂端分生組織（shoot apical meristem，SAM）周邊的初始細胞，主要包括葉原基的形成和葉極性軸向的建立[5]。葉原基是由頂端分生組織中心“干細胞”在生長素誘導下形成成簇分布的外緣葉原初生細胞；葉原基形成后在自身遺傳機制和環(huán)境因子作用下，建立基-頂軸（葉的基部-頂端）、腹-背軸（莖的近軸面-遠軸面）、中-邊軸（葉的主脈-邊緣）3個極性軸向，這些過程中的發(fā)育異常將直接或間接影響葉片的發(fā)育和形態(tài)建成。玉米葉片的發(fā)育和形態(tài)建成是由多基因調(diào)控的復雜過程，主要由遺傳因素控制，同時受環(huán)境影響，葉寬的遺傳相比其他葉形性狀受環(huán)境影響較小，而且其具有易觀測的線性形態(tài)，更有利于研究葉片發(fā)育過程的形態(tài)變化和細胞學特征，是研究葉寬最為理想的模式植物[4]。關于擬南芥、水稻、金魚草等植物葉片發(fā)育的研究，取得了一系列重要進展，深入解析了葉片發(fā)育的調(diào)控機理，而玉米葉寬、葉長的研究多為遺傳分析及QTL定位的報道，只有少數(shù)文獻關于葉發(fā)育基因、、、、、/、、、/和遺傳機理的分析[6-14]，揭示了葉寬、葉長發(fā)育形成的部分分子機理。高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，不僅能夠檢測全基因組所有基因的轉(zhuǎn)錄信息，還可以獲得特定時期某一生物學過程顯著富集的基因，以及特定組織或細胞中的多種轉(zhuǎn)錄本和優(yōu)勢表達基因，對研究特定組織的生物學功能具有重要的指導意義，利用轉(zhuǎn)錄組發(fā)掘玉米葉片發(fā)育相關基因，為葉片遺傳機理的解析提供了新途徑[15-16]。【本研究切入點】關于葉寬、葉長等葉形主效基因克隆的研究相對有限，已有研究僅揭示了葉形發(fā)育的部分分子機理，葉寬、葉長候選基因及其調(diào)控路徑有待進一步解析?！緮M解決的關鍵問題】本研究通過RNA-seq測序探討葉寬差異極顯著自交系的轉(zhuǎn)錄表達特性，以期獲得與葉形發(fā)育相關的關鍵基因及轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡，更好地理解玉米葉片發(fā)育的分子機理，增加對窄葉形成機制的認識，進而為葉形候選基因的克隆及耐密分子育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

2017年夏極端窄葉自交系NL409（樣品）和寬葉自交系WB665（對照）種植于河南省農(nóng)業(yè)科學院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技示范基地，在田間正常生長至7葉期時（對生的葉耳包裹著新鮮的幼莖即將打開），取第7片葉近基部葉片（近基部1/3葉長處，切取2.0 cm），為了消除個體間差異，將相同基因型的材料3株混合取樣，每個材料取3次生物學重復，樣品經(jīng)液氮速凍后-80℃保存，用于RNA提取。極端窄葉自交系NL409是歐洲雜交種連續(xù)自交選育而來，寬葉自交系WB665是昌7-2改良系，兩者親緣關系較遠。

1.2 RNA樣品的提取及轉(zhuǎn)錄組測序

委托北京安諾優(yōu)達基因科技有限公司完成RNA提取、文庫構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測序。首先，采用酚/氯仿法提取Total RNA，通過NanoDrop 2000微量分光光度計、Agilent 2100 Bioanalyzer和Agilent RNA 6000 Nano Kit檢測RNA濃度、純度和完整性；其次，檢測合格樣品利用Oligo（dT）富集mRNA，并通過Fragmentation Buffer使其短片段化，以短片段mRNA合成雙鏈cDNA，純化后進行末端修復、加堿基A、加測序接頭處理；最后進行PCR擴增完成測序文庫制備。采用Illumina NextSeq 550AR平臺進行雙末端測序，并對獲得的原始序列（raw reads）進行過濾，去除含接頭、低質(zhì)量（Q＜30）、含N比例大于5%的序列，得到高質(zhì)量的Clean Reads用于后續(xù)分析。

1.3 基因表達數(shù)據(jù)分析

利用TopHat（v2.0.12）軟件，將6個樣本過濾后的Clean Reads比對到B73基因組（AGPv3 版本），通過FPKM（Fragments per Kilobase per Millon Mapped Fragments）對基因表達量進行標準化，以FPKM>1為表達標準，隨后根據(jù)極端窄葉與寬葉的比較，用DEseq（|log2FC（fold change）|≥1和-value/FDR＜0.05）確定差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）[17]。利用Uniprot、Swissprot、COG、NR、GO和KEGG等數(shù)據(jù)庫對DEGs進行功能注釋，通過GO富集分析顯示DEGs顯著富集的功能分類[18]，用KEGG分析DEGs主要參與的代謝途徑和信號通路（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）。

1.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析

選擇與葉片發(fā)育相關的18個差異表達基因進行qRT-PCR驗證。將轉(zhuǎn)錄組測序用到的RNA，通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒（GoScript Reverse Transcription Kit購于promega生物技術(shù)有限公司）合成cDNA第一鏈，以其為模板，利用GoTaq qPCR Master Mix Kit（購于promega生物技術(shù)有限公司）在Bio-Rad CFX96實時熒光定量儀上進行qRT-PCR。以玉米中的作為內(nèi)參基因，每個基因的定量分析設置3次生物學重復，3次技術(shù)重復，采用相對定量2-ΔΔCt法分析結(jié)果[19]。

2 結(jié)果

2.1 葉寬表型和RNA-Seq測序質(zhì)量分析

極端窄葉自交系NL409和寬葉自交系WB665葉寬形態(tài)穩(wěn)定時期（散粉后一周）的葉寬表型（圖1），以及第7葉期的葉寬達到極顯著差異（表1），在這兩個時期，NL409的葉寬、葉長、葉面積均顯著小于WB665。6個RNA-Seq文庫原始測序過濾后分析結(jié)果（表2），各樣本生物學重復間的相關系數(shù)為0.984—0.995，其中約88%高質(zhì)量序列被比對到外顯子區(qū)域，表明測序結(jié)果良好，數(shù)據(jù)可用于進一步分析。

表1 自交系NL409和WB665第7葉期以及穩(wěn)定時期的葉寬、葉長、葉面積

1)7表示第7葉期，S表示穩(wěn)定時期。不同大寫字母表示在＜0.01水平差異顯著

1)7 indicate the 7th leaf period, S indicate the stable period. different uppercase letters indicate significant differences at＜0.01 levels

圖1 自交系NL409（左）和WB665（右）穩(wěn)定時期的葉片

2.2 基因表達數(shù)據(jù)分析

選取第7葉期窄葉自交系NL409（T7，樣品）和寬葉自交系WB665（C7，對照）葉片發(fā)育最寬處進行轉(zhuǎn)錄組差異比較分析，發(fā)現(xiàn)5 199個差異表達基因，其中2 264（43.55%）個基因上調(diào)表達，2 935（56.45%）個基因下調(diào)表達。上（下）調(diào)1—3倍（fold change）的基因分別占差異表達上（下）調(diào)基因總數(shù)的29.37%（665）和21.69%（756）；上（下）調(diào)3—10倍的基因分別占43.86%（993）和29.24%（1 019）；上（下）調(diào)10—60倍的基因分別占20.76%（470）和12.82%（447）；上（下）調(diào)60倍以上的基因分別占6.01%（136）和24.29%（713）。從火山圖中可以直觀地看出對照組與比較樣本組之間的表達水平具有顯著差異，而且差異60倍以上的下調(diào)基因明顯多于上調(diào)基因（圖2）。

表2 樣品reads分布情況

1)71、72、73分別代表7葉期的第1、2、3個樣品

1)71, 72 and 73 indicate the first, second and third samples of the 7th leaf period respectively

GO功能分析表明，差異表達基因被注釋到24個生物過程、22個細胞組分、19個分子功能類別中，差異基因主要富集在細胞膜相關的細胞組分中。其中生物過程顯著富集在次生代謝、花粉雌蕊相互作用、花粉識別、防衛(wèi)反應和細胞識別5個過程（圖3）；細胞組分分析中差異基因顯著富集在細胞外緣、質(zhì)膜、細胞膜固有成分、細胞膜基本成分、膜部分、共質(zhì)體、胞間接合和胞間連絲等10個組分類別（圖4）；分子功能顯著富集在單加氧酶活性、氧化還原活性、催化活性、纖維素合成酶活性、ADP結(jié)合、碳水化合物結(jié)合、鐵離子結(jié)合、葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性等19個類別（圖5）。

橫坐標為差異表達基因表達倍數(shù)變化，縱坐標為表達量變化的統(tǒng)計學顯著程度

利用MapMan工具對差異表達基因進行pathway富集分析，差異基因被注釋到125條代謝通路中，主要涉及生物合成、能量代謝、信號轉(zhuǎn)導及次生代謝。以-value≤0.05為篩選標準，發(fā)現(xiàn)這些基因顯著富集到11條代謝路徑（表3），其中核糖體路徑富集差異基因數(shù)目最多達到83個，37個基因表達上調(diào)，46個基因下調(diào)表達；其次，植物激素信號轉(zhuǎn)導通路富集57個差異基因，24個基因上調(diào)，33個基因下調(diào)；苯丙烷類代謝路徑18個基因上調(diào)，15個基因下調(diào)；乙醛酸和二羧酸代謝通路15個基因上調(diào)，10個基因下調(diào)；谷胱甘肽代謝路徑13個基因上調(diào)，10個基因下調(diào)；鞘脂類代謝路徑2個基因上調(diào)，11個基因下調(diào)（表4）；油菜素內(nèi)酯生物合成路徑4個基因上調(diào)，3個基因下調(diào)（表5）；類黃酮生物合成路徑6個基因上調(diào)，2個基因下調(diào)；苯并惡唑嗪類生物合成和苯乙烯類、二芳庚酸類、姜酚類生物合成通路也富集到較多差異基因，分別有7個和5個基因下調(diào)表達?；诓煌x通路中基因上下調(diào)比例，推斷核糖體、植物激素信號轉(zhuǎn)導、鞘脂類代謝這些基因下調(diào)表達較多的路徑可能與葉片發(fā)育，尤其是窄葉的形成密切相關。

Size代表圓點的大小，表示富集到該GO條目基因的數(shù)量，q-value表示該GO條目的富集程度，顏色越趨近于紅色表示富集程度越高。下同

圖4 差異表達基因顯著富集的細胞組分

表3 差異表達基因顯著富集的代謝通路

植物內(nèi)源激素廣泛參與到葉片發(fā)育過程，對葉片形態(tài)建成起到一定調(diào)節(jié)作用。進一步分析植物激素信號轉(zhuǎn)導路徑發(fā)現(xiàn)，在葉寬形成的關鍵部位檢測到大量參與激素信號響應和轉(zhuǎn)導的差異基因，涉及生長素、油菜素內(nèi)酯、細胞分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯、茉莉酸等多種激素（圖6）。分析不同響應路徑（表5和圖6）發(fā)現(xiàn)，生長素信號轉(zhuǎn)導通路富集到18個差異基因，有12個響應基因表達上調(diào)；油菜素內(nèi)酯信號響應路徑富集到6個差異基因，全部下調(diào)表達；細胞分裂素響應路徑富集的3個基因，表達均上調(diào)；赤霉素和水楊酸響應通路分別富集到1個差異基因，表達均上調(diào)；脫落酸路徑富集到8個基因下調(diào)表達，4個上調(diào)表達基因；乙烯路徑中4個基因上調(diào)表達，4個基因下調(diào)表達；茉莉酸路徑中1個基因上調(diào)表達，7個基因下調(diào)表達。

表4 鞘脂類代謝路徑及其相關基因

FC：表達量差異倍數(shù)（NL409/WB665）

FC：Differential multiple of expression (NL409/WB665)

圖5 差異表達基因顯著富集的分子功能

2.3 熒光定量PCR驗證RNA-Seq結(jié)果

研究表明多種轉(zhuǎn)錄因子參與葉細胞分化及葉片形態(tài)建成，如YABBY、MADS類轉(zhuǎn)錄因子決定葉原細胞命運向不同方向分化形成不同組織，GRF類調(diào)控特定部位細胞的增殖和生長；ARF、SBP、TCP、Myb、HB類調(diào)控葉細胞的分化和維管的形成；同時ARF、ARR、GRAS類在葉片發(fā)育過程分別參與生長素、細胞分裂素、赤霉素信號的響應和生物合成，影響葉片形態(tài)建成。為了進一步驗證RNA-Seq結(jié)果的準確性，選取與葉片發(fā)育密切相關的18個不同的基因進行了qRT-PCR定量分析。對qRT-PCR與RNA-Seq結(jié)果進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)兩者的相關系數(shù)2=0.962，說明RNA-Seq結(jié)果良好。

3 討論

3.1 葉片發(fā)育密切相關的代謝通路

多條路徑顯著富集到大量與玉米葉片發(fā)育相關的基因。擬南芥（）和（）分別編碼不同亞族的核糖體蛋白（PRS），與rRNA形成蛋白復合物促進葉片近軸組織的建立[20-21]。本文核糖體路徑顯著富集到多個和（電子附表1），并鑒定出玉米（）啟動子區(qū)域存在顯著差異（電子附圖1），其在窄葉中下調(diào)表達的作用模式（圖7）與擬南芥、缺失突變導致葉柄變長、葉片變窄的作用機理相似。鞘脂類（Sphingolipid）是細胞膜骨架及脂蛋白的重要組成成分，鞘脂代謝在細胞生長、不同功能細胞分化、細胞內(nèi)以及細胞間信號傳遞發(fā)揮重要作用，鞘脂合成紊亂含量較低時，能夠激活MAPK（mitogen-activated protein kinase）路徑和轉(zhuǎn)錄因子AP1（APETALA1），進而調(diào)控細胞增殖、分化[22-23]。抑制擬南芥花萼葉和莖葉形成，（）能夠解除的抑制作用，促進葉片發(fā)育[24]。本文鞘脂代謝路徑富集到的基因大部分下調(diào)表達（表4），類和MAPK類基因表達上調(diào)（表4），表達下調(diào)（表4），與窄葉發(fā)育受抑制的表型一致。研究人員分析葉片發(fā)育的動態(tài)轉(zhuǎn)錄組學，不僅發(fā)現(xiàn)大量激素信號基因，細胞壁合成前體、纖維素合成酶、蛋白酶體、翻譯后修飾基因也被大量檢測到[25]。Bolduc等[9]解析調(diào)控網(wǎng)絡，不僅在葉片和分生組織中發(fā)現(xiàn)大量激素合成和響應基因，而且富集到脂類代謝、次生代謝、細胞壁合成和調(diào)控RNA轉(zhuǎn)錄相關的基因。葉片發(fā)育過程不同部位、不同時期的蛋白質(zhì)組學分析，也富集到大量的尿苷二磷酸-葡糖基/葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、細胞壁前體、細胞壁受體激酶、纖維素合成酶和RNA轉(zhuǎn)錄相關的基因[26]，本文顯著富集的路徑與前人的研究結(jié)果一致。由此可知，上述顯著富集的代謝通路（表3）與葉片發(fā)育密切相關，這些代謝路徑中的基因可能參與葉寬、葉長的形態(tài)建成。

Tryptophan metabolism：色氨酸代謝；Auxin：生長素；Ubiquitin mediated proteolysis：泛素介導的蛋白水解；Cell enlargement：細胞增大；Plant growth：植物生長；Zeatin biosynthesis：玉米素的生物合成；Cytokinine：細胞分裂素；Cell division：細胞分裂；Shoot initiation：根的起始；Diterpenoid biosynthesis：二萜類化合物的生物合成；Gibberellin：赤霉素；Stem growth：莖的生長；Induced germination：誘導萌發(fā)；Carotenoid biosynthesis：類胡蘿卜素的生物合成；Abscisic acid：脫落酸；Stomatal closure：氣孔閉合；Seed dormancy：種子休眠；Cysteine and methionine metabolism：半胱氨酸和蛋氨酸代謝；Ethylene：乙烯；Endoplasmic reticulum(ER)：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；Fruit ripening：果實成熟；Senescence：衰老；Brassinosteroid biosynthesis：油菜素內(nèi)酯生物合成；Brassinosteroid：油菜素甾醇；Proteasomal degradation：蛋白酶體降解；Cell elongation：細胞伸長；Alpha-Linolenic acid metabolism：α-亞麻酸代謝；Jasmonic acid：茉莉酸；Monoterpenoid biosynthesis類單萜生物合成；Indole alkaloid biosynthesis：吲哚生物堿生物合成；Stress response：應激反應；Phenylalanine metabolism：苯丙氨酸代謝；Salicylic acid：水楊酸；Disease resistance：抗病性。紅色表示富集到的差異基因表達上調(diào)，綠色表示基因下調(diào)Red indicates that DEGs are up-regulated, and green indicates down-regulation of DEGs

表5 植物激素信號轉(zhuǎn)導路徑相關基因

FC：表達量差異倍數(shù)（NL409/WB665）；BR：油菜素內(nèi)酯Brassinosteroid；CTK：細胞分裂素Cytokinine；GAs：赤霉素信號Gibberellin signaling；GAmrg：赤霉素代謝相關基因Gibberellin metabolism related genes

圖7 RNA-Seq與qRT-PCR結(jié)果比較

本研究發(fā)現(xiàn)油菜素內(nèi)酯信號轉(zhuǎn)導路徑顯著富集的基因全部下調(diào)（表5），不僅檢測到前人已研究表達量降低的BZR類和BRI類基因[9]，還發(fā)現(xiàn)BR路徑中BSK類、TCH類基因也下調(diào)表達。生長素信號轉(zhuǎn)導路徑富集到的基因大部分上調(diào)表達（表5），其中ARF（GRMZM2G078274、GRMZM2G030710和GRMZM5G874163）、AUX-IAA（GRMZM2G104176、GRMZM2G077356、GRMZM2G079957、GRMZM2G074427）和Auxin transporter（GRMZM2G127949）在調(diào)控葉片發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[9]。此外，高表達時，抑制GA信號及葉基部細胞的生長[25]，本文DELLA家族蛋白（GRMZM2G013016）在近基部窄葉中高表達（表5，圖6），且赤霉素代謝相關的基因幾乎全部下調(diào)表達（表5），這與窄葉發(fā)育受抑制的結(jié)果一致。由此推斷油菜素內(nèi)酯、生長素、赤霉素在葉片發(fā)育過程發(fā)揮重要作用。

3.2 不同激素途徑發(fā)掘的葉形重要功能基因

植物器官發(fā)育過程中極性建立是器官形態(tài)建成的核心。葉片的發(fā)育起始于葉原基細胞的分裂增殖，伴隨著一系列特定基因的精確調(diào)控，葉原基建立多維空間的極性軸向，促使葉原基細胞朝特定的方向分化增殖，并最終影響葉片的形態(tài)和大小。

TCP類轉(zhuǎn)錄因子通過AUX、BR、GA、CTK等多種激素調(diào)控葉片、花發(fā)育以及植株形態(tài)建成等生長過程。葉片發(fā)育過程可調(diào)控影響擬南芥葉片及植株形態(tài)，而BRI是發(fā)揮功能所必需的；此外，多個負向調(diào)控葉片邊緣區(qū)細胞分化增殖，其中、分別負調(diào)控、和、影響生長素分布及含量[9,27-28,31]。過量表達TCP II型基因()使西紅柿和擬南芥的葉片變小，或表現(xiàn)卷曲葉[27-28]，擬南芥的同源基因/（AC205574.3_FG006）在窄葉中上調(diào)表達的作用模式（圖7，電子附表1）與前人研究結(jié)果一致。因此，推測/可能影響多種激素調(diào)控玉米葉片發(fā)育。

激素BR可影響玉米葉片形態(tài)建成。編碼一種細胞色素P450蛋白，作用于葉片縱向極性細胞的伸長生長，其功能缺失影響擬南芥葉柄變短，葉片變大變寬[29]，擬南芥BR合成相關的P450家族和突變后影響葉細胞變短變少[30-31]。（VIVIPAROUS1）、（VP1/ABI3-LIKE）、（Related to ABI3/VP1）、（Related to ABI3/ VP1-Like）分別編碼不同的B3結(jié)構(gòu)DNA結(jié)合蛋白，擬南芥缺失突變后影響葉片變小且赤霉素含量降低[32]，作為BR受體負向調(diào)控擬南芥蓮座葉的生長[33]，與本文中下調(diào)和表達上調(diào)（電子附表2），以及赤霉素路徑基因下調(diào)表達的結(jié)果一致（表5）。通過E-box（CACCTG/ CACGTG/CACATG）結(jié)合位點激活BR響應和合成基因的表達，維持BR平衡對生長的調(diào)節(jié)作用[34-35]，本文中BR響應基因的啟動子區(qū)域存在大量該元件（電子附圖4—9），說明植物激素BR與葉片發(fā)育密切相關。此外，（GRMZM2G143235）和（GRMZM2G344521）在葉寬形成的關鍵部位上調(diào)表達（圖7），且位于已定位的葉寬區(qū)間內(nèi)[36]，同時啟動子區(qū)域的序列差異（電子附圖2），表明和可能在葉長和葉寬發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，由此推測BR通過某種途徑影響玉米葉長、葉寬的形成。

生長素合成、分布異常影響葉片形態(tài)。玉米與水稻（）和（）同源，、、和編碼一種生長素合成酶，調(diào)控葉原基的形成，其功能缺失突變影響葉細胞的分裂和維管束的形成，導致水稻葉片變窄[37-40]，與本文在窄葉中下調(diào)表達（圖7）的作用模式一致。編碼一種AGO7型蛋白，是合成ta-siARF所必需的，通過ta-siARF調(diào)控的轉(zhuǎn)錄，影響玉米葉片腹背面生長素分布，導致突變體葉片變窄卷曲[41]。此外，位于葉寬研究的熱點區(qū)域[4]，而且其啟動子區(qū)域序列存在顯著差異（電子附圖3）。由此可知，（GRMZM2G480386）、e（GRMZM5G892991）可能通過影響生長素調(diào)控窄葉的形成。

玉米葉片發(fā)育過程大量與生長素相關的基因參與其形成。玉米的ChIP分析富集大量生長素AUX-IAA和ARF基因，轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)生長素基因（、）在玉米葉細胞朝不同功能區(qū)生長的過渡區(qū)上調(diào)表達[9]，與本研究中、（圖7）表達結(jié)果一致。擬南芥受葉原基近軸端特異表達tasiR-ARF的抑制，在近軸端不表達，在遠軸端（）與、相互作用的同時，影響、和表達上調(diào)，促進葉原細胞的分化及遠軸組織的形成[42-43]；miR165/166抑制HD-ZIP lll類基因、在葉原基遠軸端的表達，促進近軸組織的形成[44]。、和（圖7）位于已定位的葉寬位點內(nèi)[4,36]。此外，、、（圖7）分別受miR167、miR164、miR166調(diào)控并且與葉長、葉寬位點顯著相關[36]，由此可知（GRMZM2G017709）、（GRMZM5G874163）、（GRMZM2G175827）、（GRMZM2G078274）、（GRMZM2G055585）、（GRMZM2G029692）在葉片發(fā)育過程可能發(fā)揮特定作用。

植物激素間的的相互作用可調(diào)節(jié)葉片發(fā)育。BR信號路徑中的BIN2激酶能夠磷酸化ARF2，導致其結(jié)合Auxin響應元件的功能喪失，影響擬南芥葉片等器官增大[45-46]，同時BR能夠誘導BZR1靶基因的表達[47]。與相互作用促進擬南芥下胚軸變長[48]。Auxin能夠誘導擬南芥表達，同時通過BR路徑促進細胞分裂生長[49]。此外，Auxin還可促進表達，加強BR信號轉(zhuǎn)導，而擬南芥通過影響生長素促進細胞膨大生長[27]，ARF能夠特異結(jié)合Auxin響應元件（TGTCTC）[50]，本文BR響應基因啟動子富含該元件（電子附圖4—電子附圖9），而且BR響應基因全部下調(diào)，Auxin響應基因上調(diào)（表5，圖7），這暗示本文中（GRMZM2G030710）、（GRMZM2G078274）（GRMZM2G065635）（GRMZM2G15877）（表5，電子附表1）可能介導Auxin和BR的平衡來調(diào)節(jié)植物器官以及葉片的發(fā)育。

HB類轉(zhuǎn)錄因子包含多個KNOX、bHLH和HD-ZIP lll基因。（）和屬于KNOX家族，在頂端分生組織特定表達，調(diào)控細胞分化向膨大生長的過渡，影響葉片多維空間的發(fā)育，尤其在基部-末端軸向的形成過程中，與、、相互作用調(diào)控葉片發(fā)育[9]。KNOX蛋白能夠促進細胞分裂素（CTK）合成基因上調(diào)，同時抑制GA3和GA20氧化酶合成，促進SAM細胞分裂形成葉原基[9,51-52]；提高GA含量可以解除DELLA對葉片發(fā)育的抑制作用[52]。與本文中KNOX家族基因（和）（圖7）、CTK路徑基因（表5）、DELLA基因上調(diào)（表5），GA氧化酶基因下調(diào)（表5）影響葉片變窄的結(jié)果一致。GA可通過DELLA蛋白負向調(diào)控CTK響應基因進而影響CTK變化[53]。擬南芥GA信號的抑制因子SPY（SPINDLY）能夠正向調(diào)控CTK促進植株及葉片的發(fā)育[54]。由此可知（GRMZM2G017709）和（GRMZM2G433591）可能通過影響細胞分裂素與赤霉素的平衡參與玉米窄葉的形成。

生長調(diào)節(jié)因子GRF的互作因子AN3/GIF1作為葉片發(fā)育過程的調(diào)節(jié)開關，主要影響葉細胞橫向分裂，分析其調(diào)控機理，在葉片基部分裂區(qū)富集到大量上調(diào)表達的GRF基因，在葉部伸長區(qū)僅發(fā)現(xiàn)和高量表達，其他GRF基因在葉部伸長區(qū)表達量逐漸降低，過量表達和使玉米葉片變小[13-14]，與本文中檢測到（GRMZM2G041223）和（GRMZM2G018414）在窄葉葉片發(fā)育的過渡區(qū)域上調(diào)表達（圖7）的趨勢一致，同時和位于葉寬研究的熱點區(qū)域[4]。（GRMZM2G143235）編碼一種TGA結(jié)合域的堿性亮氨酸拉鏈蛋白，主要在SAM和葉片與葉鞘連接處表達，作用于葉基部葉耳、葉舌的形成，影響葉片的發(fā)育[55]。ZmARF2（GRMZM2G082836）是ADP核糖基化轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控擬南芥葉面積和株高[56]。由此推斷、、、（圖7）在玉米葉片發(fā)育以及葉寬形成過程中可能發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論

明確了一些與玉米葉片發(fā)育密切相關的代謝路徑，發(fā)現(xiàn)植物激素間的動態(tài)平衡對葉片發(fā)育有著重要影響，尤其是Auxin與BR、CKT與GA之間的相互作用對調(diào)控葉片形態(tài)可能發(fā)揮重要作用。

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Explore Regulatory Genes Related to Maize Leaf Morphogenesis Using RNA-Seq

GUO ShuLei1,2, LU XiaoMin1, QI JianShuang1, WEI LiangMing1, ZHANG Xin1, HAN XiaoHua1, YUE RunQing1, WANG ZhenHua1, TIE ShuangGui1, CHEN YanHui2

(1Cereal Crops Institute, Henan Academy of Agricultural Sciences/Henan Provincial Key Lab of Maize Biology, Zhengzhou 450002;2College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450046)

【】Leaf shape characteristics are one of important agronomic traits that determine plant morphology and affect planting density. However, the molecular mechanism related to leaf shape remain unknown in maize. Here, transcriptome sequencing technology was used to screen and explore genome-wide analysis of regulatory genes and metabolic pathways involved in leaf morphogenesis. This study will lay the foundation for further understanding the regulator mechanism of leaf development in plant and identifying candidate genes of leaf shapes, such as leaf width and leaf length.【】Extreme narrow-leaf inbred line NL409 and wide-leaf line WB665 were selected as the experimental materials. By RNA-Seq technology, the differentially expressed genes (DEGs) of the seventh leaf base between these two lines were identified during the 7th leaf stage. Furthermore, metabolic pathways closely related to leaf development were also analyzed using a series of bioinformatics analysis. qRT-PCR was used to validate the expression level of DEGs in different hormone pathways, and the further promoter analysis were performed to explore leaf-shape functional genes.【】By analyzing the high-throughput sequencing in WB665 and NL409, a total of 5 199 DEGs were obtained at the primary section of leaf width formation. Of which, 2 264 (43.55%) genes were up-regulated, whereas down-regulated genes were significantly more than up-regulated genes with 2 935 (56.45%) decreased genes. GO enrichment analysis showed that these DEGs were mainly enriched in cell membrane-associated function terms of cellular components, including metabolic process and cell stimulus response. KEGG enrichment analysis showed that these DEGs were mainly involved in ribosome, plant hormone signal transduction, sphingolipid metabolism pathways, phenylpropanoid biosynthesis, glyoxylate and dicarboxylate metabolism and other processes. among which ribosome, plant hormone signal transduction, sphingolipid metabolism pathways with more down-regulated genes were closely related to leaf development. One of PRS (PRESSED FLOWER) family genes, which were enriched in the ribosomal pathway in this study,PRS13 (PFL2) was identified to participate in regulating the development of narrow leaves. The expression pattern of genes enriched in sphingolipid metabolism pathway and its related MAP kinase, AP1-like, and LFY-like were consistent with the result of the inhibited development of narrow leaves. Notably, all of BR (Brassinosteroid) response genes and most of GA (Gibberellin) metabolic genes were down-regulated in plant hormone signal transduction pathway, while the expression level of all the CTK (Cytokinine) response genes and Auxin genes are mostly increased. The action of up-regulated expression of DELLA protein gene affecting the GA and CTK pathways was consistent with the phenotypic result of narrow leaves. Eighteen genes were validated by qRT-PCR. The result showed that the expression trend was consistent with the transcriptome data. Moreover, the BR-related, auxin-related,and TCP-like transcription factorswere identified to be closely associated with the formation of narrow leaves.【】Summarily, this study unveils several metabolic pathways closely related to leaf development in maize, and find the dynamic balance between plant hormones plays an important role in leaf development, especially the interaction between Auxin and BR as well as CTK and GA.

maize (); leaf width; leaf length; RNA-Seq; morphogenesis; regulatory gene

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.01.001

2019-05-20；

2019-07-11

中國博士后科學基金（2017M612404）、河南省科技攻關計劃項目（182102110122）、河南省農(nóng)業(yè)科學院優(yōu)秀青年科技基金

郭書磊，E-mail：guosl1309@163.com。通信作者王振華，E-mail：wzh201@126.com。通信作者鐵雙貴，E-mail：tieshuangg@126.com。通信作者陳彥惠，E-mail：chy9890@163.com

（責任編輯 李莉）