邵歡歡， 鄧家波， 吳林峰， 牛李麗， 余建秋， 譚雪梅*

(1. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川省分子生物學(xué)及生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610065； 2. 四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都610101； 3. 成都動(dòng)物園，成都610081)

豚鹿Axisporcinus隸屬于偶蹄目Artiodactyla鹿科Cervidae斑鹿屬Axis(Maxwelletal.，2006)，多棲息于草地平原、沿海草地、白茅叢、森林、山地等地帶(Abbasetal.，2016)。世界自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)瀕危物種紅色名錄將豚鹿列為瀕危(EN)等級(jí)(Timminsetal.，2015)。豚鹿主要分為2個(gè)亞種：豚鹿印支亞種A.p.annamiticus和豚鹿指名亞種A.p.porcinus，分布于中國(guó)的主要是印支亞種(Maxwelletal.，2006)。目前國(guó)內(nèi)僅成都動(dòng)物園、北京動(dòng)物園和上海動(dòng)物園有圈養(yǎng)的豚鹿，其中，成都動(dòng)物園有71頭(截至2019年6月)，數(shù)量占我國(guó)圈養(yǎng)豚鹿總數(shù)的80%以上。因此，復(fù)壯豚鹿種群是當(dāng)前最緊迫的事情。但圈養(yǎng)豚鹿的幼仔存活率很低，2006—2011年成都動(dòng)物園的豚鹿一共產(chǎn)仔51胎，存活20胎，存活率僅39%，天氣寒冷及母鹿的棄仔行為是引起幼仔死亡的一個(gè)重要因素，肺炎是導(dǎo)致豚鹿幼體死亡的直接原因(鄧家波等，2011)。疾病已經(jīng)嚴(yán)重影響豚鹿幼仔的存活，進(jìn)而嚴(yán)重影響豚鹿種群的發(fā)展。

主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)基因是與動(dòng)物對(duì)疾病抗性或易感性密切相關(guān)的多基因家族，在脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)中起核心作用(Kelleyetal.，2005)。MHC分子決定了機(jī)體對(duì)病原體(抗原分子)的識(shí)別，從而影響機(jī)體對(duì)疾病的易感性以及自身免疫性(Stewartetal.，2004)。MHC多樣性水平的降低可導(dǎo)致種群內(nèi)個(gè)體對(duì)突發(fā)性傳染性病原體的易感性增高，導(dǎo)致種群抗病能力單一、生存力下降(O’brien & Yuhki，1999)。研究結(jié)果表明，MHC的多態(tài)性主要集中在編碼多肽結(jié)合區(qū)的第2個(gè)外顯子上，該外顯子可能通過與外來抗原的互作，影響抗原遞呈過程的識(shí)別與被識(shí)別的特異性。有關(guān)MHC基因外顯子2的多態(tài)性研究主要集中在DQB、DRB基因等(Nikbakhtetal.，2012；Heetal.，2014；Amaikeetal.，2018)。MHC-DOA基因是MHC Ⅱ類區(qū)域內(nèi)的非經(jīng)典基因，主要參與外源性抗原的加工及MHC Ⅱ類分子的折疊(Gelhaus & F?rster，2001)。

對(duì)中國(guó)豚鹿MHC-DOA基因外顯子2的遺傳多態(tài)性的研究迄今尚未見報(bào)道。本研究采用PCR和克隆測(cè)序技術(shù)，對(duì)成都動(dòng)物園圈養(yǎng)的38頭豚鹿的MHC-DOA基因外顯子2進(jìn)行了檢測(cè)，并評(píng)估其遺傳多樣性，以期保護(hù)與開發(fā)利用豚鹿遺傳資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品使用成都動(dòng)物園圈養(yǎng)的1頭成年豚鹿的抗凝血提取總RNA。另取22頭豚鹿的抗凝血，4頭豚鹿的凍存血液和12頭死亡豚鹿的肌肉組織樣品(凍存于液氮)，提取DNA。

1.1.2 主要試劑總RNA提取試劑盒Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen；DNA快速提取試劑盒TIANcombi DNA Lyse & Det PCR Kit購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；PCR酶和M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自TaKaRa；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Fermentas；所有抗生素均購(gòu)于青島生工生物科技有限公司；大腸桿菌EscherichiacoliJM109(本實(shí)驗(yàn)室保存)，基因型：endA1 glnV44 thi-1 relA1 gyrA96 recA1 mcrB+Δ(lac-proAB) e14-[F’ traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15]hsdR17(rK-mK+)，用于DNA克隆。PCR克隆用pMD18-T載體，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 豚鹿MHC-DOA基因克隆引物設(shè)計(jì)與合成：參照豚鹿血液轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank登錄號(hào)：SAMN12097782)中MHC-DOA基因序列，利用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)1對(duì)引物：5’-GTGCCTGTATTTCTCTGGAGGCTC-3’和5’-TGCAGGGGCTGGGTCTTTG-3’。根據(jù)豚鹿MHC-DOA基因序列，設(shè)計(jì)外顯子2的引物：5’-TCCTACGGACCAGCCTTCTACC-3’和5’-GTGCGGTTGGAGCGCTTC-3’，均由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。血液總RNA的提?。豪肨rizol法提取總RNA，提取和純化按照Invitrogen試劑盒推薦方法進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA：cDNA第一鏈的合成使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，以豚鹿血液的總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)錄體系中加入RNase OUTTM核酸酶抑制劑(40 U/μL)1 μL，輕輕將各成分混合，37 ℃ 2 min；加入1 μL(200 U)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶；37 ℃ 50 min；70 ℃ 15 min。然后冰上冷卻，得到的cDNA溶液可直接用于第二鏈cDNA的合成或者PCR擴(kuò)增等。MHC-DOA基因擴(kuò)增：以第一鏈合成產(chǎn)物cDNA為模板，使用KOD FX高保真酶擴(kuò)增MHC-DOA基因，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，61 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min 30 s，共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物使用rTag酶在72 ℃反應(yīng)30 min進(jìn)行加A反應(yīng)，片段純化后在18 ℃過夜連接T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽(yáng)性克隆送至深圳華大基因公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.2 豚鹿MHC-DOA基因序列分析根據(jù)測(cè)序得到的豚鹿MHC-DOA基因序列，使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST進(jìn)行基因及蛋白序列同源比對(duì)，使用DNAMAN將13種動(dòng)物，包括白尾鹿Odocoileusvirginianustexanus、東歐馬鹿Cervuselaphushippelaphus、山羊Caprahircus、野羊Ovisariesmusimon、綿羊Ovisaries、羊駝Vicugnapacos、美洲草原野牛Bisonbisonbison、印度牛Bosindicus、野牦牛Bosmutus、抹香鯨Physetercatodon、印度水牛Bubalusbubalis、長(zhǎng)江江豚Neophocaenaasiaeorientalisasiaeorientalis、西亞駱駝Camelusbactrianus的MHC-DOA蛋白序列與豚鹿比對(duì)，分別使用ProtParam、NPS@和Swiss-model進(jìn)行MHC-DOA蛋白的一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)蛋白結(jié)構(gòu)分析；利用Clustal W比較13個(gè)物種的MHC-DOA蛋白序列。系統(tǒng)進(jìn)化樹利用MEGA 5.0構(gòu)建；信號(hào)肽使用Signal IP 4.1 Server進(jìn)行預(yù)測(cè)；跨膜結(jié)構(gòu)分析使用TMpred；磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)使用NetPhos 3.1。

1.2.3 豚鹿MHC-DOA外顯子2克隆DNA提取及電泳檢測(cè)：取不少于25 mg豚鹿肌肉組織，用液氮研磨成粉末狀。使用TIANcombi DNA Lyse & Det PCR Kit提取總DNA，使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。MHC-DOA外顯子2擴(kuò)增：以提取的豚鹿DNA樣品為模板，使用rTag酶擴(kuò)增DOA基因的外顯子2序列，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物與T載體連接，挑選陽(yáng)性克隆，送至深圳華大基因公司測(cè)序。總共挑選120個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序分析。每條序列在2個(gè)或2個(gè)以上克隆序列完全一致時(shí)才被認(rèn)為是可靠的，可用于后續(xù)的結(jié)果分析。

1.2.4 豚鹿MHC-DOA基因外顯子2多態(tài)性分析將測(cè)序得到的DOA外顯子2的核酸序列使用DNAMAN和Multalin(http：//multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)進(jìn)行比對(duì)分析，檢測(cè)核苷酸變異位點(diǎn)，使用DNAMAN和ExPASy的Translate tool(https：//web.expasy.org/translate/)統(tǒng)計(jì)分析核苷酸序列，同時(shí)輔以人工統(tǒng)計(jì)及校對(duì)。將發(fā)生變異的核苷酸序列和蛋白序列與豚鹿種群的生存狀態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，使用GraphPad Prism 6進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 豚鹿MHC-DOA基因序列分析

對(duì)MHC-DOA基因進(jìn)行擴(kuò)增，電泳檢測(cè)在750 bp左右有明顯條帶，與預(yù)期大小一致。結(jié)果表明，豚鹿的MHC-DOA基因有2種單倍型，一種單倍型在295 bp發(fā)生了堿基的改變。MHC-DOA基因長(zhǎng)度為753 bp，編碼250個(gè)氨基酸殘基(GenBank登錄號(hào)：MN125544)。豚鹿DOA序列與其他13種動(dòng)物的同源性為84.4%～98.4%，其中，與東歐馬鹿的最高(98.4%)(圖1)。

圖1 豚鹿與其他物種MHC-DOA蛋白序列的比對(duì)
Fig. 1 Alignment of deduced amino acids sequences ofAxisporcinusMHC-DOA gene with other species

東歐馬鹿Cervuselaphushippelaphus(OWK06998.1)、 白尾鹿Odocoileusvirginianustexanus(XP_020763773.1)、 豚鹿印支亞種Axisporcinusannamiticus、 山羊Caprahircus(XP_013829269.1)、 野羊Ovisariesmusimon(XP_011967514.1)、 綿羊Ovisaries(XP_004018791.1)、 羊駝Vicugnapacos(XP_006202267.2)、 美洲草原野牛Bisonbisonbison(XP_010846888.1)、 抹香鯨Physetercatodon(XP_007107928.1)、 印度牛Bosindicus(XP_019840798.1)、 野牦牛Bosmutus(XP_005891446.1)、 印度水牛Bubalusbubalis(XP_006050360.1)、 長(zhǎng)江江豚Neophocaenaasiaeorientalisasiaeorientalis(ALB25551.1)、 西亞駱駝Camelusbactrianus(XP_010947407.1)

2.2 DOA蛋白生物信息學(xué)分析

MHC-DOA蛋白分子量為27.84 kD，理論等電點(diǎn)7.04，脂肪系數(shù)為93.52，親水性值為0.023，因此DOA是一個(gè)疏水性蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，MHC-DOA蛋白包含α螺旋7個(gè)氨基酸，占2.8%；β折疊77個(gè)氨基酸，占30.8%；無規(guī)則卷曲166個(gè)氨基酸，占66.4%。磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果表明MHC-DOA蛋白可能具有26個(gè)磷酸化位點(diǎn)，這表明MHC-DOA蛋白可能參與了多種信號(hào)傳遞過程。信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，MHC-DOA蛋白在1～25 bp有明顯的信號(hào)肽，這也與MHC-DOA蛋白作為分泌蛋白在血液中發(fā)揮免疫功能相一致。跨膜結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)MHC-DOA具有2個(gè)由外到內(nèi)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域：128～148和225～242。

2.3 MHC-DOA蛋白進(jìn)化樹分析

MHC-DOA蛋白進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，豚鹿MHC-DOA蛋白與東歐馬鹿的親緣關(guān)系最近(圖2)，該結(jié)果與同源性比對(duì)結(jié)果一致。

2.4 豚鹿基因外顯子2測(cè)序和多態(tài)性分析

38頭豚鹿MHC-DOA基因外顯子2測(cè)序結(jié)果顯示，豚鹿MHC-DOA外顯子2全長(zhǎng)221 bp，其中，T為24.9%，C為25.3%，A為21.3%，G為28.5%。共有10種等位基因，其中，DOA1等6個(gè)克隆為c.306 C>G，DOA4和DOA43為c.295 T>A，DOA2等18個(gè)克隆沒有發(fā)生改變，DOA9等5個(gè)克隆為c.306 C>T，DOA62為c.305-307delC，DOA64和DOA68為c.304-306delG，DOA13為c.163 G>C；164 A>C；181-182insC，DOA5為c.165 A>T；167 A>G；224-226delC，DOA39為c.163 G>A；167 A>G；170 T>C；188 A>T；188-190delG；231 G>C，DOA7為c.163 G>A；c.164 A>G；c.166 C>T；c.167 G>A；c.169 C>T；c.171 T>C；c.173 C>G；188 A>T；188-190delG；190 A>T；203 T>A；212 C>A；224-226delC；226 T>G；229 G>A；230 C>G；232 C>T；243 G>C；244 C>T；246 G>T；249 C>T；299 A>g；303 C>T；307 A>T；308 A>T。以上10種單倍型分別用HT01～HT10表示，其中DOA5、DOA39、DOA62、DOA64、DOA68缺失了1個(gè)核苷酸，DOA7缺失了3個(gè)核苷酸，DOA13插入了1個(gè)核苷酸(圖3)。這些核苷酸的插入或缺失引起DOA蛋白序列提前終止，導(dǎo)致氨基酸序列發(fā)生改變。

物種信息同圖1

The information of species are the same as fig.1

圖3 豚鹿MHC-DOA外顯子2的多態(tài)性Fig. 3 Polymorphism of DOA exon 2 in Axis porcinus

2.5 豚鹿MHC-DOA基因外顯子2序列多樣性與致病性分析

對(duì)38頭MHC-DOA基因?qū)?yīng)的豚鹿個(gè)體的譜系進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)生缺失1個(gè)核苷酸，導(dǎo)致移碼突變及翻譯提前終止的5頭個(gè)體中，有4頭豚鹿早死或幼年病死，這表明MHC-DOA基因核苷酸缺失造成的蛋白質(zhì)序列改變或功能缺失，可能會(huì)引起豚鹿個(gè)體的死亡；而缺失3個(gè)核苷酸的1頭豚鹿則正常生長(zhǎng)，這可能因其雖然發(fā)生了核苷酸缺失，但是并未引起后續(xù)蛋白的移碼突變；有1頭豚鹿的MHC-DOA基因插入了1個(gè)核苷酸，但是仍正常生存；有2頭豚鹿的MHC-DOA蛋白在第98位氨基酸發(fā)生了改變，從賴氨酸變?yōu)榧琢虬彼?，但是這2頭豚鹿都沒有出現(xiàn)早死或者病死的情況，這表明第98位氨基酸的改變可能對(duì)豚鹿的影響不大。對(duì)該豚鹿群體的MHC-DOA基因的10個(gè)單倍型頻數(shù)與其致死性進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，致病性與單倍型頻率間的t檢驗(yàn)雙尾P值為0.624 8，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而相關(guān)性單尾P值為0.092 4，這說明豚鹿MHC-DOA的致病性與其單倍型之間無顯著相關(guān)性(表1)。

表1 10種豚鹿MHC-DOA單倍型在種群中的分布頻率Table 1 Frequency distribution of 10 MHC-DOA haplotypes in Axis porcinus population

3 討論

MHC基因的多態(tài)性水平被認(rèn)為與種群抗病能力和生存力密切相關(guān)(Danchinetal.，2004)。目前，已經(jīng)有許多研究報(bào)道證明了人類、山羊、綿羊、牛等的MHC-DQA、MHC-DQB等基因的外顯子2的多態(tài)性及其與疾病的關(guān)聯(lián)性(Lietal.，2011；Nikbakhtetal.，2012；Xietal.，2014)。

MHC-DOA基因是MHC Ⅱ家族中的一個(gè)重要基因，MHC-DOA蛋白由4條肽鏈組成：2條α肽鏈和2條β肽鏈(Solletal.，2010)。MHC-DOA和MHC-DM在B細(xì)胞中參與抗原的遞呈，因此推測(cè)MHC-DOA蛋白在抗原識(shí)別和免疫中發(fā)揮重要的作用(Hedrick，2002；Ballingalletal.，2010；Xiangetal.，2013)。

38頭豚鹿的MHC-DOA外顯子2序列包含了30多個(gè)變異位點(diǎn)及10種單倍型，推測(cè)成都動(dòng)物園圈養(yǎng)的豚鹿整體遺傳多樣性水平中等。其中，有6頭豚鹿的MHC-DOA外顯子2的單倍型發(fā)生單核苷酸缺失、插入移碼突變。有1種單倍型發(fā)生3個(gè)單核苷酸缺失，導(dǎo)致MHC-DOA外顯子2發(fā)生 20個(gè)氨基酸殘基的改變。推測(cè)豚鹿MHC-DOA的致病性與其單倍型之間存在較顯著的相關(guān)性。但結(jié)果顯示各單倍型頻率與致病性之間的差異不顯著，這可能與本研究所取動(dòng)物樣品數(shù)量少有關(guān)，且含有多種單倍型的豚鹿僅1～2頭。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，有6頭豚鹿的MHC-DOA外顯子2單倍型發(fā)生單核苷酸缺失或插入移碼突變，這可以確定為有害單倍型。在圈養(yǎng)豚鹿的繁殖中，建議將攜帶有害單倍型的個(gè)體從繁殖體系中剔除。通過建立DOA基因的分子標(biāo)簽，對(duì)豚鹿進(jìn)行分子體檢，提前對(duì)其進(jìn)行保護(hù)和疾病預(yù)防。本研究為豚鹿的種群遺傳結(jié)構(gòu)調(diào)查、疾病關(guān)聯(lián)分析和遺傳平衡保護(hù)提供一定的幫助。