李仕澤， 劉京， 徐寧， 魏剛， 王斌

(1.茅臺學院食品科學與工程系，貴州仁懷564500； 2. 貴陽學院， 貴州省生物多樣性與應用生態(tài)學特色 重點實驗室，貴陽550005； 3.中國科學院成都生物研究所，成都610041)

湍蛙屬AmolopsCope， 1865物種廣泛分布于喜馬拉雅山脈東部和南部，東至中國大陸東南部，南至馬來半島，目前該屬已報道59種(Frost，2019)，我國分布32種，貴州省記錄的湍蛙屬物種3種，即水城湍蛙A.shuichengicusLyu & Wang， 2019、崇安湍蛙A.chunganensis(Pope，1929)和華南湍蛙A.ricketti(Boulenger，1899)。水城湍蛙僅分布在貴州水城(Frost，2019)，崇安湍蛙僅分布在貴州雷山和江口(費梁等，2012；魏剛等，2017)，華南湍蛙在貴州大部分地區(qū)均有分布(伍律等，1986)。

2015年7月，在貴州梵凈山國家級自然保護區(qū)(108°35′19″E，27°55′8″N，海拔1 032 m)采集到2號雄性湍蛙屬標本；2018年7月，在貴州雷公山國家級自然保護區(qū)(108°20′24″E，26°20′59″N，海拔686 m)采集到1號湍蛙屬蝌蚪標本，2018年8月，采集到1號雌性湍蛙屬標本。經(jīng)形態(tài)比較和分子系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定為中華湍蛙A.sinensisLyu， Wang， and Wang， 2019，為貴州省湍蛙屬新記錄。本研究對貴州分布的中華湍蛙進行了詳細形態(tài)學描述，對該物種的蝌蚪形態(tài)特征進行了首次描述，并對貴州省湍蛙屬物種的分布進行了厘定，為該物種的系統(tǒng)學和譜系地理學研究提供了新信息。

1 材料與方法

1.1 材料

4號標本取肌肉組織保存于95%的乙醇中(表1)。標本浸泡于福爾馬林溶液，保存于中國科學院成都生物研究所(CIB)。

1.2 形態(tài)鑒定與測量

對3號成體標本及1號蝌蚪標本用游標卡尺測量形態(tài)特征，精確到0.01 mm。蝌蚪分期依據(jù)Gosner(1960)的方法，測量依據(jù)《中國兩棲動物檢索及圖鑒》(費梁等，2005)。

1.3 分子生物學及分子系統(tǒng)學方法鑒定

采用高鹽法提取肌肉樣品總DNA。利用PCR擴增并測定了線粒體COⅠ基因部分片段。擴增引物參照Che等(2012)的Chmf4(5’-TYTCWACWAAYCAYAAAGAYATCGG-3’)和Chmr4(5’-AC-YTCRGGRTGRCCRAARAATCA-3’)。30 μL PCR反應體系：15 μL mix，上、下游引物各1 μL，基因組DNA 1 μL，滅菌水12 μL。PCR反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物分別用上、下游引物測序，所得序列上傳到GenBank(表1)。

1.4 分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系重建

下載GenBank中湍蛙屬部分物種和蛙科Ranidae部分相近物種的COⅠ基因序列，結(jié)合本文序列，進行分子系統(tǒng)發(fā)育分析(表1)。所有序列在Clustal X 1.8(Thompsonetal.，1997)中進行比對，采用默認配置，比對后的序列進行人工校對。系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建采用最大似然法(maximum likelihood，ML)。構(gòu)建ML樹前，利用jModeltest 2(David，2008)基于AIC標準選擇最適核苷酸替代模型。ML樹的構(gòu)建在PhyML 3.0(Guindonetal.，2012)中完成，并進行1 000次bootstrap重抽樣分析，檢驗各節(jié)點置信度。

表1 樣品信息表Table 1 Samples and the GenBank accession numbers of COⅠ gene sequences

注Note：*模式產(chǎn)地type locality

1.5 遺傳距離

用MEGA 6.0(Tamuraetal.，2013)的Kimura雙參數(shù)模型計算表1所列湍蛙屬物種間的遺傳距離。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學分析結(jié)果

比較了貴州采集的湍蛙標本和文獻所列湍蛙屬物種的形態(tài)鑒定特征，發(fā)現(xiàn)本研究采集的標本形態(tài)特征與中華湍蛙模式產(chǎn)地標本相符：雄蛙體長56.1～58.0 mm，雌蛙體長51.8 mm，其他部位量度見表2。頭體扁平，頭寬大于頭長，吻端鈍圓，吻棱明顯，鼻孔位于吻眼之間，略近吻端。鼻間距大于眼間距，鼓膜小于第3指吸盤，位于眼后。顳褶顯著，自眼后角經(jīng)鼓膜背緣到肩胛部。犁骨齒發(fā)達，位于內(nèi)鼻孔之間。舌后端缺刻深。

表2 貴州中華湍蛙標本形態(tài)量度Table 2 Morphological measurements of Amolops sinensis specimens collected from Guizhou province

前肢長，指長順序為1<2<4<3，指端具吸盤，前緣有橫溝，關(guān)節(jié)下瘤顯現(xiàn)，第2、3、4指指基下瘤明顯，掌突2，位于第2指基部和掌心，大而扁平。指間無蹼。后肢長，后肢貼體前伸時，脛跗關(guān)節(jié)達眼，左右跟部重疊，趾端均具吸盤和橫溝，關(guān)節(jié)下瘤明顯，趾間全蹼，第1、5趾游離側(cè)具緣膜，內(nèi)蹠突長圓形，無外蹠突。

皮膚粗糙，背部散有痣粒，體側(cè)疣粒大而多?？诮呛蠖擞?～2個頜腺。雄蛙上頜緣有小白刺，腹部光滑有細粒，胸腔上部及咽部有黑色斑。

生活時背面有黃綠色和褐色相間的斑紋。四肢背面有深色橫紋，股部4～5條，脛部5～6條。兩眼前角間有一白點。頜腺略帶黃色。腹面乳白色。

雄蛙第1指基內(nèi)緣有乳白色婚墊，婚墊上具婚刺，無聲囊及雄性線。

1號蝌蚪標本(標本號：CIBLS20180717001)處于發(fā)育階段第32期，全長36.1 mm、頭體長12.9 mm、頭寬10.4 mm、吻長6.0 mm、眼間距3.7 mm、吸盤寬8.2 mm、尾長23.0 mm、尾寬4.2 mm、尾高6.5 mm、吻至出水孔距離12.0 mm。生活時體背面灰色，腹面乳白色，吻端圓，體扁；鼻孔近眼，眼位于頭背側(cè)，出水孔位于左側(cè)，游離管較長，肛孔開口于尾基腹面中央?？趯挻?，位于頭腹面，口后有一大吸盤，吸盤橫徑大于口寬；上、下唇進口角處有唇乳突，唇齒式為Ⅲ∶1+1/1+1∶Ⅱ (圖1：E、F)。

2.2 分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和遺傳距離

PCR擴增共獲得中華湍蛙線粒體COⅠ基因序列 3條，長度573 bp。序列中保守位點354個，簡約信息位點191個，T、C、A、G含量分別為32.5%、25.8%、25.5%、16.2%，A+T含量高于G+C含量。本文所用最適核苷酸替代模型為GTR+G+I。ML樹顯示，貴州梵凈山和雷公山所采的湍蛙標本與中華湍蛙模式產(chǎn)地(廣東省英德市)的標本聚合構(gòu)成單系(圖2)，且有較高的支持率(99%)?；贙imura雙參數(shù)模型估算的湍蛙屬部分物種間的遺傳距離(表3)表明，本研究中所采用的湍蛙屬物種間的遺傳距離為6.5%～25.0%，平均遺傳距離為13.5%；貴州所采湍蛙標本與中華湍蛙模式產(chǎn)地標本間的遺傳距離為1.2%，遠小于湍蛙屬物種間的遺傳距離。分子系統(tǒng)發(fā)育分析和遺傳距離結(jié)果均支持采集于貴州梵凈山和雷公山的湍蛙標本為中華湍蛙。

2.3 生境描述

中華湍蛙在貴州梵凈山國家級自然保護區(qū)和貴州雷公山國家級自然保護區(qū)內(nèi)主要分布于海拔600～1 100 m的山間水流較為湍急的河流，常棲于河流內(nèi)石頭上或河邊樹枝上(圖1：G)。與其同域分布的兩棲類有棘指角蟾Megophrysspinata、棘腹蛙Quasipaaboulengeri、武陵瘰螈Paramesotritonwulingensis、大綠臭蛙Odorranagraminea和黃崗臭蛙Odorranahuanggangensis。

圖1 貴州中華湍蛙及生境Fig. 1 Amolops sinensis and its habitat in Guizhou province

A. 背面觀(♂)， B. 腹面觀(♂)， C. 背面觀(♀)， D. 腹面觀(♀)， E. 蝌蚪背面觀， F. 蝌蚪腹面觀， G. 梵凈山生境

A. dorsal view (♂)， B. ventral view (♂)， C. dorsal view (♀)， D. ventral view (♀)， E. dorsal view of tadpole， F. ventral view of tadpole， G. habitat ofA.sinensisin the Fanjingshan National Nature Reserve

3 討論

Boulenger(1899)將福建省武夷山的2號湍蛙標本定名為華南湍蛙，此后相繼在中國南方、印度支那北部和中部報道了此物種的分布(費梁等，2012；Frost，2019)。分子系統(tǒng)學的發(fā)展極大地提高了人們對隱存種的識別能力(Funketal.，2012)。被鑒定為華南湍蛙的白刺湍蛙AmolopsalbispinusSung， Hu， Wang， Liu， and Wang， 2016、逸仙湍蛙AmolopsyatseniLyu， Wang， and Wang， 2019和中華湍蛙均為隱存種。華南湍蛙分布廣泛，是否還存在隱存種需進一步研究。

華南湍蛙在貴州省廣泛分布于印江、松桃、雷山、貴定、都勻、綏陽、赤水和石阡等地區(qū)(伍律等，1986)。本文基于形態(tài)比較和分子系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，分布于貴州省梵凈山和雷公山原鑒定為華南湍蛙的物種應為中華湍蛙，為貴州省湍蛙屬物種新記錄。印江、松桃、赤水和石阡同屬武陵山脈，雷山、都勻和貴定屬苗嶺山脈，因此推測分布于這些地區(qū)的此前被鑒定為華南湍蛙的湍蛙物種可能為中華湍蛙，而綏陽屬于大婁山脈，因此分布于該地區(qū)的華南湍蛙是否應為中華湍蛙或為湍蛙屬隱存種還需進一步研究。

中華湍蛙梵凈山及雷公山種群與模式產(chǎn)地廣東英德種群相比，在形態(tài)上，梵凈山及雷公山種群雄蛙個體較大(雄蛙頭體長58.1～58.0 mm)，而模式產(chǎn)地種群的雄蛙頭體長40.2～46.5 mm；后肢貼體前伸時，脛跗關(guān)節(jié)僅達眼，而模式產(chǎn)地種群后肢貼體前伸時，脛跗關(guān)節(jié)達吻端；在分子上2個種群間成單系，遺傳距離為1.2%，說明2個種群間已產(chǎn)生分化。從地理分布上看，中華湍蛙貴州種群分布于武陵山脈和苗嶺山脈，中華湍蛙的模式產(chǎn)地廣東省處于南嶺山脈最南端，中間隔以雪峰山及苗嶺。中華湍蛙貴州種群與模式產(chǎn)地種群在形態(tài)及分子上存在一定差異的原因是否由長期的地理隔離造成，還需進一步研究。

圖2 基于線粒體COⅠ基因序列構(gòu)建的湍蛙屬最大似然系統(tǒng)發(fā)育樹
Fig. 2 Maximum likelihood tree forAmolopsconstructed based onCOⅠgene sequences

支上的數(shù)字代表重抽樣支持率； CIBFJS20150717005、CIBLS20180804003、CIBLS20180717001為本研究中貴州所采樣品編號， 其余物種序列信息見表1

Numbers beside nodes indicate bootstrap values； CIBFJS20150717005， CIBLS20180804003 and CIBLS20180717001 are the samples collected in this study (Guizhou province)； the sequence information of other species are shown in table 1

表3 基于線粒體COⅠ基因計算本研究中的湍蛙屬物種間Kamura-2-parameter距離Table 3 COⅠ gene sequence-based genetic distance analysis of 11 Amolop species examined in this study

注：*來自貴州湍蛙屬物種樣品

Note：*Amolopsspecies were from Guizhou province