涂洪梅， 周闖， 王冠楠， 成美玲， 岳碧松， 孟楊

(四川大學生命科學學院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，成都610065)

大熊貓Ailuropodamelanoleuca是全球生物多樣性保護的旗艦物種(Weietal.，2012)。由于受到人類人口擴張和棲息地喪失、破碎化等的影響，大熊貓的生存面臨嚴重威脅(Huangetal.，2015)。近幾十年來，我國為保護這一珍稀物種采取了一系列的保護措施，使得全國大熊貓種群得以逐漸復壯。全國第四次大熊貓數量調查顯示，截止2014年底，野生大熊貓數量為1 864只，與第三次調查相比增長了16.8%(唐小平等，2015)。如今大熊貓棲息地存在不同程度的破碎化，野生大熊貓種群被進一步分割，部分小種群還面臨著滅絕的風險，大熊貓的生存狀況不容樂觀，因此對大熊貓的保護及遺傳多樣性研究仍是重點(青菁，2016)。

微衛(wèi)星標記稱為簡單重復序列(simple sequence repeats，SSRs)或短串聯(lián)重復序列，由核心序列和側翼序列組成，其中核心序列由1～6 bp核苷酸序列組成，在真核生物基因組中分布廣泛。微衛(wèi)星標記多態(tài)性含量豐富、易檢測、小片段或者降解的DNA都能因含有足夠的微衛(wèi)星而進行PCR擴增，同時微衛(wèi)星的檢測在種間、種外都能進行(張正義等，2017)。作為分子生物學中最常用的一種遺傳標記(Maetal.，2004；Selkoe & Toonen，2006)，微衛(wèi)星分子標記被廣泛應用于物種鑒定、群體遺傳學和遺傳圖譜的研究(Huangetal.，2015；修云芳等，2015；Wangetal.，2016)。二代測序(next-generation sequencing，NGS)技術又被稱為高通量測序，近年來應用十分廣泛，使用二代測序技術開發(fā)微衛(wèi)星標記的研究日趨增多。傳統(tǒng)的微衛(wèi)星分子標記開發(fā)方法，如DNA文庫篩選和利用親緣物種跨種擴增等往往耗時長、數量少、工作量大。與傳統(tǒng)方法相比，使用NGS篩選微衛(wèi)星分子標記成本更低、效益更高(Zhengetal.，2013；Liuetal.，2017)。因此，高通量測序由于其高效性迅速成為開發(fā)DNA分子標記的首選(岳華梅等，2016)。

從GenBank下載大熊貓完整基因組，使用本實驗室自主開發(fā)的Krait(Duetal.，2017)對基因組中微衛(wèi)星序列進行搜索和統(tǒng)計。結合本實驗室已測得的6只大熊貓轉錄組數據，使用CandiSSR(Xiaetal.，2016)對基因組和轉錄組中多態(tài)性微衛(wèi)星進行對比與篩選。CandiSSR是一種能快速有效地進行多態(tài)性微衛(wèi)星篩選的軟件，能夠基于多個組裝序列鑒定出具有多態(tài)性的微衛(wèi)星。本研究根據CandiSSR鑒定出的大熊貓基因組中的多態(tài)性微衛(wèi)星，并挑選其中評分較為理想的20個，提取25只大熊貓血液DNA為模板進行PCR擴增，將擴增產物送至成都擎科梓熙生物科技有限公司分型并分析結果，驗證所選位點的多態(tài)性及其他遺傳參數。本研究結果開發(fā)了更多優(yōu)良微衛(wèi)星位點，為大熊貓種群遺傳學的進一步研究提供了資源。

1 研究方法

1.1 基因組中的微衛(wèi)星統(tǒng)計分析

GenBank下載大熊貓全基因組(AilMel_1.0)。微衛(wèi)星的檢索標準分別限定為單堿基重復12次以上，二堿基重復7次以上，三堿基重復5次以上，四、五和六堿基重復4次以上，這與之前使用Krait進行研究的方法一致(Qietal.，2015；Xuetal.，2016)。在本研究中，重復單位模式為循環(huán)排列和/或反向互補的被歸類為一種SSR類型。例如，AGC模式由AGC、GCA、CAG、GCT、TGC和CTG組成(Jurka & Pethiyagoda，1995)。

1.2 RNA-seq數據分析

采集6只大熊貓個體的RNA-seq數據。使用FastQC(https：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc)對reads進行質控，使用Cutadapt(Martin，2015)去除接頭序列和較低質量reads(Phred score<20)。使用Trinity(Haasetal.，2013)在默認參數下對clean reads進行組裝，保留長度超過200 bp的轉錄本進行分析。采用CD-HIT-EST(Li & Godzik，2006)刪除帶有默認參數的冗余序列，并使用UniGenes發(fā)現微衛(wèi)星標記。

1.3 多態(tài)性微衛(wèi)星檢測及引物設計

基于本實驗室已組裝好的6只大熊貓的轉錄組序列文件和從GenBank下載的大熊貓全基因組序列，使用CandiSSR(Xiaetal.，2016)檢索多態(tài)性微衛(wèi)星并由此設計引物。從篩選結果中選擇20個多態(tài)性二堿基微衛(wèi)星位點，用于25個大熊貓血液DNA樣品的多態(tài)性驗證。每個引物對(表4)的正向引物在5’-末端用FAM熒光染料標記進行基因分型分析。

1.4 樣品采集和DNA提取

25只大熊貓個體的血液樣本來自成都大熊貓繁育研究基地。使用DNA Extraction Kit(Tsingke，北京)試劑盒，并按照說明書從血液樣品中提取基因組總DNA。以提取的基因組DNA為模板進行PCR擴增。

1.5 PCR條件和擴增

PCR反應體系為20 μL：2.5 μL 10×Taq緩沖液，1.0～3.0 μL dNTP(各2.5 mmol·L-1)，各引物1 μL(10 mmol·L-1)，0.2 μL ExTaq聚合酶(5 U·mL-1；TaKaRa，日本)，基因組總DNA約200 ng作為模板。PCR反應程序為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55～63 ℃ 30 s，72 ℃ 12 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，10 ℃保存。

1.6 基因分型

所有樣品的基因分型檢測在成都擎科梓熙生物科技有限公司進行?；蚍中蜁r將每個熒光引物擴增的產物單獨放在一條泳道里電泳分型。所有樣品的基因分型在ABI 3730 DNA Analyzer上進行，使用GeneMapper 4.0檢測各樣本等位基因數，等位基因大小相對于分子內標GS500LIZ決定。

1.7 微衛(wèi)星數據分析

使用CERVUS(Marshalletal.，1998)計算等位基因數、觀察雜合度、期望雜合度和多態(tài)信息含量(polymorphic information content，PIC)。使用GENEPOP(Raymond & Rousset，1995)計算哈迪-溫伯格平衡和連鎖不平衡的偏差。作為衡量多態(tài)信息含量的指標，PIC>0.50為高度多態(tài)性位點，0.25

2 結果

2.1 微衛(wèi)星類型和豐度

Krait搜索和統(tǒng)計結果顯示，在大熊貓的基因組中，不完美的微衛(wèi)星是最常見的類型，共有3 177 509個，相對豐度為1 415.17 loci/Mb，相對密度為40 727.66 bp/Mb。其次是完美微衛(wèi)星，數量最少的是復合型微衛(wèi)星，只有53 787個，相對豐度為23.96 loci/Mb，相對密度為980.90 bp/Mb(表1)。完美微衛(wèi)星的數量、長度、相對豐度和相對密度如表2所示。6種完美微衛(wèi)星總數為879 113個，總長度為15 386 054 bp。其中最常見的類型是單堿基微衛(wèi)星，有415 846個，且長度最長，達到了6 176 980 bp，最高豐度為185.21 loci/Mb，最高密度為2 751.06 bp/Mb，占基因組微衛(wèi)星總數的47.30%。其次是二堿基微衛(wèi)星，占微衛(wèi)星總數的25.74%。而三堿基、四堿基和五堿基微衛(wèi)星較少，六堿基微衛(wèi)星則最少，僅占微衛(wèi)星總數的0.34%。在大熊貓基因組中前10個最常見的重復單元是(A)n、(AC)n、(AG)n、(AAAT)n、(AAAG)n、(AT)n、(C)n、(AAAC)n、(AAGG)n和(AAT)n。

表1 大熊貓基因組3種類型微衛(wèi)星統(tǒng)計Table 1 The number and frequency of 3 categories of microsatellites in the giant panda genome

表2 大熊貓基因組中完美型微衛(wèi)星分布概況Table 2 The summary of perfect microsatellite types in the giant panda genome

2.2 多態(tài)性微衛(wèi)星位點篩選

CandiSSR分析結果顯示，從大熊貓轉錄組與基因組中共篩選出326個多態(tài)性微衛(wèi)星，其中二堿基最多，占69.94%，共228個。三、四、五、六堿基所占比例分別為9.51%、14.11%、5.21%、1.22%。本研究根據標準差、缺失率以及序列長短等因素，選出20個二堿基微衛(wèi)星用于后續(xù)的多態(tài)性評估驗證(表3)。

2.3 多態(tài)性微衛(wèi)星位點驗證

選出的20個微衛(wèi)星位點能夠在25只大熊貓個體的血液DNA中成功擴增。每個位點的等位基因數為2～8。觀察雜合度為0～1.00，平均值為0.472，期望雜合度為0.280～0.784，平均值為0.532。使用Bonferroni校正后，有4個微衛(wèi)星位點顯著偏離哈迪-溫伯格平衡(P<0.01)，20個微衛(wèi)星位點未觀察到顯著的連鎖不平衡(P>0.01)。20個位點多態(tài)信息含量為0.246～0.734，其中具有高度多態(tài)性的位點9個(PIC>0.50)，11個位點呈中度多態(tài)性(0.25

3 討論

轉錄組平臺的構建在很大程度上推動了DNA分子標記的開發(fā)。近年來利用轉錄組數據獲得含有微衛(wèi)星的序列，并對其進行遺傳多樣性的研究在國際上已有很多成功報道(Tianetal.，2014；Xiaoetal.，2015)，而利用微衛(wèi)星標記進行野生大熊貓遺傳多樣性分析從2001年就已開始(Luetal.，2001)。在二代測序技術廣泛應用之前，開發(fā)微衛(wèi)星標記的方法較多，比較常用的方法包括構建DNA文庫篩選法、小片段DNA克隆法、富集法、利用親緣物種篩選等。Shen等(2005)利用Dynal磁珠法篩選了37對大熊貓微衛(wèi)星引物，Wu等(2008)使用富集法篩選出33個微衛(wèi)星位點，Li等(2010)通過構建DNA文庫法篩選出7個穩(wěn)定的四堿基微衛(wèi)星位點。這些位點的篩選與標記開發(fā)在一定程度上可以用于大熊貓種群遺傳多樣性評估、遺傳結構分析等相關研究。由于部分微衛(wèi)星位點擴增不穩(wěn)定，在使用糞便或者毛發(fā)等樣本提取的DNA擴增效果不好時就限制了這些位點的應用。隨著測序成本的降低及測序平臺通量的不斷擴大，利用二代測序技術對基因組進行隨機測序即可獲得海量的微衛(wèi)星序列。與傳統(tǒng)微衛(wèi)星標記開發(fā)相比，二代測序技術對樣品的處理和使用簡單、處理速度快、通量高，能在較短時間內開發(fā)出數量多且類型豐富的微衛(wèi)星。目前利用二代測序技術對微衛(wèi)星位點進行篩選與開發(fā)也越來越多(Ritchieetal.，2016；李薇等，2017；宋琪等，2019)。

表3 20個多態(tài)性微衛(wèi)星參考信息Table 3 Reference indicators of 20 polymorphic microsatellite loci

表4 20個微衛(wèi)星位點遺傳特征Table 4 Characterization of 20 microsatellite loci isolated

本研究對大熊貓基因組中的微衛(wèi)星序列進行搜索和統(tǒng)計，使用的是本實驗室開發(fā)的Krait：一種用于全基因組微衛(wèi)星調查和引物設計的超快工具(Duetal.，2017)。該軟件是在2013年本實驗室開發(fā)的微衛(wèi)星搜索及統(tǒng)計軟件MSDB(Duetal.，2013)基礎之上進行開發(fā)的，有著更強大的功能。Krait可以很容易地用于篩選微衛(wèi)星標記，用戶可以高效地設計用于微衛(wèi)星放大的引物。李午佼等(2014)曾使用MSDB分析了大熊貓基因組微衛(wèi)星的分布特征。研究表明，Krait比MSDB搜索檢測速度更快、更高效，能夠快速研究DNA序列中的微衛(wèi)星(Duetal.，2017)。對比2個軟件的分析結果，發(fā)現Krait不僅能快速篩選微衛(wèi)星標記，還能有效地檢測到更多微衛(wèi)星重復序列，在種類及豐度等分布特征的識別上更為準確。因此本研究使用Krait對大熊貓基因組中微衛(wèi)星序列進行檢測的結果是可信、可靠的。

到目前為止，也有較多的微衛(wèi)星標記成功用于野生大熊貓的種群遺傳多樣性分析(Heetal.，2008；Huetal.，2010)。據統(tǒng)計，目前公布的大熊貓的微衛(wèi)星標記共109種，其中超過60%是二堿基微衛(wèi)星(喬麥菊等，2019)。根據目前研究進展，用于野生大熊貓遺傳多樣性調查研究的微衛(wèi)星標記多，且存在差異，故無法進行統(tǒng)一的比較分析，未來關于大熊貓微衛(wèi)星標記的開發(fā)在穩(wěn)定實用的基礎上，應盡量統(tǒng)一標準。本研究中使用6只大熊貓的轉錄組數據與大熊貓基因組相結合，利用軟件篩選多態(tài)性微衛(wèi)星，共篩選出了326個多態(tài)性微衛(wèi)星，處理過程耗時短，減少了很多工作量。而從中挑選的20個微衛(wèi)星位點通過實驗驗證，顯示部分位點多態(tài)性較高，證明該方法是可行的，可以對后續(xù)位點篩選提供資源。

群體的遺傳多樣性主要表現在等位基因數、雜合度和多態(tài)信息含量3個方面(Senananetal.，2004)。本研究選取的20個位點中，高度多態(tài)性位點有9個，中度多態(tài)性位點有11個，其中，有4個顯著偏離哈迪-溫伯格平衡(P<0.01)。后續(xù)實驗可將這20個位點中多態(tài)性較高的位點選用糞便DNA進行擴增和其他參數的評估，篩選出能夠應用于野生大熊貓遺傳多樣性研究的微衛(wèi)星標記，為野生大熊貓種群的群體結構及遺傳研究提供一定的理論指導。

根據分析結果，本研究認為NGS是一種有效開發(fā)大熊貓微衛(wèi)星標記的方法。利用大熊貓的NGS序列數據可以開發(fā)大量的微衛(wèi)星標記。微衛(wèi)星分子標記的開發(fā)將有助于評估大熊貓的遺傳多樣性和種群結構，并制定有效的保護和管理策略。