戴宇樵，呂才有，何魯南，易超，劉學(xué)艷，黃雯，陳加敏

基于代謝組學(xué)的‘云抗10號(hào)’曬青茶加工過(guò)程代謝物變化

戴宇樵1,2，呂才有1，何魯南1，易超1，劉學(xué)艷1，黃雯1，陳加敏1

（1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤(rùn)普洱茶學(xué)院，昆明 650201；2貴州省茶葉研究所，貴陽(yáng) 550006）

【】基于代謝組學(xué)的超高相液相色譜/質(zhì)譜（LC-MS）聯(lián)用技術(shù)探究云南大葉種‘云抗10號(hào)’曬青茶加工過(guò)程中代謝產(chǎn)物的變化，發(fā)現(xiàn)影響曬青茶品質(zhì)形成的標(biāo)志性代謝物，并進(jìn)一步研究這些物質(zhì)的變化路徑，為了解云南曬青茶品質(zhì)形成機(jī)理奠定基礎(chǔ)。在制作‘云抗10號(hào)’曬青茶過(guò)程中，取‘云抗10號(hào)’鮮葉、揉捻葉、曬青葉各3組。樣品經(jīng)預(yù)處理后，運(yùn)用LC-MS檢測(cè)3組樣品中的代謝產(chǎn)物，利用質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其定性。運(yùn)用多元統(tǒng)計(jì)方法主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）對(duì)3組樣品檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。通過(guò)PLS-DA方法篩選差異顯著的代謝物。建立了‘云抗10號(hào)’鮮葉、揉捻葉和曬青葉的代謝物譜的LC/MS分析方法，將代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析和偏最小二乘法判別分析，并將3組樣品聚類區(qū)分。并用LC-MS技術(shù)對(duì)‘云抗10號(hào)’曬青茶及在制茶進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析，在鮮葉、揉捻葉、曬青葉之間發(fā)現(xiàn)差異代謝物701種，揉捻葉與鮮葉的差異顯著代謝物116種，曬青葉與鮮葉的差異顯著代謝物158種，曬青葉與揉捻葉的差異顯著代謝物48種。比對(duì)KEGG與MWDB數(shù)據(jù)庫(kù)分析代謝物，這些代謝物主要與氨基酸及其衍生物代謝、多酚物質(zhì)代謝等代謝途徑有關(guān)。利用LC-MS技術(shù)可以有效地對(duì)鮮葉組、揉捻葉組與曬青葉組進(jìn)行區(qū)分，證明代謝組學(xué)技術(shù)在一定程度上可以揭示曬青毛茶在加工過(guò)程中內(nèi)含代謝物的化學(xué)變化規(guī)律。研究發(fā)現(xiàn)的曬青毛茶品質(zhì)形成關(guān)鍵代謝物，可為曬青品質(zhì)的評(píng)價(jià)指標(biāo)體系建立提供理論依據(jù)。

LC-MS；曬青茶；云抗10號(hào)；代謝組學(xué)；代謝物

0 引言

【研究意義】普洱茶的原料是云南大葉種曬青茶[1]。曬青毛茶是將云南大葉種茶樹鮮葉經(jīng)過(guò)攤放、殺青、揉捻、日曬干燥制成的初加工茶，其中“日曬”這一過(guò)程對(duì)曬青茶獨(dú)特品質(zhì)特征的形成至關(guān)重要。傳統(tǒng)工藝的重要性不能只是體現(xiàn)在普洱茶成品的風(fēng)味上，還需要從更深度的機(jī)理方面去探究，了解云南大葉種曬青毛茶在曬青過(guò)程中內(nèi)含物質(zhì)的變化，是探索曬青茶品質(zhì)形成的重要途徑?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】隨著飲茶的生活習(xí)慣在人們?nèi)粘Ｉ钪性絹?lái)越普及，消費(fèi)者對(duì)茶葉的食品安全與品質(zhì)要求逐漸提高。隨著科學(xué)檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，檢測(cè)茶葉各方面指標(biāo)的方法也開始增多，從而能更好地提高茶葉品質(zhì)。植物代謝組學(xué)指在特定的生理時(shí)間內(nèi)，對(duì)某一植物組織或細(xì)胞的所有低分子量的代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性定量分析[2]。目前已有的代謝組學(xué)分析技術(shù)主要為氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用、高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用、核磁共振、毛細(xì)血管電泳技術(shù)等。代謝組學(xué)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于茶產(chǎn)業(yè)的多個(gè)環(huán)節(jié)中，可以用來(lái)更全面地了解茶葉從種植、加工、飲用過(guò)程中內(nèi)含物質(zhì)的變化規(guī)律，從而揭示茶葉特殊風(fēng)味的形成原理。茶葉加工對(duì)茶葉品質(zhì)形成來(lái)說(shuō)是一項(xiàng)重要環(huán)節(jié)，但要探索茶葉生產(chǎn)工藝與品質(zhì)的關(guān)系，常規(guī)檢測(cè)還不夠全面與深入。利用代謝組學(xué)技術(shù)可以進(jìn)一步探索茶葉加工過(guò)程中的物質(zhì)變化。研究證明，運(yùn)用近紅外光譜分析方法對(duì)武夷巖茶生產(chǎn)過(guò)程中的實(shí)際在線檢測(cè)應(yīng)用是可行的[3]。并且代謝組學(xué)技術(shù)能較全面地探究茶葉中特殊內(nèi)含物變化規(guī)律，如花青素、生物胺的變化規(guī)律[4-7]。運(yùn)用LC-MS可對(duì)普洱茶的風(fēng)味化合物、抗氧化活性以及儲(chǔ)存年份進(jìn)行鑒定[8-10]，也可通過(guò)對(duì)白茶內(nèi)含物的鑒定對(duì)白茶品質(zhì)進(jìn)行分級(jí)[11-12]。通過(guò)研究不同山頭普洱生茶的差異代謝物，運(yùn)用1H-NMR方法為普洱茶的品質(zhì)評(píng)價(jià)找到新思路[13]。目前，HPLC、NMR等方法都能進(jìn)行快速準(zhǔn)確且具有深度的茶葉內(nèi)含物質(zhì)測(cè)定[14-17]。GC-MS是目前最準(zhǔn)確、最全面的茶葉香氣檢測(cè)方法。試驗(yàn)證明HS-SPME/GC-MS技術(shù)能較好地鑒定茶葉中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[18]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】云南大葉種‘云抗10號(hào)’是云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所用單株育種法得到的品種，屬于喬木型茶樹[19]，具有產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)、抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性廣的特點(diǎn)，是云南省茶產(chǎn)業(yè)的主力軍[20]，常用來(lái)制作云南綠毛茶、紅茶等，用該品種制作成的曬青毛茶品質(zhì)具有一定的代表性。目前，關(guān)于普洱茶原料云南大葉種曬青茶的各方面研究都相對(duì)較少，探究曬青茶品質(zhì)形成原因的研究更加薄弱?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以LC-MS為研究手段，選取具有代表性的云南大葉種‘云抗10號(hào)’作為原料，探究從鮮葉采摘到曬青茶制成過(guò)程中內(nèi)含成分的變化規(guī)律，為曬青茶的品質(zhì)形成機(jī)理與優(yōu)化普洱茶加工工藝與品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018年11—12月在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤(rùn)普洱茶學(xué)院加工實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

試劑：乙醇、甲醇、乙腈（Mecrk）標(biāo)準(zhǔn)品：二甲基亞砜（DMSO）或甲醇作為溶劑溶解后，-20℃保存，質(zhì)譜分析前用70%甲醇稀釋成合適濃度（BioBioPha，Sigma-Aldrich），均為色譜純。

儀器：離心機(jī)（5424R 2 Eppendorf）（艾本德中國(guó)有限公司），真空冷凍干燥機(jī)（Labconco Freezone 2.5L-84），研磨機(jī)（MM 400，Retsch（德國(guó)RETSCH）），電炒鍋（6CCH-63型，富陽(yáng)市葉峰茶葉機(jī)械設(shè)備），超高效液相色譜（UPLC）（Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A）和串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）（Applied Biosystems 6500 QTRAP）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制作

地點(diǎn)：云南普洱茶樹良種場(chǎng)

流程：鮮葉（一芽二葉（55%）、一芽三葉（45%））攤青、殺青、手工揉捻、日光干燥。

1.2.2 樣品預(yù)處理 選取‘云抗10號(hào)’加工過(guò)程中鮮葉（YK10-1）、揉捻葉（YK10-2）、曬青葉（YK10-3）各3份；樣品真空冷凍干燥；研磨儀（MM 400，Retsch）研磨（30 Hz，1.5 min）至粉末狀；稱100 mg粉末溶于1.0 mL的提取液中；保存于4℃冰箱，過(guò)夜，渦旋3次提高提取率；離心（轉(zhuǎn)速10 000×，10 min）后，取上清液，微孔濾膜（0.22 μm）過(guò)濾，然后進(jìn)行LC-MS/MS分析。

1.2.3 LC-MS分析條件

超高效液相色譜（UPLC）和串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）。

液相條件：色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18；流動(dòng)相：水相，超純水（加入0.04%乙酸），有機(jī)相，乙腈（加入0.04%乙酸）；洗脫梯度：0 min為水/乙腈（95﹕5（V/V）），11.0 min為5﹕95（V/V），12.0 min為5﹕95 V/V，12.1 min為95﹕5 V/V，15.0 min為95﹕5 V/V；流速0.4 mL?min-1；柱溫40℃；進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜條件主要包括：電噴霧離子源，溫度500℃，質(zhì)譜電壓5 500 V，簾氣25 psi，碰撞誘導(dǎo)電離，參數(shù)設(shè)置為高。在三重四級(jí)桿中，每個(gè)離子對(duì)根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓（DP）和碰撞能（CE）進(jìn)行掃描檢測(cè)[21]。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用多元統(tǒng)計(jì)分析，基于OPLS-DA結(jié)果，從多變量分析OPLS-DA模型的變量重要性投影（variable importance in project，VIP）中初步篩選出不同樣品間差異代謝物，再通過(guò)組合單變量分析的值或差異倍數(shù)值來(lái)進(jìn)一步篩選差異代謝物。本試驗(yàn)中存在生物學(xué)重復(fù)，通過(guò)fold change和OPLS-DA模型的VIP值相結(jié)合的方法來(lái)篩選差異代謝物。篩選標(biāo)準(zhǔn)：選取fold change≥2（上調(diào)）和fold change≤0.5（下調(diào)）的代謝物。在上述基礎(chǔ)上，選取VIP≥1的代謝物，VIP值表示對(duì)應(yīng)代謝物的組間差異在模型中各組樣本分類判別中的影響強(qiáng)度，一般認(rèn)為VIP≥1的代謝物為差異顯著?；谏虡I(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)MWDB（metware database）及代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫(kù)，利用三重四級(jí)桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）分析完成代謝物定性。在獲得不同樣品的代謝物質(zhì)譜數(shù)據(jù)后，對(duì)所有物質(zhì)的質(zhì)譜峰進(jìn)行峰面積積分，并對(duì)不同樣品的相同代謝物質(zhì)譜進(jìn)行積分校正[22]。

2 結(jié)果

2.1 主成分分析

通過(guò)對(duì)樣本（包括質(zhì)控樣品）的主成分分析，初步了解各組樣本之間的總體代謝差異和組內(nèi)樣本之間的變異度大小[23]。其中MIX即上方提到的質(zhì)控樣本，PCA得分圖如下（圖1）。在PCA圖中，圖上任意一點(diǎn)表示一個(gè)對(duì)應(yīng)樣本。從圖中可以看出LC-MS分析所得原始數(shù)據(jù)在PC1、PC2兩種主成分中得到良好地呈現(xiàn)。在圖中，第一主成分的貢獻(xiàn)率為31.36%，第二主成分的貢獻(xiàn)率為29.19%，兩種主成分的貢獻(xiàn)率和為60.55%，代表兩個(gè)主成分能夠基本反映茶樣的主要特征信息。同時(shí)各組樣品與質(zhì)控樣品質(zhì)譜數(shù)據(jù)的PCA得分圖在圖上可見（圖2），左圖為不同主成分累計(jì)比例圖，右圖為不同主成分方差比例，每一點(diǎn)代表PC1至PC5，在左圖中，PC1對(duì)應(yīng)點(diǎn)與右圖PC1對(duì)應(yīng)點(diǎn)一致，PC2對(duì)應(yīng)點(diǎn)縱坐標(biāo)值為右圖中PC1貢獻(xiàn)率與PC2貢獻(xiàn)率之和，PC3對(duì)應(yīng)點(diǎn)縱坐標(biāo)值為右圖中PC1、PC2、PC3貢獻(xiàn)率之和，以此類推，左圖中PC5對(duì)應(yīng)縱坐標(biāo)值越接近于1，表示該P(yáng)CA模型越具有可靠性，右圖中可看出主成分貢獻(xiàn)率比較為PC1＞PC2＞PC3＞PC4＞PC5，由此也說(shuō)明選取PC1、PC2來(lái)分析樣本具有較好可靠性。從3組樣品的聚類熱圖分析（圖3）上看出，3組樣本區(qū)別明顯，組內(nèi)平行樣本成分接近，證明樣本的可靠性。

為了鑒別出具體有哪些差異代謝物造成了分離現(xiàn)象，建立‘云抗10號(hào)’鮮葉與揉捻葉之間、鮮葉與曬青葉之間、揉捻葉與曬青葉之間的3組PLS-DA模型。模型S圖如圖4所示，S圖能表示每個(gè)代謝物對(duì)于分組的貢獻(xiàn)率。橫坐標(biāo)為可變量，數(shù)據(jù)離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，該點(diǎn)對(duì)樣品的組間分離貢獻(xiàn)越大；縱坐標(biāo)為樣本之間的相關(guān)性，數(shù)據(jù)離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，樣本間的相關(guān)性越好。表1為模型評(píng)價(jià)參數(shù)，在這3組模型中，其中兩組R2Y和Q2的值均大于0.9（表1），其余一組R2Y與Q2值均大于0.3，說(shuō)明這3組模型構(gòu)建良好，預(yù)測(cè)性可靠。

圖1 各組樣品與質(zhì)控樣品質(zhì)譜數(shù)據(jù)的PCA得分圖

圖2 分組主成分分析可解釋變異圖

圖3 樣品總體聚類圖

表1 PLS分析的參數(shù)

2.2 差異代謝物篩選

通過(guò)PLS-DA分析后，根據(jù)VIP值＞1與上調(diào)代謝物fold change≥2和下調(diào)代謝物fold change≤0.5以及T檢驗(yàn)的相對(duì)變量分析結(jié)果篩選出顯著差異代謝物。在‘云抗10號(hào)’曬青茶的加工中，將其鮮葉、揉捻葉、曬青葉進(jìn)行分組，由圖5—7可看出鮮葉與揉捻葉差異代謝物116種、鮮葉與曬青葉差異代謝物158種，揉捻葉與曬青葉差異代謝物42種。統(tǒng)計(jì)出這3組對(duì)比的總差異代謝物180種，對(duì)總差異代謝物差異倍數(shù)值（FC）進(jìn)行歸一化處理，從圖8中可以看出3組對(duì)比FC值部分區(qū)分良好，差異代謝物種類區(qū)別明顯。從表2可看出，總差異代謝物的物質(zhì)種類與相對(duì)含量變化情況。在3組對(duì)比中均為差異代謝物的物質(zhì)有8種，分別有上調(diào)差異代謝物異櫻花亭，5-尿嘧啶核苷酸（5-UMP），6-C-己糖基-金圣草黃素O-己糖苷、7-甲基鳥嘌呤、白楊素C-己糖苷，磷脂酰膽堿酰基16﹕1/14﹕1，咖啡醛在揉捻過(guò)程中相對(duì)含量下降，可在曬青過(guò)程中顯著上升，最終的變化趨勢(shì)表現(xiàn)為上升，下調(diào)差異顯著代謝物有萜類物質(zhì)植保素D，黃酮碳糖苷物質(zhì)C-己糖苷-異鼠李素O-己糖苷。

2.3 茶葉中特殊成分的變化規(guī)律

茶葉中有效活性成分種類豐富，本研究主要探討兒茶素類、黃酮類、氨基酸、生物堿類物質(zhì)的相對(duì)含量變化規(guī)律。兒茶素類是茶葉中重要的活性物質(zhì)，在本次檢測(cè)中，所有的兒茶素類物質(zhì)從鮮葉到曬青葉的變化規(guī)律如表3所示，共檢測(cè)到兒茶素類14種，其中有71%呈下調(diào)趨勢(shì)，其余呈上調(diào)趨勢(shì)。且酯型兒茶素含量都呈顯著下降的。

圖中紅色表示VIP≥1的代謝物，綠色表示VIP＜1的代謝物

對(duì)于黃酮與黃酮醇物質(zhì)，選取其中曬青葉與鮮葉相對(duì)比VIP≥1的黃酮類差異代謝物，列出3組樣品中含量變化。從表4可以看出，槲皮素，山奈酚、丁香亭、白楊素等物質(zhì)的含量整體上呈大幅度增加趨勢(shì)，在差異顯著的黃酮類代謝物中僅有異鼠李素-3--新橙皮糖苷與芹菜素7--新橘皮糖苷（野漆樹苷）呈下調(diào)模式。

對(duì)于氨基酸及其衍生物類，選取其中曬青葉與鮮葉相對(duì)比VIP≥1的氨基酸類差異代謝物，列出3組樣品中的含量變化，從表5中可以看出茶葉中含有多種氨基酸，其中鮮葉中含量最多的是茶氨酸，本研究中檢測(cè)到茶氨酸隨著加工過(guò)程的進(jìn)行其含量顯著下降。本研究共檢測(cè)到8種生物堿物質(zhì)，且影響茶葉風(fēng)味的關(guān)鍵代謝物咖啡堿相對(duì)含量呈下調(diào)趨勢(shì)（表6）。

3 討論

本研究中，兒茶素類從鮮葉到曬青葉明顯下降，可能是因?yàn)閮翰杷匦再|(zhì)不穩(wěn)定，容易被多酚氧化酶氧化。當(dāng)鮮葉經(jīng)過(guò)攤青后，在失水與殺青的高溫作用下，其中的兒茶素可轉(zhuǎn)變?yōu)樗鼘?duì)應(yīng)的旋光異構(gòu)體或順反異構(gòu)體[24]。兒茶素還可以發(fā)生聚合反應(yīng)形成原花青素與花青素，這兩種物質(zhì)在本次反應(yīng)中也被檢測(cè)到。同時(shí)，兒茶素類物質(zhì)還可以與其他活潑的化合物（如多酚類物質(zhì)、維生素、茶氨酸等）發(fā)生聚合反應(yīng)。茶氨酸含量也發(fā)生了顯著下降，原因也可能是參與上述聚合反應(yīng)形成的。而咖啡酰原兒茶酸、原兒茶醛、4-甲基兒茶酚、二沒食子兒茶素這4種上調(diào)物質(zhì)，有可能是由于兒茶素內(nèi)部發(fā)生了聚合反應(yīng)，導(dǎo)致其中的咖啡酰原兒茶酸的含量明顯提升。也可能是與最終曬青過(guò)程中日光催化茶葉中的活性成分發(fā)生了反應(yīng)，并且下調(diào)代謝物（ECG、EGCG與三兒茶素）含量在揉捻葉中含量最多，在曬青葉中含量又降低，表明這些物質(zhì)在從鮮葉到揉捻葉的過(guò)程中遭到高溫的破壞，又在揉捻過(guò)程中反應(yīng)增多，最后在日光催化下轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌镔|(zhì)。

圖中一個(gè)點(diǎn)表示一種代謝物，橫坐標(biāo)為代謝物在兩樣品中定量差異倍數(shù)對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)為VIP值。綠點(diǎn)為下調(diào)差異表達(dá)代謝物，紅點(diǎn)為上調(diào)差異表達(dá)代謝物，灰色部分為檢測(cè)到但差異不顯著的代謝物。下同

圖6 YK10-1_vs_YK10-3差異代謝物火山圖

圖7 YK10-2_vs_YK10-3差異代謝物火山圖

圖8 3組處理對(duì)比FC值聚類熱圖

表2 差異代謝物種類與變化情況

表3 鮮葉、揉捻葉和曬青葉組間兒茶素類代謝物差異

表4 鮮葉、揉捻葉和曬青葉組間黃酮與黃酮醇類代謝物差異

表5 鮮葉、揉捻葉和曬青葉組間氨基酸及其衍生物類代謝物差異

表6 鮮葉、揉捻葉和曬青葉組間生物堿代謝物差異

本研究中部分黃酮類物質(zhì)在‘云抗10號(hào)’鮮葉中含量相對(duì)較低，然而經(jīng)過(guò)高溫殺青后，黃酮苷遇熱發(fā)生水解，苷類配基脫去，轉(zhuǎn)化黃酮或黃酮醇，可使苷類物質(zhì)的苦味降低[24]，這可能也是部分黃酮類物質(zhì)上調(diào)的原因。然而在光的作用下黃酮也會(huì)分解，也就造成了部分黃酮含量的下降。

茶氨酸從鮮葉到揉捻葉表現(xiàn)為上升，然而從揉捻葉到曬青葉其含量表現(xiàn)為下降，總趨勢(shì)為上調(diào)，但其中下降這一表現(xiàn)與前人研究的氨基酸變化規(guī)律相符[25]。在殺青過(guò)程中，大量葉綠素遇熱導(dǎo)致大量葉綠素蛋白降解，形成大量游離氨基酸[26]。在曬青過(guò)程中，茶氨酸含量顯著降低可能是因?yàn)椴璋彼嵩谌諘褡饔孟乱捉到鉃楣劝彼岷鸵阴０?，同時(shí)茶氨酸被酶氧化，與兒茶素形成茶色素，但總體趨勢(shì)的上升或許是因?yàn)椴璋彼岬哪蜔崮退嵝?，使其在高溫殺青與機(jī)械作用中未被破壞。對(duì)于遞減的氨基酸或許是因?yàn)樵诟邷貧⑶嗟倪^(guò)程中，氨基酸類與碳水化合物發(fā)生美拉德反應(yīng)生成黑色素并產(chǎn)生特殊的香味。其余大部分氨基酸相對(duì)含量均表現(xiàn)出遞增，包括γ-氨基丁酸。由此可見，在曬青茶中，茶葉中氨基酸類物質(zhì)大部分被很好的保留下來(lái)，使曬青茶具有獨(dú)特鮮爽的滋味與良好的保健功效。

本研究共檢測(cè)到8種生物堿物質(zhì)，其中甜菜堿相對(duì)含量最高，甜菜堿的學(xué)名為三甲基甘氨酸，參與滲透調(diào)節(jié)，與植物抗逆性相關(guān)，且外用具有護(hù)膚功效[27]。前人研究主要關(guān)注的咖啡堿、茶葉堿、可可堿也被檢測(cè)出，咖啡堿相對(duì)含量在鮮葉到揉捻葉再到曬青葉的加工過(guò)程中相對(duì)含量均下降，這與前人的研究結(jié)果相符[28]?？Х葔A具有苦味，且在后期加工過(guò)程中可與茶黃素以氫鍵締合形成具有鮮爽味的復(fù)合物[24]，可可堿相對(duì)含量在兩個(gè)品種中也均表現(xiàn)為下降，茶葉堿相對(duì)含量卻在曬青過(guò)程中增多并高于鮮葉中的含量。在今后的研究工作中，將進(jìn)一步找到多種關(guān)鍵物質(zhì)的變化途徑，研究其他品種曬青茶加工過(guò)程中的成分變化，與工藝相結(jié)合，探討加工過(guò)程中部分重要成分的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，更加深入地掌握曬青毛茶品質(zhì)形成的機(jī)理。

4 結(jié)論

本研究運(yùn)用超高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用的方法，對(duì)云南大葉種‘云抗10號(hào)’曬青毛茶及其制茶過(guò)程中的代謝物進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)此品種曬青茶在制作過(guò)程中內(nèi)含成分產(chǎn)生顯著變化，且檢測(cè)到在平時(shí)茶葉研究中關(guān)注較少的物質(zhì)相對(duì)含量變化十分顯著，如核苷酸及其衍生物、維生素、脂質(zhì)、苯甲酸衍生物等多種代謝物。這表明在曬青毛茶加工中的攤青、殺青、揉捻、日光干燥過(guò)程中，除了兒茶素、黃酮類與氨基酸以及衍生物與生物堿發(fā)生較大變化外，許多其他代謝物也受到高溫、氧化、物理機(jī)械等作用而發(fā)生反應(yīng)。

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Metabolic Changes in the Processing of Yunkang 10 Sun-Dried Green Tea based on Metabolomics

DAI YuQiao1,2, Lü CaiYou1, HE LuNan1, YI Chao1, LIU XueYan1, HUANG Wen1, CHEN JiaMin1

(1College of Long Run Pu-erh Tea, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201;2Guizhou Tea Institute, Guiyang 550006)

【】The ultrahigh phase liquid chromatography/mass spectrometry (LC-MS) combined technique of metabolomics was used to explore the changes of metabolites in the processing of sun-dried green tea ofcv. Yunkang 10, and to find the iconic metabolites affecting the formation of sun-dried green tea quality. Further study on the change path of these substances would lay a foundation for understanding the formation mechanism of sun-dried green tea quality. 【】In the process of making Yunkang 10 sun-dried green tea, 3 samples of fresh leaves, rolled leaves and sun-dried leaves were taken respectively. After the samples were pretreated, the metabolites in the three groups of samples were detected by LC-MS and identified by mass spectrometry database. Principal component analysis (PCA) and partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) were used to analyze the detection data of three groups of samples. Metabolites with significant differences were screened out by PLS-DA method. 【】LC-MS analysis method for the endogenous metabolites of Yunkang 10 fresh leaves, rolled leaves and sun-dried leaves was established, and commercial mass spectrometry database was used for rapid identification of the detected metabolites. The metabolome data were imported into SIMCA-P software for principal component analysis and partial least squares discriminant analysis, and the metabolome data could be used to distinguish the three groups of samples. By LC/MS technique on Yunkang 10 sun-dried green tea and its processing tea, in combination with multivariate statistical analysis, there were 701 kinds of metabolites were significant differences among the fresh leaves, rolling leaves and sun-dried leaves, and 116 kinds metabolites between fresh leaves and rolling leaves, 158 kinds of metabolites between sun-dried leaves and fresh leaves, and 48 kinds of metabolites between sun-dried leaves and rolling leaves were found. By searching KEGG database to analyze metabolites, these metabolites were mainly related to amino acid metabolism, polyphenol metabolism and other energy metabolism pathways. 【】LC-MS technique could be used to distinguish fresh leaf group, rolled leaf group and sun-dried leaf group of Yunkang 10, which proved that metabolomics technology could reveal the chemical changes of metabolites in sun-dried green tea to some extent. The key metabolites were found in the study could provide a theoretical basis for evaluating the quality of sun-dried green tea, and lay a theoretical foundation for exploring the formation of "sunburn taste" of sun-dried green tea and the formation mechanism of sun-dried green tea quality.

liquid chromatography/mass spectrometry; sun-dried green tea; Yunkang 10; metabolomics; metabolites

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.02.010

2019-04-18；

2019-10-09

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)茶葉產(chǎn)業(yè)體系專項(xiàng)資金資助（CARS-19）

戴宇樵，18985575397；E-mail：827927867@qq.com。通信作者呂才有，E-mail：2495846526@qq.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）