郭宴君，樊璐璐，何永吉，郭春絨，范曉軍

（1.山西農(nóng)業(yè)大學文理學院，山西太谷030801；2.太原理工大學環(huán)境科學與工程學院，山西太原030024；3.山西省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，山西太原030031）

在自然界中，木質(zhì)纖維素的含量非常豐富，作為可再生資源，它廣泛存在于蔬果廢物、木材木屑、紙漿廢物及草本作物中。據(jù)報道，我國每年約產(chǎn)玉米秸稈7億t[1]，而大多數(shù)玉米秸稈被焚燒，造成了嚴重的環(huán)境污染。乙醇是石油燃料的主要替代品之一，而用于發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的原料中木質(zhì)纖維素是最具有經(jīng)濟效益的一種原材料[2-4]?？衫媚举|(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇的細菌絕大部分都具有特殊性質(zhì)，據(jù)報道，現(xiàn)有包括真菌、細菌在內(nèi)的近200種微生物，可以降解木質(zhì)纖維素[5-6]。韓如等[7]對嗜熱細菌直接轉(zhuǎn)化纖維素產(chǎn)乙醇進行了探究，結(jié)果得出，以玉米秸稈為底物時乙醇產(chǎn)量在250～300 mg/L；ZIABREVA等[8]提出，乙醇產(chǎn)率受pH值的影響極大，合適的pH值甚至可以提高6倍左右的乙醇產(chǎn)率。

嗜熱細菌存在的生物技術(shù)潛力，從各種底物生產(chǎn)乙醇的能力以及某些物種降解木質(zhì)纖維素的能力越來越受到人們的關(guān)注[9]，在嗜熱細菌中，糖熱厭氧桿菌可以降解木質(zhì)纖維素，并且適用于高產(chǎn)乙醇的研究，但早期就認識到缺乏基因組信息是研究的關(guān)鍵限制[10]。

本研究中菌株TYF-B5-5是太原理工大學分子生物學實驗室從山西老陳醋成品醋液中篩選分離出的1株耐高溫細菌，該實驗室報道了它的完整基因組。由于食醋生產(chǎn)工藝的特殊性，導致菌株TYFB5-5存在可降解木質(zhì)纖維素的特性，具有廣泛的底物譜，且主要代謝產(chǎn)物為乙醇，可利用天然玉米秸稈發(fā)酵代謝。本研究通過培養(yǎng)基優(yōu)化使乙醇產(chǎn)率達到最佳，并從基因組學的角度加以證明，結(jié)果將為學者更好地研究嗜熱菌降解木質(zhì)纖維素提供途徑。

1 材料和方法

1.1 材料

供試芽孢桿菌菌株實驗室編號為TYF-B5-5。

1.2 試劑與儀器設備

木糖、葡萄糖、木聚糖、微晶纖維素，生工生物工程（上海）股份有限公司；其他化學試劑均為分析純。TS-8S搖床，蘇州培英實驗設備有限公司；ZHJH-C1109B超凈工作臺，上海智城分析儀器制造有限公司；氣相色譜儀，日本島津。

1.3 方法

1.3.1 菌種的分離鑒定與發(fā)酵條件確定 使用MRS固體培養(yǎng)基對成品醋樣進行初篩，隨后挑取單菌落用加入乙醇的液體培養(yǎng)基復篩。使用基因組提取試劑盒（TIANGEN）提取菌株TYF-B5-5的基因組，用通用引物27F、533R和1492R進行擴增（表1），其產(chǎn)物進行Sanger測序，用NCBI網(wǎng)站對測序產(chǎn)物進行Blast同源比對，查找與菌株TYF-B5-5的16SrRNA相似度較高的物種。

表1 菌株TYF-B5-5的16S rRNA擴增引物

種子液擴大培養(yǎng)基。MRS（蛋白胨10g/L，酵母粉4g/L，牛肉粉8g/L，葡萄糖20 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，檸檬酸氫二銨 2 g/L，乙酸鈉 5 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，MnSO4·H2O 0.19 g/L，吐溫 -80 1 mL/L）液體培養(yǎng)基，置于燒瓶培養(yǎng)。菌種于MRS固體培養(yǎng)基保藏，對斜面上保存菌種進行適量挑取，用于菌種復蘇，在5 mL試管37℃、200 r/min過夜培養(yǎng)；隨后，將其倒入裝有50 mLMRS的培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，所得的種子培養(yǎng)物接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在37℃、200 r/min下培養(yǎng)。

1.3.2 發(fā)酵代謝物分析及產(chǎn)物優(yōu)化 通過常規(guī)的紫外分光光度計在600 nm（OD600）處測量光密度來檢測細胞密度。乙醇的濃度測定通過備有Agilent HP-FFAP氣相色譜柱的日本島津氣相色譜儀進行檢測，乙醇濃度通過內(nèi)標法計算，程序設定參照董曉亞等[11]的方法進行，進樣量1 μL，所有樣品均于12 000×g、10 min下離心，并通過孔徑為0.22 μm的過濾器。

在MRS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，將葡萄糖分別換為20g/L半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、D-木糖、秸稈、微晶纖維素以及木質(zhì)素，用作優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的基本培養(yǎng)基。在溫度35～60℃，pH值4.5～8.5內(nèi)培養(yǎng)36 h后取樣以進行乙醇優(yōu)化。

1.4 全基因組數(shù)據(jù)處理分析

經(jīng)電泳檢測合格的DNA樣品可進行后續(xù)的文庫制備，庫檢合格后采用Illumina HiSeq 2000測序平臺進行測序?；蚪M信息分析流程如圖1所示。

為保證信息的準確可靠，將獲得的原始數(shù)據(jù)進行過濾處理，得到有效數(shù)據(jù)。使用組裝軟件對Clean Data進行基因組組裝[12-16]，最終組裝結(jié)果與GO[17]、KEGG[18-19]、NR[20]等數(shù)據(jù)庫進行比對分析，完成基因注釋信息預測及功能預測。使用GeneMarkS（Version 4.17）[21]（http：//topaz.gatech.edu/GeneMark/）軟件對新測序的基因組進行編碼基因預測，分別通 過 RepeatMasker（Version open-4.0.5）軟 件[22]、tR NAscan-SE 軟 件[23]、IslandPath-DIOMB 軟 件[24]和phiSpy軟件進行重復序列[25]、非編碼RNA、基因島和前噬菌體預測。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的分離鑒定

挑取MRS固體培養(yǎng)基中的單菌落，在加入乙醇的液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12 h后，得到乙醇耐受菌株TYF-B5-5，將菌株TYF-B5-5的16S rRNA在NCBI網(wǎng)站進行Blast同源比對，結(jié)果顯示，菌株TYF-B5-5與已知菌屬Bacillussp.相似度最高，最高相似度可達99.80%，在同一屬名下相似度最高的種名為licheniformis。

2.2 菌株代謝產(chǎn)物分析及乙醇條件優(yōu)化

2.2.1 代謝產(chǎn)物分析 由圖2-A菌株TYF-B5-5的氣相結(jié)果中可以看出，菌株TYF-B5-5在以葡萄糖為碳源時，它的主要代謝產(chǎn)物為乙醇；其次是3-羥基-2-丁酮、丙酮等，與其他代謝產(chǎn)物相比，乙醇含量遠高出2倍甚至更多，具體產(chǎn)物如表2所示。作為菌株TYF-B5-5的第二大代謝產(chǎn)物3-羥基-2-丁酮，是乙偶姻的化學名稱，乙偶姻是一種重要的食用香料，并且在功能材料、醫(yī)藥生產(chǎn)和化學方面具有廣泛的應用，用微生物法生產(chǎn)乙偶姻已成為現(xiàn)階段最受關(guān)注的方法。

表2 菌株TYF-B5-5產(chǎn)物GC-MS分析結(jié)果

2.2.2 乙醇特性優(yōu)化 在MRS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，只改變其中碳源，用不同種類碳源代替，從圖3-a中可以看出，菌株除可利用葡萄糖外，在木質(zhì)纖維素的利用上也展現(xiàn)出優(yōu)勢，其在以天然玉米秸稈為底物時，乙醇濃度達到5.8 mmol/L；在此基礎(chǔ)上，改變發(fā)酵溫度及pH，如圖3-b顯示，在溫度為45℃時，乙醇產(chǎn)率最大，乙醇濃度達7.1 mmol/L，在改變溫度時發(fā)現(xiàn)，菌株TYF-B5-5在35～60℃內(nèi)都可進行生長代謝，說明菌株TYF-B5-5為嗜熱菌；并且通過改變pH結(jié)果表明（圖3-c），當pH值達到7.0時，此時乙醇產(chǎn)率比其他pH值下明顯提高，乙醇濃度達8.0 mmol/L。因此，在以秸稈為碳源時，溫度45℃、pH值7.0時，乙醇產(chǎn)率最大，乙醇濃度達8.0mmol/L。

2.3 菌株全基因組測序及乙醇代謝通路預測

2.3.1 樣品組裝結(jié)果 菌株TYF-B5-5共有11個scafflods和12個contings，其中，contingN50和contingN90大小分別為 2 063 254、290 635 bp；GC含量為43.56%，總共有4303個基因，平均長度為826bp，包括78個tRNA和15個sRNA（表3）。

表3 菌株TYF-B5-5的基因組統(tǒng)計

2.3.2 基因功能注釋 菌株TYF-B5-5在NR、KEGG和COG數(shù)據(jù)庫中得到注釋的基因最多，分別為4245、4179、3107個，分別占基因總數(shù)的96.32%、94.83%、70.5%；而TCDB數(shù)據(jù)庫中注釋到的基因最少，為546個，占基因總數(shù)的12.39%（圖4）。

NR數(shù)據(jù)庫顯示，菌株TYF-B5-5在屬水平上與芽孢桿菌屬（Bacillussp.）核酸序列相似度最高，為58.08%；在種水平上與芽孢桿菌（Bacillus subtilis）相似度最高，為32.07%。KEGG數(shù)據(jù)庫分析得出，在代謝通路上，萜類和聚酮化合物的代謝最多，668個基因被注釋；其次，是碳水化合物代謝（261個）。GO數(shù)據(jù)庫中整體分3類功能注釋結(jié)果，其中包括46種細分結(jié)果，在細胞過程和代謝過程功能表現(xiàn)最高相關(guān)性，分別有1 578、1 574個基因。從TCDB數(shù)據(jù)庫一級分類看，基因組的主動轉(zhuǎn)運蛋白及電化學勢驅(qū)動轉(zhuǎn)運子基因最多，分別為196、202個；從二級分類看，與轉(zhuǎn)運及P-P磷酸化驅(qū)動轉(zhuǎn)運蛋白的數(shù)目最多，分別為202、178個。

將菌株TYF-B5-5的氨基酸序列在COG數(shù)據(jù)庫中進行比對，得到相應的基因組功能的注釋，結(jié)果顯示（圖5），具有通用功能的基因種類最多，為347個；其次是具有轉(zhuǎn)錄功能的基因，共322個注釋結(jié)果。與碳水化合物的運輸和代謝相關(guān)的基因也展現(xiàn)出優(yōu)勢，314個基因被注釋；此外發(fā)現(xiàn)，有233個功能未知的基因，還有待今后深入研究。

2.3.3 乙醇代謝通路預測 在KEGG數(shù)據(jù)結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)PDH（丙酮酸脫氫酶）、ALDH（乙醛脫氫酶）、ADH（乙醇脫氫酶）、PTA（磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶）、AK（乙酸激酶）被注釋并進行了功能預測。而根據(jù)乙醇代謝通路得知（圖6），這5種酶為代謝途徑中的關(guān)鍵酶，因此，我們推測菌株TYF-B5-5是通過此路徑得到代謝產(chǎn)物乙醇，菌株產(chǎn)乙醇特性從分子生物學角度得到證明。

3 結(jié)論與討論

本試驗主要針對山西農(nóng)業(yè)大學分子生物學實驗室新篩菌株TYF-B5-5進行的一系列研究，根據(jù)GC-MS對代謝產(chǎn)物進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其主要代謝產(chǎn)物為乙醇，并且具有廣泛的底物譜，如木質(zhì)纖維素等。雖然產(chǎn)乙醇菌屬較多，包括芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等，但仍有部分屬內(nèi)物種的生理學和產(chǎn)乙醇潛力未得到廣泛研究，為了了解菌株TFY-B5-5的更多特性，進行了全基因組測序分析，確定菌株基因組大小為3 984 415 bp，GC含量為43.56%。通過在KEGG數(shù)據(jù)庫相關(guān)基因的功能預測，從分子生物學角度證明菌株產(chǎn)乙醇特性。為今后深入探究分解木質(zhì)纖維素嗜熱枯草芽孢桿菌的代謝功能及生物學特性研究提供了參考。

菌株TYF-B5-5可以利用未經(jīng)處理的玉米秸稈一步發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，為我國農(nóng)業(yè)資源利用提供了技術(shù)方法。我們參考已有的丙酮酸到乙醇的代謝途徑，通過基因組注釋信息推斷出菌株TYF-B5-5的乙醇代謝通路以及旁路基因PTA等的存在，可能是導致乙醇產(chǎn)率下降的重要原因；接下來可通過熒光定量PCR、基因敲除等方法進一步研究相關(guān)基因，使菌株得到工業(yè)化應用。在GC-MS結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，除乙醇外，產(chǎn)物中有3-羥基-2-丁酮，說明菌株TYFB5-5具有其他應用價值，值得后期深入研究。

呂福英等[27]研究指出，嗜熱富集物在pH值為7.5、以麥稈為唯一碳源時，乙醇產(chǎn)量為0.129 g/L（2.8 mmol/L），而本研究菌株TYF-B5-5比其高出2倍多，且是單菌發(fā)酵，可能是由于食醋在生產(chǎn)過程中的特殊性，導致菌株TYF-B5-5既耐高溫又能利用秸稈為碳源生產(chǎn)乙醇。其還有待于進一步研究。