周俊杰，劉曉東

（中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院藥物代謝研究中心，江蘇 南京 210009）

血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）是介于血液循環(huán)系統(tǒng)和腦部中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)之間的一種動(dòng)態(tài)界面，通過(guò)嚴(yán)格調(diào)節(jié)血液和腦部的物質(zhì)交換，維持腦部?jī)?nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)平衡和實(shí)現(xiàn)正常的CNS 功能[1]。BBB 在保護(hù)CNS 的同時(shí)，也使新型神經(jīng)系統(tǒng)藥物的開(kāi)發(fā)要遠(yuǎn)落后于其他藥物，其中的部分原因是藥物在CNS 中的代謝動(dòng)力學(xué)行為不佳[2]，而在臨床應(yīng)用中CNS 活性藥物數(shù)量較少的原因是大多數(shù)藥物難以穿過(guò)BBB[3]。在藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中，一方面需要可靠的方法來(lái)篩選易通過(guò)BBB 的候選藥物，另一方面要確定作用于外周的物質(zhì)不會(huì)穿過(guò)BBB，以避免CNS 副作用[4]。體外研究有著比體內(nèi)研究更加可控、簡(jiǎn)單易操作、使用的動(dòng)物數(shù)量較少，以及更加符合倫理學(xué)的優(yōu)點(diǎn)[5]。隨著對(duì)BBB 研究的深入及各種新型技術(shù)的產(chǎn)生，各種高仿真、高效篩選、可重復(fù)的體外模型被應(yīng)用到藥物的開(kāi)發(fā)和對(duì)BBB 的生理特性探究中。本文從BBB 的結(jié)構(gòu)和功能特征出發(fā)，綜述了構(gòu)成BBB 的主要細(xì)胞及其特點(diǎn)，解釋了BBB 高效屏蔽作用的原因，并基于此介紹了BBB 的特征標(biāo)志物，為評(píng)價(jià)BBB 體外模型的優(yōu)劣提供了參考。此外，列舉了可用于構(gòu)建體外BBB 模型的不同種屬的細(xì)胞，分析了其優(yōu)缺點(diǎn)及適用范圍，為體外BBB 模型的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 血腦屏障的組成

血腦屏障主要由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（brain microvascular endothelial cell，BMEC）、星形膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞和基膜構(gòu)成[6]。內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成毛細(xì)血管壁，因此是BBB 的主要屏障。星形膠質(zhì)細(xì)胞終足包裹著B(niǎo)MEC（覆蓋率約為99%）[7]，細(xì)胞分泌的基質(zhì)蛋白構(gòu)成基膜，周細(xì)胞鑲嵌在膠質(zhì)細(xì)胞和BMEC 的基膜中[8]（見(jiàn)圖1）。雖然內(nèi)皮細(xì)胞的物理屏障是BBB 的主要構(gòu)成部分，但一些物質(zhì)也可以經(jīng)由BBB 上的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體和囊泡進(jìn)出，此外，CNS中的其他細(xì)胞對(duì)于誘導(dǎo)和維持BBB 的正常功能也是至關(guān)重要的[9]。為了討論體外細(xì)胞模型的構(gòu)建，以下先簡(jiǎn)要介紹這幾種細(xì)胞的特性。

圖 1 神經(jīng)血管單元結(jié)構(gòu)示意圖Figure 1 Schematic overview of the structure of the neurovascular unit

BMEC 是一種特殊的內(nèi)皮細(xì)胞。與外周內(nèi)皮細(xì)胞相比，BMEC 在結(jié)構(gòu)上有更多的線粒體和更少的質(zhì)膜小泡[10]，在功能上，BMEC 可形成比外周內(nèi)皮細(xì)胞更緊密的毛細(xì)血管內(nèi)皮[11]，這使得BBB 基本上不能透過(guò)極性分子。緊密連接（tight junctions，TJ）填補(bǔ)了BMEC 之間的間隙，并通過(guò)表達(dá)TJ蛋 白（tight junction protein，TJP） 如occludin、claudins 和zonula occludens（ZOs， 包 括ZO-1、ZO-2、ZO-3）等來(lái)限制細(xì)胞旁通透性[12]。親脂性的小分子如氧氣和二氧化碳等可通過(guò)自由擴(kuò)散透過(guò)BMEC，其他分子則需借助特殊的轉(zhuǎn)運(yùn)體[13]。這些轉(zhuǎn)運(yùn)體主要分為2 類：一是外排轉(zhuǎn)運(yùn)體，它將可能透過(guò)BBB 的親脂性分子外排至血液[14]，例如P-糖蛋白（P-gp）和乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）；二是高度特異性的營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)體，它可促進(jìn)特定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)BBB 進(jìn)入CNS 中，以及從CNS 中排出特定的廢物[15]，例如葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等。因此，物理屏障作用（TJ、低胞吞作用），分子屏障作用（外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）以及特定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)成了BBB 的主體，共同調(diào)節(jié)CNS 的穩(wěn)態(tài)。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中最主要的膠質(zhì)細(xì)胞[16]，其終足約覆蓋了血管表面99%，并且含有一系列與基膜緊密結(jié)合有關(guān)的蛋白[17]。星形膠質(zhì)細(xì)胞連接著神經(jīng)細(xì)胞和血管，可以介導(dǎo)它們之間的信號(hào)傳播，使腦部毛細(xì)血管能夠響應(yīng)神經(jīng)細(xì)胞的活動(dòng)[18]。在體外研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞可以誘導(dǎo)增強(qiáng)非CNS 血管的屏蔽作用[19]，且在與BMEC 共培養(yǎng)過(guò)程中，顯著增加了細(xì)胞的跨內(nèi)皮電阻（transendothelial electric resistance，TEER），降低了多種物質(zhì)的通透性[20-21]。這表明星形膠質(zhì)細(xì)胞是BBB 結(jié)構(gòu)和功能的重要組成部分。

周細(xì)胞是夾在BMEC 和星形膠質(zhì)細(xì)胞終足之間，鑲嵌在BMEC 基膜上的一種細(xì)胞[22]，覆蓋毛細(xì)血管表面約30%[7]，且覆蓋率與BMEC 通透性呈負(fù)相關(guān)。周細(xì)胞可以調(diào)節(jié)BMEC 中BBB 特異性基因的表達(dá)和誘導(dǎo)CNS 中星形膠質(zhì)細(xì)胞終足的極化[23]。體外研究表明，周細(xì)胞可以使BMEC 與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)BBB 模型中TEER 增加，并使得TJP 的表達(dá)增多[24-25]。這說(shuō)明周細(xì)胞在BMEC 和星形膠質(zhì)細(xì)胞功能的整合和BBB 功能的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵性的作用。

除了上述3 種主要細(xì)胞外，還有其他種類的細(xì)胞和一些組織共同構(gòu)成BBB?；な荁MEC 和周細(xì)胞分泌的高度特化的細(xì)胞外基質(zhì)，主要由4 種蛋白組成（Ⅳ型膠原蛋白、層黏連蛋白、巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖），可為臨近細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支持，介導(dǎo)脈管系統(tǒng)中的信息傳遞，也為BBB 提供了額外的屏障[26]。神經(jīng)元可通過(guò)影響B(tài)MEC 和星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)間接調(diào)節(jié)BBB 通透性[27]，小膠質(zhì)細(xì)胞主要起免疫作用，且可促使受損的BBB 修復(fù)[28]。

2 血腦屏障模型的主要標(biāo)志物

由于對(duì)體內(nèi)BBB 的研究還不夠完善，難以建立一個(gè)能完全模擬體內(nèi)BBB 的模型，且對(duì)模型的評(píng)價(jià)仍不全面。但隨著蛋白組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究人員發(fā)現(xiàn)一些重要蛋白的表達(dá)和功能對(duì)模型十分重要，可作為評(píng)價(jià)模型優(yōu)劣的標(biāo)志，故本綜述列出幾種主要的BBB 體外模型標(biāo)志物[29]。

TJ 主要由跨膜蛋白和細(xì)胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白構(gòu)成，包含40 多種蛋白[30]。BBB 中TJ 的形成目前還沒(méi)有明確的定論，但有研究表明周細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞可通過(guò)分泌生長(zhǎng)因子來(lái)促進(jìn)TJ 的形成[31]。TJ 使BMEC 致密地結(jié)合在一起，構(gòu)成了BBB 的高阻抗物理屏障，使得大部分物質(zhì)難以通過(guò)細(xì)胞旁通路進(jìn)入BBB[32]。

TJP 主要包含claudins、occludins、junction adhesion molecule（JAM） 和ZO[33]。 其 中，claudins 和ZO直接參與上皮細(xì)胞中TJ 的形成，起主要作用，而JAM 和occludins 等起輔助合成蛋白的作用[34-36]。許多TJP 如claudin-5、claudin-12、ZO-1 和ZO-2 在皮膚表皮、腎臟和呼吸道等其他組織和器官中都有表達(dá)[37]，但在BBB 中的表達(dá)比其他部位都要高，這是BBB 比其他組織對(duì)于物質(zhì)的運(yùn)輸限制性更強(qiáng)的原因之一。

TEER 是體外細(xì)胞培養(yǎng)模型中評(píng)價(jià)細(xì)胞屏障完整性的重要指標(biāo)，可以在一定程度上反映TJP 的表達(dá)水平,但由于測(cè)量設(shè)備、溫度、細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境等差別，TEER 值在不同的報(bào)道中有很大變化，難以直接比較[38]；也可通過(guò)測(cè)量一些親水性的示蹤物質(zhì)如熒光黃、熒光素鈉、甘露醇、異硫氰酸熒光素-葡聚糖等的滲透率（Papp）來(lái)評(píng)價(jià)體外模型屏障的完整性，但由于分子的大小、實(shí)驗(yàn)方法（設(shè)備、采樣時(shí)間等）的不同，也會(huì)有所差異。故常用以上2 種方法，結(jié)合Western Blot 實(shí)驗(yàn)共同評(píng)價(jià)TJP 的表達(dá)[39-40]。

BBB 細(xì)胞主要表達(dá)2 種轉(zhuǎn)運(yùn)體，即特異性的營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)體和外排轉(zhuǎn)運(yùn)體。其中SLC 家族編碼的蛋白和ATP 結(jié)合盒（ATP-binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)體占據(jù)主導(dǎo)地位[41]。

大多數(shù)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體屬于SLC 轉(zhuǎn)運(yùn)體，如SLC2A1(轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖)、SLC16A1（轉(zhuǎn)運(yùn)乳酸、丙酮酸），以及SLC7A5（轉(zhuǎn)運(yùn)中性氨基酸）等[42]，這些物質(zhì)會(huì)借助轉(zhuǎn)運(yùn)體順濃度梯度進(jìn)入CNS 中。還有一些受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如轉(zhuǎn)鐵蛋白、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（LRP1）等可以定向轉(zhuǎn)運(yùn)這些物質(zhì)[43-44]。另外還有幾種從腦內(nèi)排出廢物的蛋白，如Ager 等，對(duì)于維持CNS 的穩(wěn)態(tài)也十分重要[32]。

外排轉(zhuǎn)運(yùn)體包含P-gp、BCRP 和多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）等[45]。這些轉(zhuǎn)運(yùn)體利用消耗ATP 水解產(chǎn)生的能量，將潛在的可能通過(guò)BBB 的親脂性小分子物質(zhì)排出至血液中[46]。利用體外模型來(lái)研究這些外排轉(zhuǎn)運(yùn)體的底物，可以評(píng)價(jià)藥物進(jìn)入CNS 的能力，從而開(kāi)發(fā)外排量小、易于進(jìn)入CNS 發(fā)揮作用的藥物。同時(shí)，也可開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)運(yùn)體的抑制劑，協(xié)助小分子藥物進(jìn)入CNS。

3 常用的血腦屏障體外模型

體外BBB 模型的構(gòu)建常用原代細(xì)胞和永生化的細(xì)胞株[32]。原代細(xì)胞是從動(dòng)物組織直接消化培養(yǎng)的細(xì)胞，保持了組織原本的基因表達(dá)特性。而永生化的細(xì)胞系又有培養(yǎng)簡(jiǎn)單、易于改造、繁殖較快且多代內(nèi)穩(wěn)定遺傳的特點(diǎn)。不同種屬的細(xì)胞系又有不同的特征，常用的幾個(gè)指標(biāo)如TEER、Papp和一些蛋白的表達(dá)都有差異[4,47]，故介紹幾種BBB 體外模型構(gòu)建常用的細(xì)胞，為不同目的的研究提供參考。根據(jù)模型能否模擬體內(nèi)血液流動(dòng)產(chǎn)生的剪切應(yīng)力，可將模型分為靜態(tài)模型和動(dòng)態(tài)模型[48]。

3.1 靜態(tài)模型

靜態(tài)模型不能模擬血液流動(dòng)產(chǎn)生的剪切應(yīng)力，根據(jù)使用的細(xì)胞種類和培養(yǎng)方式，又可分為單獨(dú)培養(yǎng)和共培養(yǎng)（見(jiàn)圖2）。

3.1.1 單獨(dú)培養(yǎng) 單獨(dú)培養(yǎng)模型一般是將腦血管內(nèi)皮細(xì)胞接種到Transwell 膜上（見(jiàn)圖2A）。Transwell 呈小杯狀，有一層孔徑為0.4 ～ 8 μm 的微孔膜（一般是聚酯膜）將裝置分為上下兩室。微孔膜被膠原包被，有利于細(xì)胞黏附在其表面。上室模擬血液側(cè)，下室模擬血管內(nèi)側(cè)，小分子、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和一些特異性的生長(zhǎng)因子可以進(jìn)行交換，但細(xì)胞卻不能在上下室遷移，可以簡(jiǎn)單模擬腦血管內(nèi)皮細(xì)胞在BBB 上的作用。一般用于研究藥物通透性、腫瘤藥物毒性等[49]。

原代大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞最早被用來(lái)構(gòu)建體外BBB 模型[50]，之后又研究開(kāi)發(fā)出了永生化的大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞系如GP8、RBE4 等，這些細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)都保持了內(nèi)皮細(xì)胞的特性[4,51]。在用于構(gòu)建BBB 體外模型的細(xì)胞中，人腦原代細(xì)胞無(wú)疑是最佳選擇。然而由于倫理原因，很難穩(wěn)定獲取大量的細(xì)胞用于研究。hCMEC/D3 是一種很好的永生化人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系，已有大量使用該種細(xì)胞研究腦血管相關(guān)功能的報(bào)道[52]。hCMEC/D3 表達(dá)一系列的TJP，如claudin-3、claudin-5、occludin、ZO-1和ZO-2；以及表達(dá)一系列的細(xì)胞極性蛋白質(zhì)，如細(xì)胞極性蛋白（Par）-3、Par-6 和蛋白激酶（PKCz）等[53-55]。這使得常規(guī)培養(yǎng)的hCMEC/D3 可形成一層物理屏障。然而與人腦微血管相比，claudin-5、occludin 的表達(dá)卻降低[56]。在使用單獨(dú)培養(yǎng)的hCMEC/D3 細(xì)胞作為模型研究阿爾茨海默病時(shí)，發(fā)現(xiàn)其TEER 較低，雖然對(duì)大分子FITC-葡聚糖的屏障作用較好，但對(duì)小分子的滲透率卻較高。在研究阿爾茨海默病的特征蛋白β-淀粉樣蛋白的通透性時(shí)，發(fā)現(xiàn)從底側(cè)到頂端方向幾乎沒(méi)有屏障作用[57]。這表明hCMEC/D3 單獨(dú)培養(yǎng)不適合藥物和蛋白的滲透性實(shí)驗(yàn)?，F(xiàn)已有多種方法來(lái)增加hCMEC/D3 的物理屏障作用，如2D/3D培養(yǎng)，用氫化可的松或氯化鋰處理，都可使TJP 表達(dá)增加[52,58-59]。

在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞株表達(dá)100 多種SLC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，包括SLC2A1 (Glut-1)、SLC7A5 (LAT-1)和 SLC16 (MCT) 家族的一些蛋白[60]，其中Glut-1 的表達(dá)與人腦微血管相似[60]。同樣還發(fā)現(xiàn)了特異性的受體，如胰島素受體和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體[61]。hCMEC/D3在mRNA 水平上表達(dá)23 種ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體，包括P-gp、MRP-4 和 BCRP 等，在蛋白水平上P-gp 和BCRP也有較高表達(dá)[60,62-63]。

以上表明，hCMEC/D3 是一種易于獲取、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、可特異性表征人腦微血管內(nèi)皮的細(xì)胞系，比較適用于藥物攝取和病理模型研究。

3.1.2 共培養(yǎng) 共培養(yǎng)根據(jù)細(xì)胞的種類分為雙層共培養(yǎng)和三重共培養(yǎng)。雙層共培養(yǎng)常用的是腦血管內(nèi)皮細(xì)胞-星形膠質(zhì)細(xì)胞/周細(xì)胞共培養(yǎng),主要分為2 種模式。一種是星形膠質(zhì)細(xì)胞/周細(xì)胞接種在細(xì)胞培養(yǎng)板底，將接種BMEC 的Transwell 置于板上；另一種是星形膠質(zhì)細(xì)胞/周細(xì)胞接種在Transwell 微孔膜的另一邊，與BMEC 接近但不直接接觸，可以有更多細(xì)胞間相互作用（見(jiàn)圖2B）。三重共培養(yǎng)常在Transwell 微孔膜上部接種BMEC，底部接種周細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)板底接種星形膠質(zhì)細(xì)胞，或者周細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞位置對(duì)調(diào)[24]（見(jiàn)圖2C），此外神經(jīng)細(xì)胞也可用于三重共培養(yǎng)中[64]，與上述培養(yǎng)方式相比，更能體現(xiàn)出神經(jīng)細(xì)胞對(duì)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)控作用，還可將藥物穿過(guò)血腦屏障和在腦內(nèi)的代謝過(guò)程結(jié)合起來(lái)，更能表征BBB 動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的特點(diǎn)。共培養(yǎng)與單層培養(yǎng)相比，可表達(dá)更多的TJP 和特異性轉(zhuǎn)運(yùn)體，有更高的TEER 和更低的滲透率，能更好地表征BBB 特性[24]。共培養(yǎng)模型裝置簡(jiǎn)單，操作便捷，可廣泛應(yīng)用于新藥篩選、藥物滲透率評(píng)估、細(xì)胞間相互作用和腦部疾病模型等方面的研究。

小鼠BBB 體外細(xì)胞模型常用小鼠原代腦血管內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，該模型具有典型的BBB 特性，例如表達(dá)claudin-3、claudin-5 和P-gp 等蛋白以及較高的TEER[65]，是一種良好的體外BBB 模型。此外，永生化的小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞如bEnd3、bEnd5 也常被用作體外研究，RT-PCR 分析表明這2 種細(xì)胞系可表達(dá)TJP 如：ZO-1、ZO-2、occludin和claudin-5，同時(shí)一些轉(zhuǎn)運(yùn)體如GLU-1、P-gp和BCRP 也有表達(dá)[66-67]，這表明它們是優(yōu)良的BBB模型細(xì)胞系。但有研究表明，這2 種細(xì)胞株單獨(dú)培養(yǎng)以及與膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，對(duì)于細(xì)胞旁通路并沒(méi)有顯著性差異，表明這2 種細(xì)胞系不適用于藥物滲透性的研究[68]。

大鼠體外BBB 模型最常見(jiàn)的是BMEC 單獨(dú)培養(yǎng)，近來(lái)研究表明與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)能進(jìn)一步表征BBB，而與星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞三重共培養(yǎng)則具有更為顯著的BBB 特性[24,69]。3 種體外模型都表達(dá)TJP 如claudin-5、occludin 和ZO-1，但共培養(yǎng)模型中claudin-5 和ZO-1 的表達(dá)要高一些[24,70-71]。原代細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)一定程度的去分化現(xiàn)象，研究表明，單獨(dú)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中一些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)會(huì)下調(diào)，特別是Glut-1、P-gp 和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，在與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的模型中也出現(xiàn)了這種現(xiàn)象[39,72]。盡管如此，在共培養(yǎng)模型的mRNA和蛋白質(zhì)水平上，P-gp、BCRP 和MRP 的表達(dá)仍是顯著的[24,73]，且有體外實(shí)驗(yàn)證明了P-gp 和BCRP仍有正常功能[39,71]。在一項(xiàng)研究中，研究者將體外大鼠原代BMEC 和星形膠質(zhì)細(xì)胞在氫化可的松和cAMP 存在的條件下共培養(yǎng)，并測(cè)定了一系列物質(zhì)在該模型中的通透性，如親脂性的秋水仙堿、長(zhǎng)春新堿；親水性的菊粉、蔗糖；典型的外排轉(zhuǎn)運(yùn)體底物、羅丹明-123、哌唑嗪以及對(duì)照藥物地西泮等，同時(shí)使用這些藥物在大鼠中進(jìn)行原位腦灌流實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有良好的相關(guān)性（R= 0.94）[74]，表明該共培養(yǎng)模型具有實(shí)際科研價(jià)值。

大鼠BBB 體外模型的主要優(yōu)點(diǎn)是可以建立同源的共培養(yǎng)模型，體外的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以與同品系的在體數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)，具有一定的實(shí)用參考價(jià)值。同時(shí)大鼠作為廣泛使用的模式動(dòng)物，易于獲得，遺傳背景較為清晰，有大量的抗體可用于科學(xué)研究，故大鼠體外BBB 模型的使用非常廣泛。

除此之外，豬和牛的原代細(xì)胞也可用來(lái)構(gòu)建體外BBB 模型。以原代豬腦血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建的BBB 模型，有較高的TEER[5]，且表達(dá)BCRP 與P-gp的比值接近于猴和人類[75]。牛也表達(dá)一系列BBB特征蛋白，有較高的TEER[40]。但豬和牛的體型較大，不同國(guó)家和地區(qū)使用的品系也很難相同，相應(yīng)的科研技術(shù)支持還不夠完善，故使用受到一定限制。

圖 2 血腦屏障靜態(tài)模型 Figure 2 The static models of blood-brain barrier

3.2 動(dòng)態(tài)模型

體外BBB 模型研究表明，血液流動(dòng)產(chǎn)生的剪切應(yīng)力可促進(jìn)一些TJP 和轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)，增強(qiáng)BBB 的屏障作用[76]。故BBB 動(dòng)態(tài)模型就是利用各種材料和裝置，為培養(yǎng)的細(xì)胞模擬一個(gè)類似體內(nèi)血液流動(dòng)的環(huán)境。隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，BBB 模型已趨向于集成化和微小化，然而不同的實(shí)驗(yàn)室使用的裝置和材料各不相同，模型的適用范圍也各異，故很難系統(tǒng)地將動(dòng)態(tài)模型分類敘述。本文依據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)的方式，大致將BBB 體外動(dòng)態(tài)模型分為纖維管動(dòng)態(tài)模型和平面微孔膜動(dòng)態(tài)模型。

3.2.1 纖維管動(dòng)態(tài)模型 纖維管動(dòng)態(tài)模型即以中空的纖維管模擬腦部微血管，在管內(nèi)壁接種BMEC，外壁接種星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)模擬腦微血管被星形膠質(zhì)細(xì)胞終足包裹的生長(zhǎng)狀況。管道外接恒流泵和氣體交換裝置，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)（見(jiàn)圖3A）。在使用牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和C6 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的纖維管動(dòng)態(tài)模型中，其TEER 值比同樣條件下培養(yǎng)在Transwell 中的模型要高10 倍以上[77]，對(duì)蔗糖和苯妥英的通透性比在Transwell 模型中降低了90%和80%[78]，這表明在纖維管內(nèi)流動(dòng)產(chǎn)生的剪切應(yīng)力對(duì)BBB 模型的屏障作用非常重要。此外，該模型還可以用于腦部的病理研究，通過(guò)控制培養(yǎng)基中的氧氣含量，可以模擬腦部的缺血再灌注損傷[79]；可以培養(yǎng)癲癇病人的微血管內(nèi)皮細(xì)胞，來(lái)研究癲癇患者BBB 生理功能的變化[80]。然而，此模型也有一些不足，首先，無(wú)法直接觀測(cè)纖維管中細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)；其次，構(gòu)建纖維管裝置和接種細(xì)胞有一定的技術(shù)難度；第三，較難收集纖維管中的細(xì)胞來(lái)研究其生理特性。

3.2.2 平面微孔膜動(dòng)態(tài)模型 平面微孔膜動(dòng)態(tài)模型通常分為上下2 個(gè)腔室，中間由微孔膜（大多是聚酯膜）隔開(kāi)，細(xì)胞可以培養(yǎng)在膜上和腔室內(nèi)部，構(gòu)成類似Transwell 共培養(yǎng)的結(jié)構(gòu)，體系內(nèi)同樣有流動(dòng)的培養(yǎng)基提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（見(jiàn)圖3B）。最簡(jiǎn)易的一種模型是微流體BBB 模型，將BMEC 接種在聚酯膜上，星形膠質(zhì)細(xì)胞接種在下腔室內(nèi)，或使用培養(yǎng)過(guò)星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基灌注，構(gòu)成動(dòng)態(tài)的BBB 模型。裝置內(nèi)可加裝電極來(lái)測(cè)定TEER，也可用來(lái)研究BBB對(duì)藥物的通透性[81]。在此基礎(chǔ)上，可以對(duì)裝置進(jìn)行各種改造，來(lái)實(shí)現(xiàn)研究目的。在一項(xiàng)報(bào)道中，研究者在下腔微孔通道里增加了3D 細(xì)胞培養(yǎng)室，使得該模型不僅能用來(lái)評(píng)價(jià)藥物通過(guò)BBB 的能力，還可用來(lái)評(píng)價(jià)該藥物對(duì)于培養(yǎng)室中細(xì)胞的作用[82]。平面微孔膜模型相對(duì)于纖維管模型而言，便于觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，需要的細(xì)胞數(shù)量較少，且對(duì)技術(shù)的要求也較低，是一種易于實(shí)現(xiàn)的動(dòng)態(tài)模型。

相比于靜態(tài)模型，動(dòng)態(tài)模型的構(gòu)建方法較多，裝置各異，各有優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)研究目的來(lái)選擇。

圖 3 血腦屏障動(dòng)態(tài)模型Figure 3 The dynamic models of blood-brain barrier

4 結(jié)語(yǔ)

血腦屏障體外模型的構(gòu)建從一開(kāi)始的單獨(dú)培養(yǎng)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，到與星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞共培養(yǎng)，再到可調(diào)節(jié)細(xì)胞微環(huán)境的動(dòng)態(tài)微控系統(tǒng)，都一步步向著更貼近于模擬體內(nèi)真實(shí)的環(huán)境發(fā)展。隨著對(duì)血腦屏障研究的深入，會(huì)有越來(lái)越完善的BBB 體外模型被構(gòu)建出來(lái)，應(yīng)用于各種科研與藥物開(kāi)發(fā)中。體外模型雖然無(wú)法替代體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，但與在體實(shí)驗(yàn)相比，有著操作簡(jiǎn)單、條件可控、經(jīng)濟(jì)實(shí)用，以及減少動(dòng)物使用、更符合倫理學(xué)的優(yōu)點(diǎn)，在藥物滲透性及血腦屏障生理病理的研究中仍有不可替代的作用。在實(shí)際科研與藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中，應(yīng)根據(jù)研究的目的來(lái)選擇合適的模型。