李丹丹，劉揚(yáng)，韓家凱，高威，于彤，龐嫵燕

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院 內(nèi)分泌科，河南 開(kāi)封 475000)

隨著人口老齡化、酒精濫用、肥胖癥在全球流行趨勢(shì)逐日加重，脂肪性肝病已逐漸替代病毒性肝炎成為終末期肝病的重要病因。非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)根據(jù)疾病進(jìn)展的不同階段分為非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性肝纖維化和肝硬化[1]。肝臟脂肪變性是NAFLD的早期階段，若不加干預(yù)，可進(jìn)展為非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、肝硬化，甚至誘發(fā)肝細(xì)胞癌[2]。NAFLD發(fā)病機(jī)制目前認(rèn)為主要是脂肪組織的胰島素抵抗，誘發(fā)氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致組織損傷[3]，因此也被認(rèn)為是代謝綜合征的一部分[4]。胰高血糖素樣肽-1(glucagon like peptide-1，GLP-1)由腸道L細(xì)胞分泌，是目前已知作用最強(qiáng)的腸促胰島素分泌肽。動(dòng)物和人體實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)GLP-1能夠顯著改善脂肪細(xì)胞的胰島素敏感性，且在降低血糖同時(shí)改善血脂代謝。本課題從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)入手，研究和分析GLP-1對(duì)NAFLD的治療效果。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性約4周齡Sprague-Dawley(SD)大鼠150只，體質(zhì)量為(140±10)g，購(gòu)自河南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。在適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后隨機(jī)分為空白對(duì)照組(control group，CON組)，模型對(duì)照組(high-fat diet，HFD組)和GLP-1低、中、高劑量治療組(GLP-1 low、middle、high dose，GLD組、GMD組、GHD組)，每組30只。每天12 h燈光照射，室內(nèi)溫度控制23～25 ℃，濕度40%～50%。對(duì)所有動(dòng)物的飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)處理均遵照河南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的章程及規(guī)定執(zhí)行。

1.2 動(dòng)物模型的建立及分組對(duì)CON組全程喂食普通飼料，給予HFD組與GLP-1組高脂溶液(普通飼料88%、豬油10%、膽固醇2%)灌胃12周，促使NAFLD模型的形成。造模成功后，分別給予GLD組、GMD組、GHD組GLP-1(丹麥諾和諾德公司)0.1、0.2、0.4 mg·kg-1·d-1。

1.3 標(biāo)本的采集及處理每周準(zhǔn)確稱大鼠體質(zhì)量，分別于治療第4周和第8周禁食12 h后予水合氯醛麻醉后用注射器心臟尖端取血，離心后取上清液，凍存于-80 ℃冰箱內(nèi)。計(jì)算治療前后各組大鼠體質(zhì)量變化情況及肝指數(shù)(肝重占總體質(zhì)量的百分比)。

1.4 血和肝臟生物化學(xué)指標(biāo)的測(cè)定監(jiān)測(cè)CON組和HFD、GLD、GMD、GHD組大鼠血清膽紅素、蛋白、肝功能、血脂、空腹血漿葡萄糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)等變化情況。測(cè)定總蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)、總膽固醇(total chloesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein-cholestero，LDL-C)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein cholestero，HDL-C)、FBG的方法為氧化酶法，檢測(cè)FINS、直接膽紅素(direct bilirubin，DBIL)、間接膽紅素(indirect bilirubin，IBIL)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic-oxalacetic transaminase，AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamate transaminase，ALT)的方法為酶聯(lián)免疫法。由公式(FBG×FINS/22.5)計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(Homa insulin resistance index，HOMA-IR)。每只大鼠取相同部位肝組織50 mg，應(yīng)用氯仿/甲醇制備肝組織勻漿并提取脂質(zhì)，采用GPO-PAP法測(cè)定肝臟TC、TG水平。

2 結(jié)果

2.1 一般情況干預(yù)過(guò)程中CON組活動(dòng)度好，飲食正常，皮毛整潔。HFD組活動(dòng)減少，飲食增多，毛發(fā)凌亂黃膩。GLP-1干預(yù)組大鼠的一般情況與CON組相似。

2.2 大鼠體質(zhì)量和肝指數(shù)治療開(kāi)始時(shí)各組大鼠體質(zhì)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療8周后GLD組與HFD組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；GMD組、GHD組與HFD組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與CON組相比，HFD組肝指數(shù)明顯升高。治療4周后GLD、GMD、GHD組較HFD組有一定的改善，但除GHD組外，其他3組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療8周后3個(gè)治療組相較于HFD組降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 血清學(xué)代謝指標(biāo)治療4周后，GLD、GMD、GHD組DBIL、IBIL以及CHO、TG、LDL-C、AST、ALT相較于HFD組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，治療8周后下降更明顯(P<0.05)；治療4、8周后GLD、GMD、GHD組HDL-C、TP、ALB較HFD組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。GLD、GMD、GHD 3組間比較，GHD組較GLD組變化更明顯(P<0.05)。見(jiàn)表2、3。

表1 各組大鼠處死時(shí)體質(zhì)量及肝指數(shù)比較

注：與HFD組比較，aP<0.05。

表2 治療4周后各組大鼠血清學(xué)指標(biāo)比較

注：與HFD組比較，aP<0.05；與GLD組比較，bP<0.05；DBIL—直接膽紅素；IBIL—間接膽紅素；TC—總膽固醇；TG—甘油三酯；LDL-C—低密度脂蛋白；HDL-C—高密度脂蛋白；AST—谷草轉(zhuǎn)氨酶；ALT—谷丙轉(zhuǎn)氨酶；TP—總蛋白；ALB—白蛋白。

表3 治療8周后各組大鼠血清學(xué)指標(biāo)比較

注：與HFD組比較，aP<0.05；與GLD組比較，bP<0.05；DBIL—直接膽紅素；IBIL—間接膽紅素；TC—總膽固醇；TG—甘油三酯；LDL-C—低密度脂蛋白；HDL-C—高密度脂蛋白；AST—谷草轉(zhuǎn)氨酶；ALT—谷丙轉(zhuǎn)氨酶；TP—總蛋白；ALB—白蛋白。

2.4 肝臟氧化和抗氧化能力高脂飲食后HFD組NAFLD大鼠模型肝勻漿丙二醛(malondialdehyde，MDA)明顯升高，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)明顯降低。治療4周后，GLD、GMD、GHD與HFD組相比，各指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療8周后，各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)一步接近于CON組，與HFD組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；GHD組變化更明顯，且與GLD組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 治療4、8周后各組大鼠肝臟氧化和抗氧化能力比較

注：與CON組比較，aP<0.05；與治療4周后HFD組比較，bP<0.05；與治療8周后HFD組比較，cP<0.05；與治療8周后GLD組比較，dP<0.05；GSH—谷胱甘肽；SOD—超氧化物歧化酶；MDA—丙二醛。

2.5 HOMA-IR高脂飲食后HFD組NAFLD大鼠HOMA-IR明顯升高，治療4周后，GLD、GMD、GHD組與HFD組相比改善明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3個(gè)治療組呈現(xiàn)出逐步降低的趨勢(shì)，GHD組降低最明顯，與GLD組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療8周后，改善趨勢(shì)與治療4周后一致，但較治療4周后有進(jìn)一步的降低。見(jiàn)表5。

表5 治療4、8周后各組大鼠HOMA-IR比較

注：與HFD組比較，aP<0.05；HOMA-IR—胰島素抵抗指數(shù)。

3 討論

在大多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家中，NAFLD已經(jīng)成為一種最為常見(jiàn)的肝病。肝臟在糖脂代謝中起關(guān)鍵作用，因此，NAFLD是許多代謝性疾病的風(fēng)險(xiǎn)因素，如2型糖尿病、高脂血癥、高胰島素血癥及動(dòng)脈粥樣硬化等。目前，NAFLD和2型糖尿病已經(jīng)成為嚴(yán)重的全球公共衛(wèi)生問(wèn)題[5]。NAFLD在普通成年人中的發(fā)生率為10%～24%，在肥胖和2型糖尿病人群中發(fā)病率高達(dá)58%～74%和49%～62%。NASH患者2型糖尿病的發(fā)病率超過(guò)50%[6]。糖尿病是一個(gè)強(qiáng)大且獨(dú)立的NAFLD危險(xiǎn)因素，二者互為條件加速惡化，有致死的風(fēng)險(xiǎn)[7]。另外非酒精性肝炎可通過(guò)釋放炎性介質(zhì)、血栓形成物及促氧化物質(zhì)以及通過(guò)NAFLD對(duì)胰島素抵抗及動(dòng)脈粥樣硬化的促進(jìn)作用，促進(jìn)心腦血管并發(fā)癥的發(fā)生。越來(lái)越多的證據(jù)表明，NAFLD的臨床負(fù)擔(dān)并不局限于肝臟相關(guān)疾病，大多數(shù)NAFLD患者的首要死亡原因是心血管疾病[7]。

關(guān)于NAFLD的具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，以前主要觀點(diǎn)是“二次打擊”假說(shuō)[2,8]：代謝失衡和氧化應(yīng)激。目前，“雙重打擊”學(xué)說(shuō)替代“二次打擊”學(xué)說(shuō)成為一種更加科學(xué)的解釋[9-10]：多種因素共同作用于易感個(gè)體最終導(dǎo)致NAFLD的發(fā)生。這些因素包括胰島素抵抗、脂肪組織分泌的激素、營(yíng)養(yǎng)因子、腸道微生物群以及遺傳和表觀遺傳因子，其共同作用會(huì)改變肝細(xì)胞脂肪含量并影響肝臟炎癥環(huán)境，從而通過(guò)異質(zhì)性肝細(xì)胞損傷途徑導(dǎo)致慢性肝臟炎癥的發(fā)生，并可能發(fā)展為肝細(xì)胞壞死，肝星狀細(xì)胞的活化和纖維基質(zhì)的沉積。胰島素抵抗是NAFLD的一個(gè)基本特征，也是促進(jìn)該病進(jìn)展的重要機(jī)制。研究證實(shí)，胰島素抵抗與肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的異常積累緊密相關(guān)[11]。脂肪酸主要來(lái)源于脂肪組織內(nèi)的脂肪分解、飲食攝入和從頭合成，在肝臟中，游離脂肪酸可以重新酯化為甘油三酯，進(jìn)行β-氧化或作為極低密度脂蛋白排泄，胰島素抵抗會(huì)使胰島素抑制肝糖輸出的能力下降，導(dǎo)致游離脂肪酸向肝臟的通量增加以及甘油三酯的產(chǎn)生增加，從而形成NAFLD。在高胰島素血癥中，SREBP-1c的上調(diào)導(dǎo)致糖異生基因的過(guò)度表達(dá)，導(dǎo)致脂質(zhì)積聚到肝臟中，從而形成NAFLD。鑒于此，NAFLD防治指南(2018更新版)提出：鑒于NAFLD是肥胖和代謝綜合征累及肝臟的表現(xiàn)，大多數(shù)患者肝組織學(xué)改變處于單純性脂肪肝階段，治療NAFLD的首要目標(biāo)為減肥和改善胰島素抵抗，預(yù)防和治療代謝綜合征、2型糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥，從而減輕疾病負(fù)擔(dān)，改善患者的生活質(zhì)量并延長(zhǎng)壽命[12]。

GLP-1作為一種葡萄糖依賴性的腸促胰素，食物刺激后由小腸L細(xì)胞分泌入血，主要作用于胰腺β細(xì)胞，葡萄糖依賴性地刺激胰島素分泌，抑制α細(xì)胞分泌胰高血糖素，抑制食欲以及胃排空，促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖，抑制其凋亡[13-14]。還有研究顯示，GLP-1上調(diào)脂肪細(xì)胞表面胰島素受體及胞內(nèi)胰島素底物的數(shù)量，促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4的表達(dá)，進(jìn)而改善由腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)介導(dǎo)的胰島素抵抗。另外，GLP-1能夠通過(guò)降低脂肪細(xì)胞內(nèi)巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，直接抑制炎癥信號(hào)通路，從而改善胰島素抵抗，進(jìn)而對(duì)NAFLD起到明顯的改善作用[15]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠成功建立NAFLD模型，HFD組肝臟質(zhì)量與大鼠體質(zhì)量百分比第8周時(shí)高達(dá)(3.11±0.52)%，超過(guò)CON組的(2.38±0.24)%。這表明脂肪顆粒已經(jīng)大量附著在肝細(xì)胞。該模型具有NAFLD的典型病理特征，如肝細(xì)胞腫脹，體積增大，廣泛的大細(xì)胞性脂肪變性，胞質(zhì)內(nèi)大小不等的脂滴空泡，匯管區(qū)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。血清學(xué)指標(biāo)ALT、AST、TBIL、DBIL顯著增高。另外，高脂飲食導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)代謝發(fā)生障礙，血清TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，TP和ALB水平升高。GLP-1干預(yù)治療后，大鼠肝臟的脂肪變性得以改善，肝臟所占大鼠體質(zhì)量百分比與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這表明GLP-1可明顯減少NAFLD肝臟中沉積的脂肪顆粒，起到保護(hù)肝臟的作用。大鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)及上述血清學(xué)指標(biāo)均有顯著改善，這提示GLP-1能顯著改善NAFLD脂質(zhì)代謝紊亂。

氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過(guò)氧化和炎癥反應(yīng)是NAFLD發(fā)病中的又一次打擊。發(fā)生NAFLD時(shí)，肝細(xì)胞中過(guò)剩的游離脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，產(chǎn)生大量的活性氧簇，一方面促使TNF-α生成，抑制線粒體呼吸，誘發(fā)并加重胰島素抵抗；另一方面活化轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、轉(zhuǎn)錄因子等多種細(xì)胞因子，進(jìn)一步加重肝脂肪變性、壞死及纖維組織生成。MDA是自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)的氧化終產(chǎn)物，MDA的量可間接反映細(xì)胞損傷的程度。SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)。GSH結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)活潑的巰基，易被氧化脫氫[16]。本實(shí)驗(yàn)也顯示，在NAFLD大鼠模型的血漿中，氧化因子MDA升高，抗氧化指標(biāo)(SOD、GSH)降低(P<0.05)。GLP-1治療8周后，上述指標(biāo)明顯改善。這提示在NAFLD中，GLP-1可通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)和提高抗氧化能力改善肝功能。

綜上所述，GLP-1可以改善NAFLD大鼠肝功能，降低肝臟脂肪含量，改善肝臟抗氧化能力和胰島素抵抗，對(duì)NAFLD有治療作用。