王藝斐，姜澤東，張 敖，計舒文，何夢原，朱延姝

(沈陽農(nóng)業(yè)大學生物科學技術學院，遼寧 沈陽 110866)

【研究意義】銀杏(GinkgobilobaL.)為落葉喬木，是中國北方大量栽培的重要觀賞性樹木。銀杏葉片在秋季低溫下變黃，觀賞性極高。然而，好景不長，銀杏葉片黃化后不久即脫落。這種脫落可能與光抑制引起的衰老有關。【前人研究進展】秋季氣溫下降，導致植物葉片光合作用中參與暗反應過程的酶活性顯著降低，CO2同化速率減慢，而氣溫降低影響光合作用光反應速率的程度相對較小[1]。光反應與暗反應速率之間的失衡造成激發(fā)能過剩，即植株葉片吸收的光能超過CO2同化所能利用的能量。過剩光能引起光抑制，導致葉片光合作用速率持續(xù)降低[2]。葉片吸收的過剩光能產(chǎn)生活性氧，后者引起細胞膜脂和蛋白質分子等生物大分子的氧化分解[3]，加快葉片的衰老?！颈狙芯壳腥朦c】越冬植物秋季葉片的主要功能是盡可能地維持光合作用，為下一年春天的生長積累營養(yǎng)物質，并且在葉片脫落前維持細胞的基本結構和功能，以利于將葉片中合成的營養(yǎng)物質盡可能多的轉移到越冬的延存器官。因此，秋季葉片適當性衰老對多年生樹木越冬前的營養(yǎng)物質轉移和貯存具有重要意義。在秋季低溫脅迫時，控制葉片衰老的關鍵是清除由光能過剩所導致產(chǎn)生的過多活性氧[4]。銀杏葉片在秋季衰老過程中外觀顏色顯著變紅或黃化。研究表明，植物葉片主動延緩衰老的手段是依靠葉片所含光合色素中的類胡蘿卜素和花色素來清除產(chǎn)生的活性氧[5-8]?！緮M解決的關鍵問題】本文以3種不同顏色銀杏葉片為材料，比較光合色素含量、葉綠素熒光參數(shù)和吸收光譜，為了解秋季銀杏葉衰老脫落機制及其調控提供研究思路和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

材料選取種植在沈陽農(nóng)業(yè)大學的銀杏(GinkgobilobaL.)樹，樹齡約30年。以向陽且程度一致的無病變、無損傷的綠色葉、淺綠色葉和黃色葉為實驗材料，測定葉片的吸收光譜、葉綠素熒光參數(shù)及光合色素含量。測定時間為2016年10月上旬，上午，當天平均氣溫為20 ℃，光照強度為897.867 μmol·m-2·s- 1，5次重復。

1.2 測定指標和方法

1.2.1 吸收光譜測定 銀杏葉片吸收光譜的測定使用英國HANSATECH公司的Unispec-SC Spectral Analysis System(PP-Systems)測定銀杏3種不同顏色葉片的吸收光譜。

1.2.2 葉綠素熒光動力學曲線測定 使用植物效率儀(Handy PEA，英國HANSATECH公司)測定葉綠素熒光參數(shù)。首先用葉夾夾住葉片中部，暗適應時間為30 min。獲得的參數(shù)包括：Fo(初始熒光minimal fluorescence)、Fm(最大熒光maximal fluorescence)、Fv(可變熒光variable fluorescence，F(xiàn)v=Fm-Fo)、Fv/Fm(PSⅡ最大光化學效率 optimal/maximal quantum yield of PSⅡ)、Wk(PSⅡ供體側傷害指數(shù))、ETo/RC(電子傳遞所需能量)、DIo/RC(反應中心熱耗散)和RC/CSm(單位面積反應中心數(shù)量)。

1.2.3 光合色素含量測定 參考韋友歡[9]提取光合色素的方法，使用95 %乙醇浸提總色素，測定提取液470、474、485、645、663 nm下的吸光值，計算葉綠素a(Chla)、b(Chlb)、葉綠素a+b(Chla+Chlb)、胡蘿卜素和葉黃素含量。

計算公式為：葉綠素a濃度(mg/L)=(9.784×OD663-0.99×OD645)；葉綠素b濃度(mg/L)=(12.6×OD645-4.65×OD663)；葉綠素a含量(mg/g)=葉綠素a濃度(mg/L)×提取液總體積(L)/樣品鮮重(g)；葉綠素b含量(mg/g)=葉綠素b濃度(mg/L)×提取液總體積(L)/樣品鮮重(g)；胡蘿卜素(mg/g)=(12.6OD485-6.00OD470-0.0298a+0.336b) ×提取液總體積(L)/樣品鮮重(g)(公式中的a為葉綠素a濃度，b為葉綠素b濃度，下同)；類胡蘿卜素(mg/g)=(4.92OD474-0.0255a-0.225b) ×提取液總體積(L)/樣品鮮重(g)；葉黃素(mg/g)=(10.2OD470-11.5OD485-0.0036a-0.652b)×提取液總體積(L)/樣品鮮重(g)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0軟件分析銀杏3種顏色葉片的熒光參數(shù)和吸收光譜數(shù)據(jù)，采用Microsoft Office Excel 2016繪制數(shù)據(jù)圖。

2 結果與分析

2.1 銀杏葉片黃化過程光合色素含量比較

表1顯示，銀杏3種顏色葉片光合色素含量存在差異。綠色葉、淺綠色葉和黃葉的葉綠素a+b、葉綠素a和葉綠素b含量依次降低，均達到顯著水平，且與它們的外觀顏色表現(xiàn)一致；同時，隨著銀杏葉片變黃，類胡蘿卜素含量與葉綠素a+b含量變化趨勢為均逐漸降低，達到極顯著水平，但類胡蘿卜素含量下降幅度小于葉綠素含量下降的幅度；葉綠素a+b/類胡蘿卜素值下降且差異達極顯著水平，說明類胡蘿卜素的含量相對增加；銀杏葉片中胡蘿卜素和葉黃素的含量隨著葉片顏色由綠色到黃色過程中均逐漸降低，其差異達到極顯著水平。隨著葉片黃化，葉綠素a+b/總色素值降低，而類胡蘿卜素/總色素、胡蘿卜素/總色素和葉黃素/總色素值卻均升高。這表明盡管銀杏葉片黃化過程中總色素及各組分色素均發(fā)生降解，呈現(xiàn)下降趨勢，但類胡蘿卜素、胡蘿卜素和葉黃素相對含量呈現(xiàn)上升趨勢。銀杏葉片衰老過程中，葉黃素/類胡蘿卜素相對比值上升。

表1 銀杏3種不同顏色葉片的光合色素含量和比值

2.2 3種顏色銀杏葉片吸收光譜比較

如圖1所示，銀杏3種顏色葉片吸收光譜存在明顯差異。由于不同種光合色素對可見光的吸收范圍不同，導致3種顏色葉片的吸收光譜相差明顯。在波長400～510 nm范圍內，銀杏3種顏色葉片對光能的吸收數(shù)量從高到低依次為綠色葉>淺綠色葉>黃色葉；在波長為510～710 nm范圍內，淺綠色葉片的光能吸收顯著低于綠色葉片，黃色葉片的光能吸收又顯著低于淺綠色葉片；在波長為710～1110 nm范圍內，不同顏色葉片的吸收光譜幾乎重合。植物光合作用中行使吸收光能功能的主要色素是葉綠素，隨著葉片的黃化，這種色素的含量顯著降低。盡管葉綠素在可見光的短波長的藍紫光區(qū)和長波長的紅光區(qū)都有吸收峰，但是在本實驗中，葉綠素含量降低對3種顏色銀杏葉片在長波區(qū)的光吸收的影響更大。

圖1 銀杏3種顏色葉片的吸收光譜比較Fig.1 Comparison absorption spectrum with three types leaves of Ginkgo biloba L.

2.3 3種顏色銀杏葉片葉綠素熒光動力學曲線和熒光參數(shù)比較

如圖2所示，3種顏色銀杏葉片葉綠素熒光動力學曲線存在顯著差異。綠葉和淺綠葉片的O-J-I-P各點明顯，為典型的葉綠素熒光誘導動力學曲線；黃葉的葉綠素熒光動力學曲線未呈現(xiàn)經(jīng)典曲線特征，O-J-I-P各點不明顯，表明黃色葉片的光化學活性處于非常低的水平上。

圖2 銀杏3種顏色葉片的葉綠素熒光動力學曲線比較Fig.2 Comparison of chlorophyll fluorescence kinetics in three types of leaves with different color of Ginkgo biloba L.

3種顏色銀杏葉片葉綠素熒光參數(shù)明顯不同(表2)。隨葉片黃化，最大熒光Fm呈現(xiàn)降低的趨勢，黃葉的Fm最低，說明葉片失綠黃化降低葉片PSⅡ的最大光反應活性；與綠葉和淺綠葉的Fv/Fm(PSⅡ最大光化學效率)對比后發(fā)現(xiàn)，黃葉Fv/Fm極顯著降低，說明黃色葉片具有較強的阻止過剩光能進入葉綠體光能轉換系統(tǒng)的能力，從而減少活性氧的產(chǎn)生；與綠葉和淺綠葉相比，黃葉的初始熒光Fo顯著降低，但下降幅度遠小于Fm和Fv/Fm，說明銀杏葉片由綠色轉變?yōu)辄S色的過程中維持有非常強的光能非光化學耗散能力，而且，隨著葉片黃化，反應中心的熱耗散DIo/RC表現(xiàn)為升高的趨勢，這表明黃化葉片的反應中心也形成了較強的能量熱耗散能力。Wk(PSⅡ供體側傷害指數(shù))隨著銀杏葉片顏色變黃，表現(xiàn)為不斷升高的趨勢，說明在葉片黃化過程中PSⅡ供體側傷害程度逐漸加深。

隨著銀杏葉片的黃化，ETo/RC呈降低的趨勢，黃色葉與綠色葉呈現(xiàn)極顯著的差異，說明隨著葉片黃化光反應復合體吸收的用于電子傳遞的能量比例也在減少。RC/CSm的趨勢呈綠色葉>淺綠色葉>黃色葉，且3種顏色葉片的差異均達到極顯著，這樣的結果表明單位面積的反應中心數(shù)量減少是葉片黃化過程的一個重要特征。

3 討 論

在本研究中，銀杏葉片衰老過程中所有光合色素含量均下降，但是不同光合色素下降的速率存在很大差異，其中葉綠素b下降慢于葉綠素a，類胡蘿卜素慢于葉綠素，葉黃素慢于胡蘿卜素，從而導致在衰老過程中，葉片的葉綠素a/葉綠素b、葉綠素/類胡蘿卜素、胡蘿卜素/葉黃素比值下降(表1)。本研究結果顯示3種葉色銀杏葉片的吸收光譜有顯著差異(圖1)。在總體上，葉色越黃，可見光的吸收越少。在波長為310～510 nm范圍，3種葉片的光吸收差異較小，但在510～710 nm范圍，3種葉片光吸收量的差異非常清晰，在750～1110 nm范圍內，3種葉片又有相近的光吸收。本研究還觀察到隨著葉片黃化，F(xiàn)v/Fm(PSⅡ最大光化學反應效率)的變化與葉綠素含量的變化趨向一致，均為顯著下降(表2)，其他葉綠素熒光參數(shù)也發(fā)生明顯變化。

葉綠素是植物光合作用的關鍵色素，其中一小部分葉綠素a是反應中心色素，將光能轉化為化學能。在本研究中，隨著銀杏葉片黃化，葉綠素—主要是葉綠素a數(shù)量減少，導致植物光能轉化為化學能的能力降低[10-11]，葉片吸收的光能大部分成為無效吸收，從而導致光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學反應效率下降。這種變化與葉片黃化過程中光合速率的下降[12-13]相協(xié)調，這樣，可以防止激發(fā)能過剩而導致的活性氧產(chǎn)生，從而避免或減輕葉片的光氧化破壞。因此，當環(huán)境溫度較低葉片光合作用下降時，適當加快銀杏葉片失綠黃化可能有助于減緩衰老，從而推遲脫落，延長觀賞期。

類胡蘿卜素是光合作用中的輔助色素，但不可缺少，其作用之一是將吸收的光能傳遞給葉綠素，其二是保護作用，將過剩激發(fā)能以熱能的形式耗散，防止活性氧的產(chǎn)生[14-15]。在本研究中，在銀杏葉片衰老過程中所有光合色素含量都呈下降趨勢，但是類胡蘿卜素尤其是葉黃素的比例上升。這一結果也與楊舜博在銀杏金葉呈色的調控機理研究結果相同，該實驗鑒定出銀杏葉片黃化過程中調控類胡蘿卜素生物合成的關鍵基因ZDS、LCYE等均上調表達，同時KEGG分析中發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素生物合成通路存在富集現(xiàn)象，皆促進黃色葉片中類胡蘿卜素不斷積累[16]。說明在葉片衰老階段仍會產(chǎn)生大量過剩激發(fā)能，有較多的活性氧產(chǎn)生，需要類胡蘿卜素來清除。業(yè)已證明，葉黃素循環(huán)是葉片過剩激發(fā)能熱耗散的重要途徑之一[17-18]。因此，在秋季溫度降低時，適當維持葉片類胡蘿卜素含量將有助于延緩衰老脫落。

光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學反應效率是表示植物光反應能力的重要參數(shù)，植物在受到光抑制時導致Fv/Fm下降[19]。有研究者發(fā)現(xiàn)光脅迫導致PSⅡ中的D1蛋白降解，造成電子受體銳減，也會影響光合機構功能，導致光能轉化率降低[20-22]。在本研究中，淺綠葉與綠葉相比，F(xiàn)v/Fm的下降幅度較小，而黃葉與綠葉和淺綠葉相比，F(xiàn)v/Fm的下降幅度均很劇烈。然而，比較不同葉片的PSⅡ最大熒光Fm(表2)發(fā)現(xiàn)，該參數(shù)在不同葉片之間的差異遠大于Fv/Fm的差異。與綠葉相比，淺綠葉的Fm下降幅度遠大于Fv/Fm的下降，說明Fv/Fm不能很好的反映葉片衰老過程中光反應的實際變化，因為它只說明了PSⅡ反應中心的光化學反應效率，不能反映葉片總體PSⅡ活性的變化情況。在葉片衰老過程中，不僅單個光系統(tǒng)的活性發(fā)生變化，而且，活性光系統(tǒng)總數(shù)也發(fā)生變化。淺綠葉和黃色葉的RC/CSm(單位面積活性反應中心數(shù)量)均顯著低于綠色葉片。這暗示我們在用Fv/Fm衡量衰老葉片的光化學變化時，需要參考Fm和RC/CSm的變化。

4 結 論

本研究發(fā)現(xiàn)一個難以解釋的現(xiàn)象，即盡管3種顏色銀杏葉片的光合色素含量有較大差異，但在310～500和750～1110 nm波長范圍內，3種葉片光能吸收量的差異較小，與光合色素含量變化幅度不一致。這種現(xiàn)象尚未見合理的解釋。我們推測這可能與色素蛋白復合體結構變化有關。在衰老進程中，銀杏葉片色素蛋白復合體解體，色素分散，有利于吸收光能。因此，盡管在黃化葉片中光合色素含量較低，但仍能吸收較多的光能。黃化葉片的這種特性可能有利于其在白天提高葉片溫度，有助于葉片內含物的分解和向外轉運。不過，這個特性可能引起葉片衰老脫落加快，不利于其觀賞期的維持。