張志鵬，趙曉芳，易曉余，丁 麗 ，趙夢夢，沈婧玥，蒲至恩，陳國躍，李 偉*

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所，四川 成都 611130；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，四川 成都 611130)

【研究意義】普通小麥(TriticumaestivumL., 2n = 42, AABBDD)由A、B、D 3個基因組組成，基因組龐大(約14 500 Mbp)，是世界上重要的經(jīng)濟(jì)和糧食作物之一[1-3]。中國是小麥生產(chǎn)和消費(fèi)大國，據(jù)統(tǒng)計，目前我國小麥的年消費(fèi)總量在1.07～1.09×108t，其產(chǎn)量對中國的糧食安全有著重要影響[4-6]。單位面積穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒重是決定小麥單產(chǎn)高低的關(guān)鍵因素。因此，小麥穗部性狀的表現(xiàn)對小麥產(chǎn)量的最終形成具有重要影響?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，研究人員對小麥的穗部性狀進(jìn)行多方面研究。Li等[7]利用重組自交系群體(RIL)對農(nóng)藝性狀進(jìn)行QTL定位，可解釋4.42 %～70.25 %的表型變異；張坤普等[8]利用雙單倍體群體(DH)進(jìn)行穗部性狀的QTL定位，表型變異的貢獻(xiàn)率為1.48 %～15.63 %；Cui等[9]利用重組自交系(RIL)檢測到控制穗部性狀的QTL，可解釋表型變異率為4.94 %～10.97 %。因此，通過對小麥穗部性狀進(jìn)行基因定位，對提高相關(guān)性狀的育種選擇效率，促進(jìn)優(yōu)異種質(zhì)在小麥育種中的應(yīng)用具有重要意義。DArT(Diversity Arrays Technology)即多樣性微陣列技術(shù)，是一種以限制性酶切為基礎(chǔ)、依賴于芯片雜交來區(qū)分基因組中座位多態(tài)性差異的新型分子標(biāo)記技術(shù)[10-11]。DArT 標(biāo)記已用于構(gòu)建大麥、硬粒小麥等作物的遺傳圖譜[12-13]。在普通小麥中，Huynh 等[14]利用SSR和DArT 標(biāo)記相結(jié)合的方法構(gòu)建了小麥DH 群體遺傳圖譜, 并對該群體進(jìn)行了小麥籽粒果聚糖含量QTL分析；Griffiths 等[15]利用DArT 標(biāo)記和SSR標(biāo)記構(gòu)建了4個雙單倍體(doubled haploid, DH)群體的遺傳連鎖圖譜。曹東等[16]利用DArTseq標(biāo)記在F2群體進(jìn)行株高、穗長、穗粒數(shù)和千粒重等農(nóng)藝性狀的QTL定位，可解釋的表型變異率為1.4 %～29.8 %。小麥種質(zhì)10-A是四川農(nóng)業(yè)大小麥研究所創(chuàng)制的含有黑麥血緣的小穗數(shù)超過26個的不分枝多小穗數(shù)品系[17]，染色體定位表明其單株籽粒產(chǎn)量受5A、7A、1B、2B、6B、2D 和7D等染色體上的基因所控制[18]。以10-A與遺傳差異較大的材料配制的組合分析表明，小穗數(shù)、抽穗期、穗粒數(shù)和粒重等性狀在不同的基因效應(yīng)上存在著較大的差異，加性、顯性和上位性各分量對性狀在世代間的遺傳差異均具有不可忽視的重要貢獻(xiàn)[19]。對10-A在不同播期下的農(nóng)藝性狀評價表明，播期對多小穗品系10-A的多小穗數(shù)影響不明顯[20]。10-A的多小穗數(shù)目的增加與植株發(fā)育階段有關(guān)，增長單棱期和二棱期可顯著增加小穗數(shù)的數(shù)目[21]。利用10-A雜種對小穗的幼穗發(fā)育分析表明，其后代多小穗的產(chǎn)生是繼承了10-A較高的分化速率，而與分化期并沒有顯著關(guān)系[22]。【本研究切入點(diǎn)】本研究利用多小穗小麥種質(zhì)10-A與BE89雜交獲得的含有186個單株的F2群體及其衍生的 F2∶3家系群體，采用DArT標(biāo)記構(gòu)建了小麥分子遺傳圖譜，并利用4個環(huán)境條件下的表型數(shù)據(jù)對穗部性狀進(jìn)行QTL定位?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為育種中合理利用10-A等材料提供參考依據(jù)，以及為小麥穗部性狀的精細(xì)定位、基因克隆和分子標(biāo)記輔助選擇育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

多小穗種質(zhì)10-A具有多花多粒、大穗、小穗數(shù)多、千粒重低等特點(diǎn)[18-19]；小麥品系BE89為 Batavia/Erine雜交組合選育的寡小穗數(shù)穩(wěn)定品系，具有芒長、穗短、小穗數(shù)少等特點(diǎn)。2015年4月利用10-A(母本)與BE89(父本)進(jìn)行雜交獲得種子，2015年10月下旬播種F1代，成熟后混合收獲種子，2016年10月播種上一年所收獲種子，形成由186株組成的F2群體，成熟時按單株脫粒裝袋，每單株收獲種子等分成3份，2017年10月下旬種植F2收獲的單株種子，形成株系，組成F2∶3群體。所有供試材料均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 田間試驗(yàn)和性狀調(diào)查 田間試驗(yàn)在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)溫江、崇州、雅安教學(xué)基地開展。2016年10月下旬將10-A/BE89 F2群體與親本種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)溫江(E4)環(huán)境；2017年10月下旬將10-A/BE89 F2∶3家系和親本分別種植于溫江(E1)、崇州(E2)和雅安(E3)，每個系種植2行。田間播種均采用單粒點(diǎn)播，行長2 m，株距0.1 m，行距0.3 m；田間管理參照大田管理方式，生長期間未發(fā)生嚴(yán)重病蟲害和倒伏現(xiàn)象。

灌漿后期田間調(diào)查穗長(Spike Length，SL)、芒長(Awn Length，AL)、總小穗數(shù)(Total Spikelet per Spike，TSS)，成熟后收獲室內(nèi)脫粒調(diào)查穗粒數(shù)(Kernel Number per Spike，KNS)和千粒重(Thousand-Kernel Weight，TKW)。其中，F(xiàn)2群體調(diào)查單株，F(xiàn)2∶3群體每個株系中間隨機(jī)調(diào)查3株，取平均值。性狀調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)參照李立會和李秀全所著[23]《小麥種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》。

1.2.2 DArT標(biāo)記檢測 在F2群體幼苗四葉期時，取10-A/BE89 F2群體單株葉片 2 g 左右，置于液氮中備用。采取CTAB法[24]提取小麥的基因組 DNA，并用1 %的瓊脂糖電泳檢測DNA的質(zhì)量，用核酸測定儀(NanoDrop 2000/2000c)測定DNA的濃度與純度。

高通量 DArT 標(biāo)記檢測由澳大利亞 Diversity Arrays Technology Pty Ltd分析后提供，產(chǎn)品為 Wheat GBS1.0 芯片，分析檢測方法參照 Wenzl等[13]的報道。

1.2.3 表型數(shù)據(jù)分析 利用 Microsoft Excel 2010 軟件對表型數(shù)據(jù)進(jìn)行整理；利用 IBM SPSS Statistics 20.0對群體的性狀表型值進(jìn)行描述性統(tǒng)計分析；利用SAS 9.1.3軟件計算最佳線性無偏估計值(BLUP)。

1.2.4 連鎖圖譜的構(gòu)建和QTL分析 篩選雙親之間的差異標(biāo)記，再將其按照孟德爾分離理論比率(1∶3)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，除去缺失率 > 5 % 和偏分離的標(biāo)記，最后所得標(biāo)記用于遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建；利用JoinMap 4.0進(jìn)行連鎖分析，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。

使用IciMapping4.0進(jìn)行QTL定位，同時計算各QTL的加性效應(yīng)和貢獻(xiàn)率。作圖方法采用完備區(qū)間作圖法(ICIM)，PIN 設(shè)置為1，步長為1 cM，設(shè)定模擬運(yùn)算(permutation)1000 次為標(biāo)準(zhǔn)，確定最終的LOD 閾值，并以此確定QTL在染色體上的位置及數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2.1 群體的性狀表現(xiàn)

對親本10-A和BE89，以及雙親組配的F2和F2∶3群體在4個環(huán)境下的穗長、芒長、總小穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒重5個穗部性狀進(jìn)行了方差分析(表1)。結(jié)果表明，10-A在4個環(huán)境中均能保持總小穗數(shù)超過28個的多小穗特性，在穗長、穗粒數(shù)、總小穗數(shù)、芒長和千粒重數(shù)值上與父本BE89差異極顯著。穗部性狀的均值在不同環(huán)境中表現(xiàn)出差異。穗長(SL)平均數(shù)在E1中最高為11.08 cm，在E2中最低為10.18 cm；芒長(AL)平均值在E3中最高為3.52 cm，在E4中最低為3.20 cm；總小穗數(shù)(TSS)平均數(shù)在E1、E3中最高為22.1個，在E2中最低為20.2個；穗粒數(shù)(KNS)平均數(shù)在E1中最高為35.6粒，在E2中最低為23.8粒；千粒重(TKW)均值在E1中最高為41.82 g，在E2中最低為27.77 g。群體中所有性狀的平均變異系數(shù)為27.88 %。其中，芒長在4個環(huán)境下的平均變異系數(shù)最大，為44.51 %；總小穗數(shù)的平均變異系數(shù)最小，為13.04 %。穗長在E1中平均變異系數(shù)最高為25.7 %，最小在E2為12.5 %；芒長在E3中平均變異系數(shù)最高為45.7 %，最小是E1為42.5 %；總小穗數(shù)在E4中平均變異系數(shù)最高為14.9 %，最小在E3為11.6 %；穗粒數(shù)在E4中平均變異系數(shù)最高為44.3 %，最小在E1為32.1 %；千粒重在E2中平均變異系數(shù)最高為35.0 %，最小在E1為20.0 %。穗長、芒長、總小穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒重的遺傳力均較高，分別為0.95、0.86、0.90、0.94和0.96。利用最佳線性無偏預(yù)測值(BLUP)做各性狀的正態(tài)性檢驗(yàn)，5個穗部性狀在4個環(huán)境下均表現(xiàn)連續(xù)變異，基本呈正態(tài)分布，表現(xiàn)為數(shù)量性狀遺傳。性狀均表現(xiàn)出不同程度雙向超親分離現(xiàn)象，表明控制相關(guān)性狀的優(yōu)勢等位基因隨機(jī)分布于雙親的染色體上[25]。

表1 群體及其親本的性狀表現(xiàn)

2.2 分子遺傳圖譜構(gòu)建

雙親之間共篩選到4058個差異DArT標(biāo)記，經(jīng)卡方檢驗(yàn)除去缺失率>5 % 和偏分離的標(biāo)記后，最后共有 968 個DArT標(biāo)記可用于遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建。所有標(biāo)記成功連鎖到小麥21條染色體上，構(gòu)建的遺傳圖譜的總長度為1878.408 cM(表2)，每條染色體的平均長度為89.448 cM，標(biāo)記間平均遺傳距離1.94 cM。其中1B染色體上的標(biāo)記數(shù)目最多，為197個，遺傳圖譜上染色體也最長(224.337 cM)，標(biāo)記間的平均遺傳距離為1.138 cM；染色體標(biāo)記數(shù)目其次的是2B染色體，有136個；標(biāo)記數(shù)量最少是1D、7A和7B 3條染色體，均只有8個標(biāo)記，其中7B染色體標(biāo)記長度最短(10.624 cM)，平均遺傳距離為1.33 cM。染色體上標(biāo)記間的平均遺傳距離最短是4A染色體，有75個標(biāo)記，平均遺傳距離為0.63 cM；平均遺傳距離最長是7A染色體，為5.48 cM。

續(xù)表1 Continued table 1

表2 基于F2群體構(gòu)建的DArTs標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜

2.3 QTL定位分析

采用復(fù)合區(qū)間作圖法，5個穗部性狀共定位到15個貢獻(xiàn)率大于10 %的 QTL 位點(diǎn)。在 F2群體中檢測到7個QTL位點(diǎn)，在F2∶3群體中檢測到8個QTL位點(diǎn)，這些QTL位點(diǎn)分布在1A、1B、2A、2D、3B、5D和6B等 7條染色體上(表3和圖1)，單個QTL位點(diǎn)可以解釋表型變異為7.64 %～21.80 %。其中，有6個QTL位點(diǎn)集中分布在2A染色體上，而3B和6B染色體上各檢測到1個QTL位點(diǎn)。

不同形狀代表不同的性狀的QTL；○代表穗長；△代表芒長；+代表總小穗數(shù)；☆代表穗粒數(shù)；★代表千粒重Different shape represent different QTLs for different traits;○stands for spike length;△stands for awn length;+stands for total spikelet per spike;☆stands for kernel number per spike;★stands for 1 thousand-kernel weight

表3 穗部性狀QTL定位結(jié)果

2.3.1 穗長的QTL 共檢測到4個控制穗長的QTL位點(diǎn)，定位在1B和2A染色體上，其中F2群體中檢測到的QSl-2A.1、QSl-2A.2和QSl-2A.3，可以解釋的表型變異率分別為12.17 %、21.80 %和20.24 %；QSl-1B.1在F2∶3群體中檢測到，可以解釋的表型變異率10.31 %。QSl-2A.1位點(diǎn)的增效基因來自于母本10-A，而QSl-1B.1、QSl-2A.2和QSl-2A.3位點(diǎn)的增效基因來自于BE89。

2.3.2 芒長的QTL 2個與芒長相關(guān)的QTL定位在5D染色體上，其中QAl-5D.1位點(diǎn)在 F2群體和F2∶3群體中均檢測到，對表型變異的貢獻(xiàn)率分別為7.64 %和13.81 %。所檢測到的QTL的加性效應(yīng)均為正值，增效基因均來自母本10-A，對芒長表現(xiàn)出抑制作用。

2.3.3 總小穗數(shù)的QTL 4個與總小穗數(shù)相關(guān)的QTL被定位在1A和2A染色體上，單個QTL可解釋11.58 %～15.37 %的表型變異。其中，QTss-1A.1位點(diǎn)在F2∶3群體檢測到，解釋13.54 %的表型變異；QTss-2A.1和QTss-2A.1位點(diǎn)只在F2群體中被檢測到，分別解釋11.58 %與15.37 %的表型變異率；所有QTL位點(diǎn)的加性效應(yīng)均為正值，其增效效應(yīng)均來自母本10-A，表明10-A能促進(jìn)后代的小穗數(shù)提高。

2.3.4 穗粒數(shù)的QTL 1個與穗粒數(shù)相關(guān)的QTLQKns-1A.1被定位在1A染色體上，可解釋11.18 %的表型變異，在F2∶3群體中檢測到，且增效基因來源于母本10-A，與10-A穗粒數(shù)多的特性相一致。

2.3.5 千粒重QTL 5個控制千粒重的QTL被定位在1B、2D、3B、3D和6B染色體上，單個QTL可以解釋10.91 %～19.09 %的表型變異，QTkw-1B.1解釋的表型變異率最高為19.10 %。其中，4個QTL位點(diǎn)在F2∶3群體中檢測到，1個QTL位點(diǎn)在F2群體中檢測到。千粒重的所有QTL的增效基因來源于父本BE89。

3 討 論

本研究利用多小穗10-A與BE89構(gòu)建的F2和F2∶3群體，采用DArT標(biāo)記，在4個環(huán)境中共定位到控制穗長、芒長、總小穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒重等穗部性狀的15個QTL位點(diǎn)，分布在7條染色體上，單個QTL位點(diǎn)可解釋表型變異為7.64 %～21.80 %。其中，控制芒長的QTL位點(diǎn)QAl-5D.1在F2和F2∶3群體中均能檢測到，其他QTL位點(diǎn)均只能在單一群體環(huán)境中檢測到在，表明這些性狀很大程度上受到了基因型和環(huán)境的雙重影響。而穗長、芒長、總小穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒重的遺傳力均超過0.85，表明遺傳因素是主要因素。在所檢測到的QTL位點(diǎn)中，有2個QTL對表型的貢獻(xiàn)率超過20 %，為重要主效QTL位點(diǎn)。本研究中檢測到的控制穗粒數(shù)(QKns-1A.1)和千粒重(QTkw-6B.1)等位點(diǎn)與前人的定位結(jié)果相一致[26-36]，而穗長、芒長、總小穗數(shù)和千粒重的部分定位結(jié)果尚未見報道，是本研究新發(fā)現(xiàn)的QTL。

鄭有良等[26]對控制穗長的基因進(jìn)行染色體定位發(fā)現(xiàn)，10-A的穗長受1B、2D、3D、5A、6D和7A等染色體上的基因所控制；Deng等[27]在2A、2D、3A、4B、4D、5D、6B 和 7B染色體上定位11個控制穗長的QTL位點(diǎn)。本研究中穗長QTL定位在1B和2A染色體上，與前人定位在同一染色體上。在2A染色體上檢測到了3個控制穗長的QTL位點(diǎn)，表明該染色體對穗長發(fā)育調(diào)控具有重要作用，但3個QTL位點(diǎn)間的關(guān)系還有待進(jìn)一步的研究。

芒長由4 個主要的抑制基因和1 個促芒基因以及部分微效基因共同決定[28]。這些基因不同的組合決定芒的不同表現(xiàn)，基因B1、B2和B3為芒抑制基因，其中B1作用最強(qiáng)，B3作用最弱；A基因促進(jìn)芒的伸長；Hd基因是產(chǎn)生鉤芒的基因，也是芒抑制基因[29]。其中，Hd基因被定位在4AS染色體[30]，B1基因被定位在5AL染色體上[31]，B2基因被定位在6AL染色體[32]。也有研究表明，在5A、1B、3B、4B、5B和6B染色體上存在促進(jìn)芒發(fā)育的基因，在2A、6A和2B染色體上存在抑制芒發(fā)育的基因[32]。本研究在5D染色體定位到控制芒長的QTL位點(diǎn)QAl-5D.1在2個環(huán)境中均可檢測到，且均表現(xiàn)出對芒長的抑制作用，這2個QTL位點(diǎn)前人都未曾報道過，可能是新的芒長抑制基因位點(diǎn)。

Kuuar等[33]、Cui等[9]、Wang等[34]和Millet等[35]分別在2B、3D、5D和2D染色體上定位到控制總小穗數(shù)的QTL。本研究所檢測到的控制總小穗數(shù)的QTss-1A.1、QTss-2A.1和QTss-2A.2位點(diǎn)前人均沒有報道，推測為新的QTL位點(diǎn)。QTss-1A.1位點(diǎn)在2個環(huán)境中均能檢測到，表現(xiàn)穩(wěn)定，值得重點(diǎn)關(guān)注。小麥1A和2A染色體是控制總小穗數(shù)的QTL的熱點(diǎn)區(qū)域，且在1A和2A染色體上鑒定到了新QTL位點(diǎn)，接下來會重點(diǎn)關(guān)注1A和2A染色體的控制總小穗數(shù)的QTL。所有控制小穗數(shù)的QTL位點(diǎn)的增效均來自10-A，表明10-A 是適用于改良育成品種的總小穗數(shù)目進(jìn)而提高產(chǎn)量的優(yōu)異種質(zhì)。

Blanco等[36]將與穗粒數(shù)相關(guān)的QTL位點(diǎn)定位到1AL、2AS、2BL、4AL、4BS 和5AL等6個染色體上。本研究只在1A染色體上檢測到主效QKns-1A.1位點(diǎn)，與前人定位染色體相同。

鄭有良等[18]的染色體定位表明，10-A的千粒重受1B、2B、2D、5A、6B和7D等染色體上的基因所控制。Zhang等[37]對前人有關(guān)千粒重的QTL研究進(jìn)行了綜述，幾乎全部小麥21染色體上都檢測到了控制小麥千粒重的QTL，本研究利用DArT標(biāo)記也在1B、2D和6B上檢測到控制千粒重的主效QTL位點(diǎn)，與前人的染色體定位結(jié)果一致。此外，本研究檢測到3B和3D染色體上存在新的QTL位點(diǎn)。

本研究所檢測到的穗部性狀QTL位點(diǎn)對表型變異的貢獻(xiàn)率相對較低，這與前人的一些研究結(jié)果[26-37]類似，可能是因?yàn)檫@些性狀大都屬于數(shù)量性狀，由微效多基因控制，且受環(huán)境影響較大，這些QTL位點(diǎn)的位置和效應(yīng)有待于進(jìn)一步檢驗(yàn)。

4 結(jié) 論

本研究通過對F2群體和F2∶3群體多環(huán)境下的穗部性狀進(jìn)行表型鑒定，結(jié)合DArT分子標(biāo)記定位到了15個與穗部性狀相關(guān)的QTL位點(diǎn)。與前人研究比較后發(fā)現(xiàn)，這些QTL大多為新的位點(diǎn)，表明多小穗種質(zhì)10-A是可用于育種應(yīng)用的優(yōu)異種質(zhì)。本研究對于10-A穗部性狀的初步定位結(jié)果，為其分子設(shè)計育種應(yīng)用，以及控制穗部性狀的位點(diǎn)/基因的進(jìn)一步研究提供了理論基礎(chǔ)。