路亞楠， 王曉霞,2， 馬力通,2*

1. 內(nèi)蒙古科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院， 內(nèi)蒙古 包頭 014010 2. 生物煤化工綜合利用內(nèi)蒙古自治區(qū)工程研究中心， 內(nèi)蒙古 包頭 014010

引 言

腐植酸(Humic acid)是具有天然活性和藥用價值的羥基羧酸混合物[1]， 由芳環(huán)和脂環(huán)構(gòu)成， 環(huán)上連有羧基、 羥基、 羰基、 醌基、 甲氧基等官能團。 內(nèi)蒙古泥炭(Peat)儲量高達1.28億噸， 具有礦體大、 埋藏淺、 易開發(fā)的特點， 為泥炭的深加工提供了資源條件。 泥炭富含纖維， 疏松多孔， 內(nèi)表面積巨大， 吸附水分能力較強[2]， 主要作為園藝基質(zhì)， 廣泛應(yīng)用于花卉園藝等領(lǐng)域[3]， 僅將泥炭作為園藝基質(zhì)是一種浪費， 應(yīng)將泥炭作為一種化工原料， 最大限度發(fā)揮資源價值。 泥炭含有平均36%的腐植酸， 可作為腐植酸提取的原料。 現(xiàn)在多采用堿溶酸析法提取腐植酸。 Zara等[4]研究從塔爾、 查克瓦勒和奎塔的低階煤HNO3氧化后KOH提取腐殖酸， 結(jié)果表明， 3.5%濃度的KOH是提取腐殖酸的最佳濃度， 從塔爾、 查克瓦勒和奎塔的低階煤中分別提取了24.6%， 13.6%和18.0%的腐殖酸， 紫外分光光度法測定腐殖酸含量分別為29.67%， 20.1%和22.6%。 腐殖酸樣品的紅外光譜分析表明， 腐殖酸中存在羧基、 酚類、 醇類和胺類官能團。 三種腐殖酸的13C NMR譜顯示了腐殖酸中存在多種脂肪族和芳香族化合物， 如羧酸、 碳水化合物、 乙烯、 酚類和胺類等。 Trofimova[5]等研究采用氫氧化鈉和焦磷酸鈉從泥炭中提取腐植酸對巨噬細胞的活化作用， 焦磷酸鈉提取的泥炭腐植酸相比氫氧化鈉提取的具有芳香性和官能團多樣性， 對抗原呈遞細胞產(chǎn)生內(nèi)毒素有獨立刺激作用， 具有明顯優(yōu)勢。 目前關(guān)于提取泥炭腐植酸的研究中， 尚無液體酸對堿溶酸析法提取泥炭腐植酸光譜學(xué)變化特征的相關(guān)研究報道。 本實驗以草本泥炭為研究對象， 研究堿溶酸析法提取腐植酸過程中不同液體酸酸析對泥炭腐植酸光譜學(xué)變化特征的影響， 尋找最佳的酸析液體酸， 同時對比研究甲烷發(fā)酵對腐植酸光譜學(xué)變化特征的影響， 解析泥炭甲烷發(fā)酵耦合腐植酸提取的工藝機理， 通過泥炭化學(xué)組分有機質(zhì)腐植酸的分級轉(zhuǎn)化， 實現(xiàn)泥炭的轉(zhuǎn)化效益疊加， 提高泥炭資源轉(zhuǎn)化整體經(jīng)濟效益。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

草本泥炭： 吉林吉祥有限公司提供； 活性污泥： 包頭市南郊污水處理廠獲得； 傅里葉變換紅外光譜儀， 德國布魯克RX1； 紫外可見近紅外分光光度計， CAYR 5000； 熒光光譜儀， Perkin Elmer Luminescence Spectrometer LS55。

1.2 方法

(1) 草本泥炭進行微生物甲烷厭氧發(fā)酵， 在發(fā)酵的過程中， 每天定時震蕩發(fā)酵瓶， 記錄產(chǎn)氣數(shù)據(jù)， 發(fā)酵完成后， 將殘渣烘干， 提取腐植酸， 待測。

(2) 腐植酸的提取第一組為未甲烷發(fā)酵的泥炭PHA1； 第二組為甲烷發(fā)酵后的泥炭PHA2。 每組稱取一定質(zhì)量樣品， 添加5%氫氧化鈉浸泡24 h后， 加入20倍體積的蒸餾水， 調(diào)節(jié)pH值為10～12， 在80 ℃下加熱2 h， 多次離心得到上清液， 分別采用硫酸、 硝酸、 鹽酸、 磷酸調(diào)節(jié)pH值為3.0， 取下層沉淀烘干， 待測。

1.3 光譜分析

(1) 傅里葉變換紅外光譜分析取1 mg烘干的腐植酸樣品用CF-IR光譜儀(TENSOR Ⅱ03040404)測定并記錄其光譜， 所有樣品的測定條件完全一致。

(2) 熒光光譜分析發(fā)射和激發(fā)單色器的掃描速度均為1 000 nm·min-1， 發(fā)射單色器狹和激發(fā)單色器狹縫寬度均為8 nm。 熒光發(fā)射光譜從275 nm掃描到650 nm， 固定的激發(fā)波長為274 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 液體酸堿溶酸析法提取泥炭腐植酸的純度及產(chǎn)率

PHA1分別采用硫酸、 硝酸、 鹽酸、 磷酸酸析腐植酸命名為1-1， 1-2， 1-3和1-4； PHA2相應(yīng)的命名為2-1， 2-2， 2-3和2-4。

圖1(a)為不同液體酸堿溶酸析法提取腐植酸的產(chǎn)率圖， PHA1腐植酸產(chǎn)率最高， PHA2腐植酸產(chǎn)率有所降低。 PHA1腐植酸磷酸酸析(1-4)產(chǎn)率最高達52.80%， 硝酸酸析(1-2)產(chǎn)率次高45.30%； PHA2腐植酸提取時硝酸酸析(2-2)產(chǎn)率最高35.00%， 磷酸酸析(2-4)產(chǎn)率次高34.73%。 不同液體酸對堿溶酸析法提取泥炭腐植酸的產(chǎn)率有顯著影響。 表明甲烷發(fā)酵過程中會消耗掉部分泥炭腐植酸。 甲烷發(fā)酵及不同液體酸酸析對腐植酸純度影響如圖1(b)所示。 硝酸酸析腐植酸純度高于硫酸、 鹽酸、 磷酸， 其中PHA2硝酸酸析腐植酸(2-2)純度達61.03 mg·L-1， 從不同泥炭樣品使用不同液體酸酸析得到的腐植酸最大純度。 由此可知， 使用不同液體酸酸析對腐植酸的純度有較大的影響， 其中硝酸酸析腐植酸純度較大。 綜合考慮產(chǎn)率與純度， 硝酸是堿溶酸析法提取泥炭腐植酸的最佳液體酸， 與文獻[6]報道一致， 機理是源于硝酸作為氧化劑能夠氧化改性泥炭及泥炭殘渣， 得到高產(chǎn)率、 高純度腐植酸。

圖1 液體酸堿溶酸析法提取腐植酸的產(chǎn)率(a)和純度(b)

Fig.1 Productive rate (a) and purity (b) of humic acid extracted by liquid acid based alkali-extraction acid-precipitation method

2.2 液體酸堿溶酸析法提取泥炭腐植酸的紅外光譜

圖2(a)不同液體酸酸析未經(jīng)甲烷發(fā)酵的泥炭提取的腐植酸的紅外譜圖， 腐植酸標準品(0)的紅外譜圖峰強度明顯高于采用不同液體酸堿溶酸析法提取的腐植酸。 在3 500～3 000 cm-1區(qū)域內(nèi)， 不同液體酸酸析腐植酸紅外譜圖峰強度按硝酸、 硫酸、 磷酸、 鹽酸的順序呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢， 硝酸酸析腐植酸(1-2)含O—H基團最多； 在2 924 cm-1處， 硝酸酸析腐植酸(1-2)的吸收峰最強， 表明硝酸酸析腐植酸(1-2)存在較多的脂肪碳鏈結(jié)構(gòu)； 在1 750～1 680 cm-1區(qū)域內(nèi)， 硫酸酸析腐植酸(1-1)吸收較強， 鹽酸(1-3)較弱， 表明硫酸酸析腐植酸(1-1)含有較多的羰基和羧基； 在1 560 cm-1處， 代表芳香環(huán)的骨架振動， 硫酸酸析腐植酸(1-1)吸收峰最強， 芳香結(jié)構(gòu)最多； 1 460和1 380 cm-1處， 四種液體酸酸析腐植酸都具有較強的吸收峰， 在1 460 cm-1處， 硝酸酸析腐植酸(1-2)的吸收最強， 在1 380 cm-1處磷酸酸析腐植酸(1-4)吸收最強， 表明硝酸酸析腐植酸(1-2)含有較多的烷基， 磷酸酸析腐植酸(1-4)含有較多的甲基； 在1 200～1 020 cm-1區(qū)域內(nèi)， 硝酸酸析腐植酸(1-2)峰強度最大。 表明硝酸酸析腐植酸(1-2)含有更多的醇羥基， 不同液體酸酸析對腐植酸官能團有顯著影響。

圖2 液體酸堿溶酸析法提取腐植酸的紅外譜圖

Fig.2 Infrared spectra of humic acid extracted by liquid acid based alkali-extraction acid-precipitation method

(a): Humic acids of PHA1； (b): Humic acids of PHA2

色譜純腐植酸標準品命名為0； PHA1分別采用硫酸、 硝酸、 鹽酸、 磷酸酸析腐植酸命名為1-1， 1-2， 1-3和1-4； PHA2相應(yīng)的命名為2-1， 2-2， 2-3和2-4。

甲烷發(fā)酵后不同液體酸酸析腐植酸紅外譜圖如圖2(b)所示， PHA1和PHA2腐植酸的紅外譜圖出峰位置大致相似而峰面積有明顯差異， 表明甲烷發(fā)酵會影響腐植酸官能團含量。 以硝酸酸析腐植酸(1-2， 2-2)為例， PHA1硝酸酸析腐植酸(1-2)的吸收峰較強， 甲烷發(fā)酵后PHA2硝酸酸析腐植酸(2-2)吸收峰較弱， 表明甲烷發(fā)酵會引起腐植酸部分降解， 在3 500～3 000及1 200～1 020 cm-1區(qū)域內(nèi)， PHA1腐植酸在此區(qū)域的吸收強度略大； 在2 924， 1 460和1 380 cm-1范圍內(nèi)， PHA1腐植酸強度明顯高于發(fā)酵后的PHA2腐植酸； 在2 500～2 000 cm-1區(qū)域內(nèi)， 發(fā)酵前后峰強度相差不大， 此區(qū)域為三鍵和累積雙鍵的伸縮振動區(qū)域; 在1 750～1 680和1 560 cm-1范圍內(nèi)， PHA2腐植酸峰強度較大。 綜上所述， 在發(fā)酵過程中， 微生物主要利用了腐植酸脂肪鏈烴中烷基甲基等， 而對于羥基利用很少， 苯環(huán)、 三鍵和累積雙鍵幾乎沒有被利用。

2.3 液體酸堿溶酸析法提取泥炭腐植酸的熒光光譜分析

色譜純腐植酸標準品命名為1； PHA1分別采用硫酸、 硝酸、 鹽酸、 磷酸酸析腐植酸命名為1-1， 1-2， 1-3和1-4； PHA2相應(yīng)的命名為2-1， 2-2， 2-3和2-4。

圖3為固定激發(fā)波長為274 nm的條件下， 測得的腐植酸的發(fā)射光譜圖， 其中圖3(a)為未甲烷發(fā)酵不同液體酸酸析腐植酸(PHA1)的發(fā)射光譜圖， 圖3(b)為甲烷發(fā)酵后不同液體酸酸析腐植酸(PHA2)的發(fā)射光譜圖。 由圖3可知， 腐植酸熒光光譜具有對稱性， 且峰值大致出現(xiàn)在440～480 nm之間， 這是源于腐植酸含有大量苯環(huán)和雜環(huán)， 環(huán)之間以橋鍵連接， 環(huán)及環(huán)支鏈上有羧基、 酚羥基、 醌基、 甲氧基等， 即腐植酸具有多種熒光發(fā)色基團， 熒光性質(zhì)較為特殊[8]。 PHA1和PHA2腐植酸中， 以硝酸酸析腐植酸(1-2， 2-2)為例， 均在450 nm左右出現(xiàn)峰值， 以PHA1腐植酸峰值最高， PHA2腐植酸峰值最低， 根據(jù)已有報道知， 這可能是由于苯環(huán)、 羰基、 羧基存在造成干擾形成的[9]。 表明PHA2腐植酸中芳構(gòu)化程度高， 分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜， 腐植酸熒光強度因苯環(huán)、 羰基等和不同液體酸分子的相互作用而降低， 出現(xiàn)熒光猝滅現(xiàn)象。 PHA2腐植酸最大峰位置發(fā)生紅移， 由PHA1腐植酸的445 nm紅移至457 nm。 根據(jù)Zhao等[10]研究， 有機質(zhì)中芳構(gòu)化程度高的稠環(huán)等的存在， 會導(dǎo)致最大熒光峰發(fā)生紅移， 可推測發(fā)酵過程中消耗降解較多脂肪鏈烴， PHA2腐植酸的稠環(huán)比率增加， 芳香縮合度提高。

圖3 液體酸堿溶酸析法提取腐植酸的熒光譜圖

Fig.3 Fluorescence spectrogram of humic acid extracted by liquid acid based alkali-extraction acid-precipitation method

(a): Humic acids of PHA1； (b): Humic acids of PHA2

不同液體酸酸析腐植酸均在454 nm附近出現(xiàn)峰值， 而且呈現(xiàn)由磷酸、 硝酸、 鹽酸、 硫酸逐漸降低的趨勢， 表明不同液體酸酸析腐植酸官能團數(shù)目不同。 硫酸酸析腐植酸存在較多的羰基、 羧基以及苯環(huán)等芳構(gòu)化程度較大的結(jié)構(gòu)， 受到溶劑、 溶液溫度的影響導(dǎo)致熒光猝滅。 由紅外譜圖可知磷酸酸析腐植酸的甲基較多， 熒光官能團較少， 則熒光強度最高。 不同液體酸酸析腐植酸最大峰位置不同， 452 nm(1-4)， 457 nm(1-2)， 460 nm(1-3)， 462 nm(1-1)， 表明硫酸、 鹽酸酸析腐植酸的芳構(gòu)化大、 分子較復(fù)雜； 硝酸、 磷酸酸析腐植酸的稠環(huán)數(shù)目較少、 分子結(jié)構(gòu)簡單。

2.4 液體酸堿溶酸析法提取泥炭腐植酸的E4/E6分析

E4和E6表示在465和665 nm波長下的吸光度， 可以反映分子的縮合度和分子復(fù)雜程度，E4/E6的大小可以反映分子的芳香縮合度、 芳構(gòu)化度和分子量的大小[11]， 呈現(xiàn)負相關(guān)趨勢， 其比值越高， 芳構(gòu)化度越低[12]。 由表1可知， PHA1腐植酸的E4/E6均較大， PHA2腐植酸的E4/E6有所下降。 表明PHA1腐植酸的分子復(fù)雜程度較低， 芳香縮合程度低； PHA2腐植酸的E4/E6芳香縮合程度高， 在發(fā)酵過程中脂肪烴大量消耗， 而復(fù)雜的芳香結(jié)構(gòu)無法被降解消耗， 提取的腐植酸分子聚合度明顯增大。 腐植酸結(jié)構(gòu)復(fù)雜， 分子量分布很寬， 可能從幾百到幾十萬， 根據(jù)文獻中腐植酸分子量(M)與E4/E6的關(guān)系式： lgM=-0.089 3E4/E6+5.193 5[15]可估算腐植酸分子量， 可得， 腐植酸標準品(0)的分子量最大為90 916， PHA1腐植酸分子量最小和最大分別為硝酸(1-2)和硫酸(1-1)酸析腐植酸， 分子量是分別是： 55 617和24 135； PHA2腐植酸分子量最小和最大分別為鹽酸(2-3)、 硫酸(2-1)酸析腐植酸是： 58 072和51 331。 表明PHA1腐植酸的分子量小， 甲烷發(fā)酵后PHA2腐植酸的低芳香縮合程度的脂肪烴大量消耗， 而復(fù)雜的芳香結(jié)構(gòu)無法被降解消耗， 腐植酸分子量明顯增大。

表1 液體酸堿溶酸析法提取腐植酸的E4/E6

3 結(jié) 論

由掃描圖譜分析可知， 腐植酸分子是由苯環(huán)、 醇羥基、 酚羥基、 羧基、 羰基及飽和脂肪鏈烴組成的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的分子。

(1)PHA1和PHA2腐植酸的紅外譜圖在峰面積上有明顯區(qū)別， PHA1腐植酸稠環(huán)較少， PHA2腐植酸芳構(gòu)化程度高， 表明甲烷發(fā)酵會引起腐植酸部分降解。 不同液體酸酸析值得到的腐植酸紅外譜圖峰強度不同， 表明硝酸酸析腐植酸含O-H基團、 脂肪碳鏈結(jié)構(gòu)較多， 硫酸酸析腐植酸含有較多的羰基、 羧基、 醇羥基和芳香結(jié)構(gòu)， 磷酸酸析腐植酸含有及較多的甲基。

(2)腐植酸熒光光譜圖具有對稱性， 均在450 nm左右出現(xiàn)峰值， PHA1腐植酸峰值高于PHA2腐植酸峰值。 不同液體酸酸析時腐植酸峰值由高到低為磷酸、 硝酸、 鹽酸、 硫酸， 表明甲烷發(fā)酵后腐植酸稠環(huán)比率增加， 芳香縮合度提高。 硫酸、 鹽酸酸析腐植酸的芳構(gòu)化大、 分子較復(fù)雜； 硝酸、 磷酸酸析腐植酸的稠環(huán)數(shù)目較少、 分子結(jié)構(gòu)簡單。

(3)PHA1腐植酸的E4/E6比值高于PHA2腐植酸， 甲烷發(fā)酵過程中微生物會降解消耗部分易降解腐植酸， 導(dǎo)致PHA2腐植酸分子聚合程度明顯增大。 硫酸、 磷酸酸析腐植酸的分子量大、 芳香縮合度高； 硝酸、 鹽酸酸析腐植酸的分子量小、 芳香縮合度低。

綜上所述， 硝酸酸析腐植酸產(chǎn)率純度均較高， 存在較多的—OH、 脂肪碳鏈結(jié)構(gòu)， 分子量小、 稠環(huán)數(shù)目較少、 芳香縮合度低為最佳酸析液體酸。 甲烷發(fā)酵后， 腐植酸產(chǎn)率均值為32.81%， 純度均值為46.03 mg·L-1， 相較于未甲烷發(fā)酵泥炭得到的腐植酸分子量增大， 芳香縮合程度提高。 泥炭為原料， 生物甲烷聯(lián)產(chǎn)腐植酸工藝可行。