胡 悅， 付 蕓， 李欣陽(yáng)， 李永亮

長(zhǎng)春理工大學(xué)光電工程學(xué)院， 吉林 長(zhǎng)春 130022

引 言

肝癌始發(fā)于肝部細(xì)胞的癌變， 是死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]。 肝癌早期癥狀不明顯， 常會(huì)發(fā)生貽誤病機(jī)的情況。 肝纖維化最早形成是因?yàn)楦闻K發(fā)生炎癥而受損， 當(dāng)肝臟炎癥逐漸加劇， 肝纖維化程度增加形成的肝臟瘢痕組織積聚時(shí)， 將會(huì)大大提高肝癌的發(fā)生概率。 肝纖維化因其引發(fā)原因復(fù)雜， 暫無(wú)明確檢測(cè)方式。 熒光光譜技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用在多種疾病及腫瘤檢測(cè)過(guò)程中。 熒光光譜技術(shù)由于其準(zhǔn)確性高， 穩(wěn)定性強(qiáng)， 且方便易測(cè)等優(yōu)勢(shì)[2]， 已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域。 細(xì)胞病變過(guò)程會(huì)產(chǎn)生不同代謝產(chǎn)物， 肝纖維及肝癌細(xì)胞內(nèi)光敏物質(zhì)受到激發(fā)后， 產(chǎn)生不同譜線形狀或強(qiáng)度的熒光光譜， 由此分析肝纖維及肝癌細(xì)胞內(nèi)部代謝物質(zhì)的變化， 這是細(xì)胞自體熒光光譜用于生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的理論基礎(chǔ)[3]。 本研究對(duì)比肝纖維及兩種肝癌細(xì)胞的熒光光譜與正常肝細(xì)胞的光譜差異， 并結(jié)合高斯多峰擬合、 流式細(xì)胞儀分析以及非線性擬合分析， 對(duì)比四種細(xì)胞研究了熒光飽和趨勢(shì)與細(xì)胞直徑的關(guān)系。 目的在于， 為實(shí)現(xiàn)肝癌及肝纖維早期篩查工作提供光譜學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

熒光光譜儀選用FL6500測(cè)量細(xì)胞懸浮液， 狹縫的光譜帶寬為10.0 nm， 激發(fā)波長(zhǎng)488 nm， 發(fā)射波長(zhǎng)530～750 nm， 激發(fā)波長(zhǎng)間隔1 nm， 平均時(shí)間0.1 s， 掃描速度600 nm·min-1。 比色皿規(guī)格選擇0.9 mL， 每次檢測(cè)后用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗去除比色皿內(nèi)殘余樣液。 流式細(xì)胞儀選擇BD Accuri C6型號(hào)， 激發(fā)光源488 nm， 通道選擇FSC-H， SSC-H。

1.2 樣品制備

選用四種細(xì)胞分別為： 肝細(xì)胞 HL-7702[L-02]； 肝纖維細(xì)胞 LX-2； 肝癌細(xì)胞 HepG-2； 肝癌細(xì)胞 SMMC-7721(均采購(gòu)于上海富衡細(xì)胞庫(kù))。 培養(yǎng)體系選擇加入10%新生牛血清、 1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基， 置于37 ℃， 5%CO2飽和濕度的無(wú)菌培養(yǎng)箱。 防止細(xì)胞生長(zhǎng)代數(shù)影響， 選擇培養(yǎng)至一定數(shù)量的相同代數(shù)細(xì)胞。 對(duì)四種細(xì)胞分別計(jì)數(shù)， 配置細(xì)胞濃度為1.25×105， 2.5×105， 5.0×105， 1×106和2×106cells·mL-1細(xì)胞懸浮液， 每種濃度3組。 三組不添加細(xì)胞的PBS溶液， 用于去拉曼散射。 每種細(xì)胞分別配置200 μm細(xì)胞數(shù)為1×105cells的細(xì)胞懸浮液， 重復(fù)3組， 用于流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.3 熒光數(shù)據(jù)處理

在對(duì)細(xì)胞懸浮液進(jìn)行檢測(cè)時(shí)， 會(huì)受到很多因素的影響， 包括溫度、 細(xì)胞活性、 pH值等。 除此之外， 細(xì)胞懸浮液中的PBS在激發(fā)光作用下會(huì)發(fā)射出拉曼光， 產(chǎn)生背景噪聲[4]。 為了獲得細(xì)胞的熒光光譜， 需要去除PBS的發(fā)射譜影響， 如圖1所示， 細(xì)胞濃度是1.25×105cells·mL-1時(shí)拉曼散射對(duì)熒光光譜的影響。

圖1 拉曼散射對(duì)熒光光譜的影響

對(duì)獲得的熒光光譜結(jié)果， 均需要去除拉曼光的影響， 如圖2所示， 圖2(a—d)分別為去除拉曼光譜影響后， 五種濃度下肝細(xì)胞、 兩種肝癌細(xì)胞、 肝纖維細(xì)胞的自體熒光光譜。

1.4 高斯多峰擬合

高斯多峰擬合法能夠精確給出熒光峰的位置， 每個(gè)單峰的展寬和強(qiáng)度值， 適用于對(duì)熒光光譜圖進(jìn)行精確分析。 還可以結(jié)合高斯多峰擬合的相應(yīng)數(shù)值來(lái)判斷代謝物質(zhì)含量差異， 并根據(jù)獲得的最大峰值， 分析細(xì)胞熒光飽和強(qiáng)度趨勢(shì)變化。 圖3(a—d)分別是對(duì)5.0×105cells·mL-1濃度下四種細(xì)胞的高斯多峰擬合結(jié)果。 表1， 表2， 表3， 表4分別為四種細(xì)胞的高斯多峰擬合參數(shù)。

圖2 5種細(xì)胞5個(gè)不同濃度的自體熒光光譜

(a): hepatic cell HL-7702[L-02] (b): hepatoma carcinoma cell HepG-2; (c): Hepatic fibrosis cell LX-2; (d): hepatoma carcinoma cell SMMC-7721

圖3 (a)： Hl的高斯多峰擬合； (b)： Hep的高斯多峰擬合； (c)： Lx的高斯多峰擬合； (d): SMMC的高斯多峰擬合

Fig.3 (a): Gauss multi-peak fitting of HL; (b): Gauss multi-peak fitting of Hep; (c): Gauss multi-peak fitting of LX; (d): Gauss multi-peak fitting of SMMC

1.5 流式數(shù)據(jù)處理

利用流式細(xì)胞儀分析肝纖維、 肝癌細(xì)胞及正常肝細(xì)胞， 能夠獲得前向角散射光和側(cè)向角散射光雙參數(shù)散點(diǎn)圖， 如圖4所示， 為肝癌細(xì)胞Hep的流式細(xì)胞結(jié)果圖。 前向散射角與細(xì)胞直徑平方密切相關(guān)， 選擇FSC作為閾值可以排除樣品碎片以及鞘液中小液滴的干擾[5]。 利用圖像輔助流式細(xì)胞儀， 可以一次觀察大數(shù)量細(xì)胞情況， 圖中每個(gè)點(diǎn)均代表一個(gè)細(xì)胞， 通過(guò)分析橫軸SSC-H、 縱軸FSC-H細(xì)胞群落分布及聚集狀態(tài)， 可以分析四種細(xì)胞直徑特點(diǎn)[6]。

表1 HL的高斯多峰擬合參數(shù)

表2 Hep的高斯多峰擬合參數(shù)

表3 LX的高斯多峰擬合參數(shù)

表4 SMMC的高斯多峰擬合參數(shù)

圖4 Hep的流式細(xì)胞散點(diǎn)圖

2 結(jié)果與討論

2.1 自體熒光光譜分析

對(duì)細(xì)胞懸浮液進(jìn)行熒光光譜檢測(cè)時(shí)， 需要考慮到PBS溶液拉曼散射的干擾， 如圖1所示， 需對(duì)結(jié)果進(jìn)行去拉曼散射處理。

四種細(xì)胞懸浮液在488 nm波長(zhǎng)的光激發(fā)下， 獲得特異性熒光發(fā)射譜。 3組平行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果近乎相同， 造成差異的原因可能是細(xì)胞懸浮液配置不均勻造成， 實(shí)驗(yàn)先后順序不同， 此外， 細(xì)胞狀態(tài)有略微差異也會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 但結(jié)果具有可靠性。 如圖2所示， 為五種濃度細(xì)胞懸浮液的熒光光譜。 可以發(fā)現(xiàn)， 如圖2(a)所示， 肝細(xì)胞在550～750 nm之間存在兩個(gè)特異性熒光峰， 第一個(gè)峰值明顯高于第二個(gè)峰； 如圖2(b)和(d)所示， 肝癌細(xì)胞在550～750 nm之間存在三個(gè)特異性熒光峰， 第一個(gè)峰值最高， 第三個(gè)峰高于第二個(gè)峰； 如圖2(c)所示， 肝纖維細(xì)胞在550～750 nm之間存在三個(gè)特異性熒光峰， 第一個(gè)峰值最高， 第三個(gè)峰其次， 走勢(shì)和兩種肝癌細(xì)胞相似。 對(duì)比結(jié)果， 同種濃度下肝癌細(xì)胞最大熒光強(qiáng)度高于肝纖維細(xì)胞高于肝細(xì)胞。

結(jié)合高斯多峰擬合結(jié)果， 如圖3所示， 高斯多峰擬合效果貼近實(shí)驗(yàn)所得譜線， 能夠?qū)Y(jié)果進(jìn)行精確分析。 結(jié)合高斯多峰擬合參數(shù)， 如表1所示， 肝細(xì)胞第一個(gè)峰值位于592 nm處， 第二個(gè)峰位于682 nm處； 如表2， 表3， 表4所示， 肝癌， 肝纖維細(xì)胞除具有與肝細(xì)胞相同位置的兩個(gè)峰外， 在726 nm處存在第三個(gè)特異性熒光峰。 肝癌細(xì)胞和肝纖維細(xì)胞三個(gè)峰的展寬基本相同， 正常肝細(xì)胞最大激發(fā)峰展寬略小于另外三種細(xì)胞， 但是682 nm處的小峰展寬略大于病變細(xì)胞。 相同濃度下， 肝細(xì)胞兩個(gè)峰的熒光強(qiáng)度均低于另外三種細(xì)胞； 肝癌細(xì)胞三個(gè)峰的熒光強(qiáng)度略高于肝纖維細(xì)胞； 兩種肝癌細(xì)胞譜形相似， Hep的最大熒光強(qiáng)度略大于SMMC， 且726 nm處的熒光峰明顯高于SMMC。

結(jié)果說(shuō)明， 肝癌和肝纖維細(xì)胞在代謝過(guò)程中， 產(chǎn)生了同種激發(fā)峰的代謝產(chǎn)物， 而正常肝細(xì)胞并不具備。 發(fā)生病變的細(xì)胞在代謝過(guò)程中， 不僅代謝物質(zhì)種類發(fā)生變異， 物質(zhì)含量變化也十分明顯。

細(xì)胞由于內(nèi)源性熒光物質(zhì)的差異， 熒光光譜形狀也會(huì)改變。 蛋白質(zhì)是細(xì)胞主要組成物質(zhì)， 占細(xì)胞干重的一半以上， 能夠在300～350 nm范圍顯示出強(qiáng)熒光[7]。 細(xì)胞中的脂褐素的最大激發(fā)波長(zhǎng)為340～395 nm， 最大發(fā)射波長(zhǎng)為540～640 nm。 內(nèi)源性卟啉是一種大共軛環(huán)狀結(jié)構(gòu)的金屬有機(jī)化合物， 具有很強(qiáng)的熒光， 原卟啉粉末在紅光區(qū)有三個(gè)熒光峰， 分別位于628， 727和762 nm附近[8]。 熒光光譜檢測(cè)結(jié)果顯示， 肝病變細(xì)胞與健康細(xì)胞的光譜差異可能與卟啉或卟啉類結(jié)合物的產(chǎn)生有關(guān)。

2.2 熒光飽和強(qiáng)度分析

在以往研究中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞最大熒光強(qiáng)度的飽和現(xiàn)象與細(xì)胞大小相關(guān)。 圖4是利用流式細(xì)胞儀分析， 獲得的熒光信號(hào)分布圖， 圖上每一個(gè)點(diǎn)均代表一個(gè)細(xì)胞。 結(jié)果顯示四種細(xì)胞直徑比較集中， 肝細(xì)胞直徑明顯小于病變細(xì)胞， 肝癌細(xì)胞直徑最大， Hep細(xì)胞略大于SMMC細(xì)胞。

為了研究肝細(xì)胞、 肝癌細(xì)胞及肝纖維細(xì)胞的飽和程度趨勢(shì)， 可以通過(guò)高斯多峰擬合結(jié)果， 獲得每組細(xì)胞最大熒光強(qiáng)度， 并通過(guò)非線性擬合， 獲得最大熒光強(qiáng)度隨濃度變化曲線。 通過(guò)Origin 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理， 系統(tǒng)比較了多個(gè)非線性擬合方程， 調(diào)整參數(shù)， 對(duì)比結(jié)果， 最終選擇了具有最佳非線性擬合效果的Exponential-exp3p1， 結(jié)果顯示Adj.R-Square值高達(dá)0.996， 擬合效果與預(yù)期相符。

對(duì)比細(xì)胞最大熒光強(qiáng)度隨濃度變化曲線， 如圖5所示， 橫軸表示不同濃度梯度， 縱軸表示不同濃度下的最大熒光強(qiáng)度， 對(duì)擬合曲線圖進(jìn)行分析， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)四種細(xì)胞的最大熒光強(qiáng)度隨著細(xì)胞濃度增大而增強(qiáng)， 但是逐漸會(huì)呈現(xiàn)熒光飽和狀態(tài)， 單個(gè)細(xì)胞自激發(fā)熒光效率降低。 相比另外三種細(xì)胞， 肝細(xì)胞熒光飽和強(qiáng)度隨著濃度增大熒光強(qiáng)度增速降低， 明顯呈現(xiàn)出飽和趨勢(shì)， 但是飽和度相對(duì)較小。 兩種肝癌細(xì)胞和肝纖維細(xì)胞趨勢(shì)相近， 肝癌細(xì)胞熒光飽和程度高于肝纖維細(xì)胞， 飽和趨勢(shì)也更為明顯。 結(jié)合流式細(xì)胞結(jié)果， 細(xì)胞直徑越大， 熒光強(qiáng)度越大， 越容易呈現(xiàn)出熒光強(qiáng)度飽和的趨勢(shì)。

圖5 熒光飽和趨勢(shì)分析

3 結(jié) 論

對(duì)細(xì)胞懸浮液檢測(cè)時(shí)， 需除去拉曼散射對(duì)光譜的影響。 肝癌， 肝纖維細(xì)胞除具備與肝細(xì)胞相同位置的兩個(gè)峰外， 在726 nm處存在第三個(gè)特異性熒光峰。 同種濃度下兩種肝癌細(xì)胞熒光強(qiáng)度均高于肝纖維細(xì)胞高于肝細(xì)胞。 肝癌細(xì)胞直徑大于肝纖維細(xì)胞， 肝細(xì)胞直徑最小。 隨著濃度增加熒光強(qiáng)度增速降低， 逐漸呈現(xiàn)出明顯的飽和趨勢(shì)， 單個(gè)細(xì)胞自激發(fā)效率降低等現(xiàn)象。 并且細(xì)胞直徑越大， 同種濃度下獲得的最大熒光強(qiáng)度越大， 呈現(xiàn)出熒光飽和趨勢(shì)更為明顯。 本工作不僅探索了肝、 肝癌、 肝纖維細(xì)胞的熒光光譜特性， 還對(duì)比了細(xì)胞的直徑， 分析了熒光飽和強(qiáng)度變化趨勢(shì)， 為研究肝部病變的早期診斷和篩查提供了光譜學(xué)依據(jù)。

致謝： 感謝長(zhǎng)春理工大學(xué)付蕓老師的指導(dǎo)； 感謝吉林大學(xué)張平老師提供細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境， 以及細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的幫助和指導(dǎo)； 感謝長(zhǎng)春應(yīng)化所化學(xué)生物實(shí)驗(yàn)室高楠老師提供熒光光譜實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。