席 楊， 李月娥

蘭州大學信息科學與工程學院， 甘肅 蘭州 730000

引 言

隨著人類對生命科學的不斷探索， 從亞顯微水平對細胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)、 功能、 物質(zhì)間傳輸進行活性定位與實時監(jiān)測， 對于生命結(jié)構(gòu)的理解以及疾病的診治都有著十分重要的意義。 而拉曼光譜能夠揭示分子的振動信息， 同時兼具無損、 非接觸、 指紋性的優(yōu)點， 使得拉曼檢測技術(shù)被廣泛應用于生物學， 化學和材料科學等諸多學科中[1-3]。

拉曼成像是一種特殊的成像技術(shù)， 它通過采集樣本某點處的拉曼信號， 選擇指定譜峰的強度、 譜峰面積或者譜峰寬等參數(shù)并以灰度圖或偽色圖的形式顯示， 圖像明暗、 色彩的變化與指定譜峰所代表的物質(zhì)成分相對應， 便可提供物質(zhì)的濃度、 分布狀況等生物信息。

從人力、 財力、 耗時的角度來看， 拉曼檢測的采集點不宜過多， 從采集信息的完整度來看， 采集點又不宜太少， 通常實驗得到的拉曼成像含有有限的像素點， 為了滿足人們的視覺要求， 一般要對它進行插值放大(即分辨率增強)。 目前關(guān)于圖像插值方法的研究， 包括廣泛使用的最近鄰域法、 雙線性內(nèi)插法、 三次樣條內(nèi)插法[4-5]， 以及基于小波變換的圖像插值方法[6-8]。 使用這些方法對常規(guī)的圖像進行處理的實質(zhì)是根據(jù)已知像素點， 選擇合適的插值函數(shù)進行插值， 其結(jié)果是像素點有所增加， 視覺效果得到改善， 但對于拉曼檢測， 還需考慮采集點處采集信息的真實分布情況。 此外， 如圖1所示， 兩個采集點處都是以高斯光束進行激發(fā)，d表示兩個采集點之間的距離， 如果要在兩個采集點之間進行插值， 則需考慮相鄰高斯光束之間存在交疊的現(xiàn)象， 理論上， 該處插值受附近采集點處高斯光束的共同影響。 本文將基于這些特性提出一種更合理的適用于拉曼成像的插值方法。

圖1 兩個相鄰采集點處的高斯光束存在交疊

1 實驗部分

1.1 信息采集

我們以共振拉曼探針標記的細胞成像為例[9]， 對新插值方法進行檢測。 拉曼信號的采集使用了Witec共焦拉曼系統(tǒng)， 激發(fā)波長為532 nm， 激光功率為5 mW， 每點處拉曼信號的積分時間為1 s。 采集區(qū)域的面積為22 μm×22 μm, 一共采集了32×32個點， 可知相鄰像素點之間的距離為22/31 μm, 物鏡采用Plan Apo 60 NA=1.4 (Nikon, Japan)的油鏡， 高斯光束的束腰直徑約為1 μm。

1.2 光譜預處理

由于受實驗儀器、 環(huán)境以及熒光的影響， 采集的拉曼信號通常含有較大的噪聲與背景漂移[10-11]。 事實上， 光譜采集的過程中， 來自環(huán)境中的宇宙射線、 α射線和γ射線也會照射到探測器上并形成一系列非常尖銳的譜峰， 其寬度通常不超過2 cm-1， 稱為尖峰。 本文中， 我們使用已有的處理方式完成去尖峰[12]、 去噪[13]和基線校正[14]。 我們從32×32個采集點中選擇采集點(15, 7)處的拉曼信號進行呈現(xiàn)， 如圖2所示， 這里指定譜峰的波數(shù)范圍為1 027～1 480 cm-1。 此外， 由于受實驗儀器的影響， 光譜左端區(qū)域1內(nèi)存在較大漂移， 因此我們統(tǒng)一對1 024個采集點的光譜左端進行了截斷處理。

圖2 采集點(15, 7)處的拉曼信號

1.3 原始成像

對每個采集點處的拉曼信號進行預處理， 選擇指定譜峰的面積作為返回參數(shù)， 并進行歸一化顯示， 得到對應該采集區(qū)域的灰度圖及偽色圖(綠色)， 如圖3所示， 圖像中的明暗分別對應了細胞中被標記線粒體濃度的高低。

圖3 共振拉曼探針標記的線粒體拉曼成像

2 基本原理

我們選擇將原始成像放大兩倍(即64×64個像素點)來說明插值的思想。 通過取兩個相鄰高斯光束的中心垂直截面得到如圖4中對應的f(x)截面函數(shù)，d表示兩個采集點a和c之間的距離,b為a與c的中心插值點， 高斯光束的截面函數(shù)f(x)由式(1)給出， 其中，x表示插值點到采集點之間的距離。

(1)

需要注意的是， 實驗中采集的拉曼信號與高斯光束的能量成正比， 高斯光束能量的截面函數(shù)由式(2)給出， 對應圖4中的函數(shù)f2(x)。

(2)

此外， 拉曼信號的采集不是指單點處的采集， 而是以采集點為中心指定區(qū)域內(nèi)的采集， 指定區(qū)域由高斯光束能量函數(shù)的束腰決定。 如圖5所示為圖1中兩個高斯光束能量的俯視圖， 兩個采集點處的采集區(qū)域分別為圖5中兩個虛線圓所對應的部分， 虛線圓的直徑即為對應的高斯光束能量的束腰直徑， 這里模擬的是相鄰采集點處采集區(qū)域(即虛線圓部分)相切的情形， 而這也是本文實現(xiàn)插值的關(guān)鍵， 后面將詳細介紹。

圖4 采集點a和c處高斯光束的截面函數(shù)f(x)及其能量的截面函數(shù)f2(x)

Fig.4 The cross-sectional functionf(x) of the Gaussian beam at pointsa，cand the cross-sectional function of its energyf2(x)

圖5 相鄰采集點處高斯光束能量的俯視圖

我們知道， 高斯光束的束腰是由峰強下降到最大峰強的e-1所決定的， 將其代入式(1)可得

(3)

已知本文中使用的束腰為1 μm, 所以x=0.5 μm， 可以得到

w=x=0.5

(4)

將w代入式(2)得

(5)

從而得到各個采集點處高斯光束的能量函數(shù)

(6)

其中，Bi表示第i個采集點處高斯光束能量函數(shù)的幅值，x與y分別對應高斯光束在水平面沿x軸與y軸到中心處的距離， 每個采集點處面積參數(shù)是已知的， 通過對式(6)選擇以束腰直徑的指定區(qū)域并對其積分可反推出每個采集點對應的系數(shù)Bi， 進而得到每個采集點處真實的高斯光束的能量函數(shù)， 由于各個像素點處的值不一致， 與其對應的能量函數(shù)的幅值也不盡相同， 但是束腰仍然是統(tǒng)一的。

拉曼信號采集過程中， 在選定高斯光束束腰的前提下， 調(diào)整采集間隔， 使相鄰采集點的間距和高斯光束能量函數(shù)的束腰直徑滿足d=2k。 如圖6所示為相鄰采集點a和c處高斯光束能量的截面圖， 當滿足d=2k時[圖6(a)]， 中心插值點b處估計值由a2和c1兩部分構(gòu)成， 此時b處估計值剛好為a和c處值之和的一半， 這種處理方式符合插值要求， 且不會產(chǎn)生比所依賴像素點的最大值大的插值。 當d>2k時[圖6(b)]， 中心插值點b處預測值由b1和b2兩部分構(gòu)成， 此時b處估計值明顯小于a和c處值之和的一半， 這是因為采集間隔較大， 采集點之間存在一小段未采集區(qū)域?qū)е碌模?基于此得到的插值普遍較小， 成像效果隨d>2k程度的變大而變差。 當d<2k時， 采集間隔較小， 理論上中心插值點b處估計值會產(chǎn)生比所依賴像素點的最大值大的插值， 這是不符合插值要求的， 同時消耗的實驗資源也比較多。

圖6 相鄰采集點a和c處高斯光束能量的截面圖

圖7 插值點b處插值的形成

3 結(jié)果與討論

為了便于理解， 我們以四個原始像素點(對應采集點處的面積參數(shù))為例， 對其放大兩倍的具體步驟如圖8所示， 插值過程如下：

(1)選定四個原始像素點， 相鄰像素點之間的距離為d。

(2)進行邊界延拓， 本文中的處理方法是讓邊界點的值與前一個原始像素點的值保持一致。

(3)以小框中的像素點為例， 水平或垂直相鄰的像素點之間的插值點由前后或上下像素點處的值決定， 而四個像素點中心的插值點由周圍四個像素點共同決定。

(4)將步驟(3)中的小框看作一個運行窗， 遍歷所有像素點得到(4)中的處理結(jié)果， 可以看到(4)中大框右側(cè)與底部的邊界點沒有實現(xiàn)插值， 對其忽略， 這樣(4)中大框即為二倍插值的結(jié)果。

圖8 以放大兩倍為例的插值步驟

基于上述插值原理對原始成像進行插值， 得到放大后的圖像(64×64個像素點)如圖9所示， 通過對比放大前后的成像可以看到， 原始圖像由于像素點較少， 視覺上存在嚴重的馬賽克現(xiàn)象， 而放大后的圖像由于像素點增加， 成像效果更為舒適， 現(xiàn)實中我們可以根據(jù)實際要求將該方法推廣至更高的放大倍數(shù)。

圖9 基于新的插值方法放大兩倍的效果

4 結(jié) 論

介紹了拉曼成像的基本原理， 并重點闡述了一種適用于拉曼成像放大的新方法， 該方法基于采集點處信息與高斯光束能量之間的聯(lián)系， 在符合插值要求的情況下對拉曼成像實現(xiàn)插值放大， 同時對成像進行插值放大亦可大大降低采集相同像素點數(shù)目所耗的時間。 將新方法應用到實驗采集到的拉曼成像中， 得到了良好的放大效果， 同時我們相信該方法可以作為拉曼成像放大處理的有力工具。 此外， 該新方法還具有在其他光譜成像放大中應用的潛在價值。