毛旖川，周強(qiáng)，朱默，汪靈杰，郭凌川，李勇剛

醒后卒中是急性腦卒中的一種特殊類(lèi)型，是指患者在睡眠中發(fā)生的卒中。由于患者發(fā)病時(shí)間不明確，常被排除在溶栓治療之外。目前，臨床上常采用DWI與T2-FLAIR的不匹配來(lái)觀察缺血半暗帶的存在與否及范圍，并推測(cè)大致發(fā)病時(shí)間，但其準(zhǔn)確性尚有待提高。臨床上迫切需要尋找新的能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)醒后卒中患者動(dòng)脈栓子形成時(shí)間、栓子成分及可溶性的定量影像學(xué)分析方法。MRI T1-mapping及T2-mapping技術(shù)能夠定量評(píng)估病變組織的不同成分及水含量的差異，有望區(qū)分不同性質(zhì)與成分的動(dòng)脈栓子。本研究初步探討MRI T1-mapping及T2-mapping技術(shù)用于兔頸總動(dòng)脈血栓定量測(cè)量的可行性，為進(jìn)一步開(kāi)展腦卒中患者動(dòng)脈栓子成分及形成時(shí)間MRI評(píng)估的臨床研究奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

材料與方法

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型制作

選用健康雄性新西蘭大白兔20只，清潔級(jí)，2～3月齡，體重1.5～2.0 kg，隨機(jī)分為4組，分別為4.5 h組、6.0 h組、8.0 h組及12.0 h組，每組5只。實(shí)驗(yàn)用兔均由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用經(jīng)蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

頸總動(dòng)脈血栓模型采用頸總動(dòng)脈內(nèi)注射凝血酶的方法建立。具體方法如下：新西蘭大白兔肌肉注射速眠新(0.2 mL/kg)及耳緣靜脈注射1%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)麻醉后，取頸部正中切口，沿右側(cè)胸鎖乳突肌外側(cè)緣分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈(圖1)，頸總動(dòng)脈中段兩端放置血管夾，中間長(zhǎng)度約15 mm，微量注射器穿刺針抽取凝血酶10U及兔夾閉頸總動(dòng)脈段內(nèi)自體血，混合30～60 s，隨后注射至夾閉的頸總動(dòng)脈管腔內(nèi)，5分鐘后先松開(kāi)近端血管夾，再過(guò)5 min后松開(kāi)遠(yuǎn)端血管夾。止血后逐層縫合肌肉與皮膚，術(shù)后肌肉注射青霉素40萬(wàn)單位。MRI及手術(shù)病理發(fā)現(xiàn)局部頸總動(dòng)脈血栓形成為建模成功。

2．磁共振檢查

動(dòng)物麻醉:各組兔頸總動(dòng)脈血栓模型建立后根據(jù)相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行MRI掃描，掃描前先經(jīng)耳緣靜脈注射地西泮(安定)1 mL，然后肌肉注射速眠新0.2 mL/kg。

MRI掃描序列及參數(shù)：MRI檢查采用Siemens Skyra 3.0T磁共振成像系統(tǒng)，16通道膝關(guān)節(jié)線(xiàn)圈，兔子取俯臥位，頭先進(jìn)。掃描序列包括3D-TOF、T1WI、T2WI黑血、T1-mapping及T2-mapping序列。主要掃描參數(shù)：①3D-TOF序列，TR 20 ms，TE 3.11 ms，視野150 mm×150 mm，層厚1 mm，層數(shù)96層，層間距0 mm，掃描時(shí)間2 min 33 s；②冠狀面T1WI黑血序列，TR 650 ms，TE 23 ms，視野150 mm×150 mm，層厚0.8 mm，層數(shù)10層，層間距0 mm，掃描時(shí)間53 s；③橫軸面T1WI黑血序列，TR 731 ms，TE 10 ms，視野150 mm×150 mm，層厚2 mm，層數(shù)8層，層間距0 mm，掃描時(shí)間5 min 51 s；④橫軸面T2WI黑血序列，TR 678 ms，TE 61 ms，視野150 mm×150 mm，層厚2 mm，層數(shù)8層，層間距0 mm，掃描時(shí)間2 min 32 s；⑤T1-mapping序列，翻轉(zhuǎn)角分別為5°和26°，TR 15 ms，TE 2.49 ms，視野160 mm×160 mm，層厚2 mm，層數(shù)8層，層間距0 mm,掃描時(shí)間2 min 34 s；⑥T2-mapping序列，TE分別為11.2、22.4、33.6、44.8、56 ms，TR 1950 ms，視野160 mm×160 mm，層厚2 mm，層數(shù)8層，層間距0 mm，掃描時(shí)間5 min 37 s。

圖像分析:所有圖像均上傳至PACS工作站，由2位有經(jīng)驗(yàn)的影像診斷醫(yī)師分別對(duì)MRI圖像進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。根據(jù)圖像有無(wú)偽影及變形、是否能分辨血栓等對(duì)圖像質(zhì)量進(jìn)行評(píng)分：1分，圖像偽影較多，變形嚴(yán)重，不能顯示血栓，不能用于診斷；2分，圖像有少許偽影，可分辨血栓，不影響診斷；3分，圖像質(zhì)量非常好，無(wú)偽影，血栓顯示清晰。

T1值及T2值的測(cè)量：在Siemens Skyra 3.0T的工作站上直接打開(kāi)T1-mapping的原始圖像及偽彩圖，首先預(yù)覽T1-mapping的原始圖像，觀察血栓的走行及大小，然后將原始圖像與偽彩圖對(duì)應(yīng)，在原始圖像選擇血栓中心位置及合適的大小勾畫(huà)ROI，在偽彩圖相應(yīng)位置測(cè)量T1值。以同樣的方法測(cè)量T2值。

3.病理學(xué)檢查

MRI檢查結(jié)束后，經(jīng)兔耳緣靜脈注射肝素(200 U/kg)抗凝，以空氣栓塞法處死實(shí)驗(yàn)兔。解剖并游離右側(cè)頸總動(dòng)脈血栓，以4%的多聚甲醛液固定，石蠟包埋，行常規(guī)HE染色，鏡下觀察。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1.兔頸總動(dòng)脈血栓模型成功率及病理檢查結(jié)果

經(jīng)病理證實(shí)，20只兔子均建模成功。兔頸總動(dòng)脈血栓肉眼觀察均呈紅色血凝塊，大小0.5～1.0 cm，邊緣略不規(guī)則。各組血栓切片HE染色鏡下顯示淡粉色的纖維蛋白網(wǎng)羅大量紅細(xì)胞，混雜有核細(xì)胞成分(圖2)。

2.MRI圖像質(zhì)量評(píng)價(jià)及定量MRI測(cè)量

兩位醫(yī)師對(duì)20只頸總動(dòng)脈血栓模型兔的MRI各序列圖像質(zhì)量評(píng)分均在2分以上，各序列圖像質(zhì)量主觀評(píng)分結(jié)果的一致性較好(表1)。

兔頸總動(dòng)脈血栓在3D-TOF圖像上均表現(xiàn)為管腔內(nèi)低信號(hào)的充盈缺損(圖3)；T1WI、T2WI黑血序列圖像上血栓均表現(xiàn)為高信號(hào)(圖4～5)；T1-mapping原

表1 不同MRI序列圖像質(zhì)量評(píng)分結(jié)果

始圖像上血栓表現(xiàn)為相對(duì)低信號(hào)，T1-mapping偽彩圖可清楚顯示血栓(圖6)；T2-mapping原始圖像上血栓表現(xiàn)為高信號(hào)，T2-mapping偽彩圖可顯示血栓(圖7)。

建模后4.5 h、6.0 h、8.0 h及12.0 h組血栓T1值及T2值的平均值見(jiàn)表2。T1值各時(shí)間點(diǎn)組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。4.5 h組與6.0 h組的T2值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，余各時(shí)間點(diǎn)組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，表3)。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)血栓T1值及T2值

表3 各組間血栓T1值與T2值多重比較的P值

討 論

醒后卒中血管內(nèi)栓子的來(lái)源主要是心源性栓子和動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)斑塊破裂后局部血栓形成或脫落的斑塊，大腦中動(dòng)脈是血管栓塞最常見(jiàn)的部位。人大腦中動(dòng)脈的管徑與家兔的頸總動(dòng)脈管徑相近，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建新西蘭大白兔頸總動(dòng)脈血栓模型并進(jìn)行MR成像研究，初步評(píng)估MRI T1-mapping及T2-mapping技術(shù)用于顱頸動(dòng)脈血栓評(píng)價(jià)的圖像質(zhì)量及判斷血栓形成時(shí)間的可行性，為進(jìn)一步開(kāi)展醒后卒中的臨床MRI定量研究奠定基礎(chǔ)。

目前，常用的動(dòng)脈血栓動(dòng)物模型建立的方法包括自體血栓栓塞法、光化學(xué)法及球囊損傷結(jié)合高脂飲食飼養(yǎng)法。本研究采用了操作簡(jiǎn)便、建模時(shí)間短的自體血栓栓塞法。自體血栓栓塞法通常為在目標(biāo)血管內(nèi)注射凝血酶或通過(guò)介入的方法在特定血管放置自體血栓。筆者對(duì)凝血酶注射法進(jìn)行改良，抽取頸總動(dòng)脈內(nèi)的自體血與凝血酶混合后注射到兩端夾閉的頸總動(dòng)脈內(nèi)。改進(jìn)的凝血酶法在注射器中將自體血與凝血酶混合，形成一種高凝狀態(tài)，一方面減少了穿刺時(shí)動(dòng)脈血外溢，另一方面凝血酶能使形成的血栓塊更好地固縮，以防自溶[1]。改良的凝血酶法一方面保證了血栓形成的成功率，另一方面克服了血管介入操作的技術(shù)難題，為血栓定量MRI測(cè)量研究提供了簡(jiǎn)單易行的動(dòng)物模型建模方法。

本研究中，MRI T1-mapping及T2-mapping成像在保證圖像信噪比的前提下，采用大矩陣、小視野進(jìn)行掃描，提高了圖像的空間分辨率并降低了測(cè)量誤差。結(jié)果表明T1-mapping及T2-mapping的圖像質(zhì)量較高，掃描時(shí)間短，能夠滿(mǎn)足臨床診斷要求。

T1-mapping及T2-mapping是MRI定量測(cè)量最新發(fā)展起來(lái)的技術(shù)，相關(guān)研究表明T1-mapping及T2-mapping技術(shù)能較敏感地反映組織成分及含水量的細(xì)微變化[2,3]。Caspar等[4]采用T1-mapping和T2-mapping技術(shù)研究心內(nèi)血栓的T1值和T2值的變化，發(fā)現(xiàn)形成時(shí)間小于一周的新鮮心內(nèi)血栓的T1值平均值為(911±177)ms，小于形成時(shí)間大于一個(gè)月的陳舊性心內(nèi)血栓(1169±107)ms；心內(nèi)血栓的T2值兩者無(wú)明顯差異(73.8±7.3)ms vs (71.9±10.9)ms。目前，尚未見(jiàn)有關(guān)T1-mapping及T2-mapping技術(shù)在腦卒中動(dòng)脈栓子MR成像方面的研究報(bào)道。

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)發(fā)病后3.0～4.5 h靜脈使用重組組織型纖溶酶原激活劑(rt-PA)溶栓治療仍然有效[5-7]，認(rèn)為AIS溶栓時(shí)間窗可延長(zhǎng)至發(fā)病4.5 h內(nèi)。6 h是目前臨床上使用尿激酶溶栓的時(shí)間窗[8]。根據(jù)國(guó)際慣例以“最后正常”的時(shí)間計(jì)算發(fā)病時(shí)間窗，醒后卒中的發(fā)病時(shí)間窗與正常人的睡眠時(shí)間大致相同，通常為8～12 h。因此本研究選取了血栓形成后4.5 h、6.0 h、8.0 h及12.0 h等較早期的時(shí)間點(diǎn)作為關(guān)鍵的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行分析。

血栓主要由紅細(xì)胞、血小板及纖維蛋白構(gòu)成，各成分的構(gòu)成比不同，則血栓的可溶性及硬度也大不相同。臨床研究表明，血栓內(nèi)紅細(xì)胞含量越高，溶栓效率及血管再通率越高[9,10]。心源性栓子形成時(shí)間較長(zhǎng)，硬度及溶栓難度較大；AS斑塊破裂后局部血栓形成時(shí)間短，硬度及溶栓難度小。血栓的形成時(shí)間、成分、可溶性與臨床治療密切相關(guān)。血栓形成后不同時(shí)間點(diǎn)含水量會(huì)發(fā)生變化，隨著紅細(xì)胞萎縮脫水，纖維蛋白收縮增強(qiáng)，血清析出，使得血栓中的水分逐漸減少。血栓形成早期，紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白會(huì)經(jīng)歷氧合血紅蛋白-脫氧血紅蛋白-正鐵血紅蛋白的變化并導(dǎo)致血栓MRI信號(hào)的變化。血栓形成晚期，血栓逐漸機(jī)化，由新生結(jié)締組織、殘存的纖維蛋白及細(xì)胞碎片取代紅細(xì)胞、血小板及纖維蛋白，血栓MRI信號(hào)也隨之發(fā)生改變[11]。

本研究是對(duì)形成時(shí)間較早(12 h以?xún)?nèi))的血栓進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)血栓的T1值和T2值隨時(shí)間推移呈逐漸下降的趨勢(shì)。在該時(shí)期內(nèi)血栓的含水量逐漸減少，故T1值與T2值表現(xiàn)為逐漸縮短。此時(shí)，紅細(xì)胞內(nèi)的氧合血紅蛋白向脫氧血紅蛋白轉(zhuǎn)變，脫氧血紅蛋白為順磁性物質(zhì)，能夠縮短T1值與T2值。脫氧血紅蛋白縮短T2值的效應(yīng)較T1值顯著，這可能是T2值變化的差異較T1值顯著的原因。4.5 h組與6.0 h組未有明顯的變化可能是由于兩組之間的時(shí)間間隔較短以及實(shí)驗(yàn)樣本量較小的緣故。

本研究仍存在一定局限性：①樣本量小且只研究了12 h內(nèi)血栓信號(hào)的變化；②研究對(duì)象為動(dòng)物模型的血栓，跟患者的實(shí)際血栓類(lèi)型存在一定差異；③僅用HE染色證實(shí)血栓的病理，沒(méi)有進(jìn)一步分析血栓成分。

綜上所述，采用改良的凝血酶法建立兔頸總動(dòng)脈血栓模型，操作簡(jiǎn)單易行，建模成功率高。MRI T1-mapping及T2-mapping技術(shù)對(duì)兔頸總動(dòng)脈內(nèi)血栓成像的圖像質(zhì)量良好，能夠滿(mǎn)足臨床診斷要求，并且初步驗(yàn)證了定量MRI技術(shù)可以顯示動(dòng)脈血栓形成時(shí)間的變化。定量MRI T1-mapping及T2-mapping技術(shù)應(yīng)用于醒后卒中腦動(dòng)脈栓子形成時(shí)間及成分的判斷具有理論及技術(shù)上的可行性，為后續(xù)研究不同時(shí)間點(diǎn)血栓及不同性質(zhì)栓子的臨床MRI評(píng)估奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。