楊輝,趙新宇，解海洋，宋潔，楊東曉，劉笑茹

（遼東學院，遼寧 丹東 1 1 8 0 0 3）

膠原蛋白在化妝品、皮革、食品、生物醫(yī)學材料、膜工業(yè)、制藥業(yè)等方面應用廣泛[1]，是動物來源最豐富的蛋白，大概占動物總蛋白的30%[2]。

安康魚屬冷溫性底層魚類，常棲伏海底，分布于北太平洋西部，我國產于東海北部、黃海及渤海[3]。由于安康魚不僅營養(yǎng)豐富還具有一定的藥用價值，逐漸受到人們的歡迎，其需求量連年上漲，加之出口需求旺盛，產量和價格大幅增加，安康魚出口已成為我國的新興產業(yè)。但在安康魚的深加工中，被視為下腳料的魚腸遭到大量廢棄，這不僅浪費了漁業(yè)資源而且污染環(huán)境。

目前已有研究報道水產動物的膠原蛋白在一些方面明顯優(yōu)于陸生動物的膠原蛋白，比如具有低抗原性、低過敏性等特性。因此水產膠原蛋白可能逐步替代陸生動物膠原蛋白[4]。而多糖具有良好的保濕作用，故兩者可作為化妝品的有效成分。此外，膠原蛋白水解物還可用馬來酸酐?；笈c丙烯酸共聚，制得一種陰離子蛋白復鞣劑。

實驗從安康魚腸中提取膠原蛋白和多糖，探索安康魚腸的高價值加工利用途徑和經濟效益。以安康魚腸為原料，通過實驗確定安康魚腸膠原蛋白和多糖的最佳提取條件。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

AB204-E電子天平（精確到0.0001），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-9000紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；高速臺式離心機，湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司；RE-2010旋轉蒸發(fā)儀，廣州市星爍儀器有限公司；RHG-100在線干燥儀，武漢瑞恒工控技術有限公司；Corneometer 825 Courage Khakaza Cologne Germany皮膚水分含量測試儀；CN63M索氏提取器，北京中西遠大科技有限公司；DHG-9055A臺式鼓風干燥箱，重慶市松朗電子儀器有限公司。

1.2 試劑及其配制

氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯仿、(NH4)2SO4、Tris- 醋酸、醋酸鈉、EDTA、SDS（十二烷基硫酸鈉）、葡萄糖、95%乙醇、正丁醇、石油醚、苯酚、濃硫酸均為分析純，均購自福晨（天津）化學試劑有限公司；胃蛋白酶（比活力1∶3000），上海滬震實業(yè)有限公司；Sevag試劑 ［氯仿∶正丁醇=5∶1（V/V）］；PBS（磷酸緩沖溶液：氯化鈉 2.0000 g,氯化鉀0.0500 g,磷酸氫二鈉0.3600 g，磷酸二氫鉀0.0600 g,加蒸餾水定容至250 mL）；細胞裂解液（0.04 mol/L Tris-醋酸溶液，0.02 mol/L醋酸鈉，0.001 mol/L EDTA,1%SDS）。

1.3 樣品預處理

①魚腸預處理[5]：安康魚腸解凍洗凈，除去內層雜物與外層肥膏，切成塊狀，用2.5%NaCl溶液處理10 h，離心，去除廢液，作為提取的原料；

②80℃恒溫烘干（冷凍過的魚腸，烘干較快），在烘干之前將魚腸剪碎，以增大烘干速率，魚腸烘干至重量不再變化；

③將烘干的魚腸磨成粉末，封藏備用。

1.4 膠原蛋白和多糖提取

1.4.1 膠原蛋白的提取

①粗提：將研磨的魚腸粉放入高速臺式離心機中調節(jié)轉速2000 rpm離心10 min；棄上清，沉淀用預冷的PBS懸浮，2000 rpm離心10 min；棄上清，將沉淀重懸于預冷的緩沖液中沖洗，4℃，2000 rpm離心10 min；棄上清，將沉淀重懸于200 mL預冷的細胞裂解液中，搖勻、冰浴30 min，得到沉淀粗產物低溫烘干備用。

②酶解除去雜蛋白：將①得到的沉淀與蒸餾水以一定的料液比取好，加入定量的胃蛋白酶，調節(jié)溶液pH值及酶解時間，在10℃下勻漿后過濾，濾液以8000 rpm低溫離心20 min，取上清液；

③鹽析：取上清液用NaOH(0.4%)溶液調試樣pH至7.0，緩慢加入固體(NH4)2SO4，使其濃度達到1.5 mol/L，不斷攪拌至固體完全溶解，靜置10～12 h。鹽析完成后低溫離心取沉淀，最后用0.5 mol/L HAc溶液洗脫沉淀，于-18℃低溫保存，按文獻[6]方法計算提取率。

④測量保濕性：在室溫（25℃)環(huán)境下，用電容皮膚水分含量測試儀測定皮表含水量。

1.4.2 多糖提取

①將魚腸粉用濾紙包裝后，用石油醚進行索氏脫脂處理，脫脂1.5 h后用80℃烘箱烘干；

②以蒸餾水為溶劑，在一定的料水比、溫度和提取時間下，進行魚腸多糖的提取。將魚腸提取液抽濾，合并濾液，濃縮至25 mL，加入95%乙醇至終濃度為75%，醇沉，靜置24 h，待多糖呈絮狀沉淀析出后，5000 rpm離心15 min得沉淀（如果醇沉效果好無需離心）；

③沉淀中加入50 mL蒸餾水復溶，將水溶液置于分液漏斗中，加入12 mL Sevag試劑，以除去溶液中的蛋白質；上清液中加入0.5%的活性炭，搖勻，恒溫靜置30 min，過濾得多糖溶液，采用苯酚硫酸法[7]測其含量，其多糖提取率按下式計算。

④測量保濕性：在室溫（25℃)環(huán)境下，用電容皮膚水分含量測試儀測定皮表含水量。

2 結果與討論

2.1 提取膠原蛋白最佳酶條件的確定

要想提高安康魚腸膠原蛋白的提取率，必須想辦法增大其溶解度,本實驗選用酶法提取魚腸中的膠原蛋白。實驗從選擇不同的料液比、胃蛋白酶的添加量和提取時間三個方面來確定最佳的提取工藝。

2.1.1 用單因素法確定胃蛋白酶的最佳添加量

分別選取胃蛋白酶質量分數(shù) (胃蛋白酶占魚腸的百分數(shù))0.5%、1.0%、1.5%、2.0%，進行實驗。實驗時先將其它四個量固定，如料液比為1∶10,酶解時間4 h,酶解溫度10℃,pH 1.9。結果如圖1所示,在胃蛋白酶添加量為1%時,提取效果較好。當胃蛋白酶添加量為0.5%時,提取液中膠原蛋白得率偏低,而胃蛋白酶添加量為1.5和2%時,提取液中膠原蛋白得率雖然比1%時高,但高的不多，2%時也只高了0.13%，而酶用量卻增加了一倍，這是因為酶量過低，底物不能充分反應，過高又會引起酶分子之間的相互作用，阻止酶解反應的順利進行[8]，所以1%的胃蛋白酶添加量是最佳胃蛋白酶添加量。

圖1 最佳胃蛋白酶添加量的確定

2.1.2 最佳酶解時間

由2.1.1可知胃蛋白酶添加量為1%時，按料液比為1∶10，酶解溫度10℃,pH 1.9的條件，選擇酶解時間分別為 1 h、2 h、3 h、4 h、5 h 進行實驗。由圖 2所示,提取效果最好的是酶解時間4 h。隨著提取時間的增加,魚腸中膠原蛋白提取率開始逐漸增加,到4 h后,魚腸中膠原蛋白得率開始降低,故確定最佳酶解時間為4 h。

圖2 最佳酶解時間

2.1.3 最佳料液比的確定

在固定了胃蛋白酶質量分數(shù)1%，酶解時間4 h,酶解溫度10℃，pH 1.9條件下，考察料液比對膠原蛋白提取率的影響。分別取料液比為1∶5、1∶10、1∶15和1∶20四個水準,以料液比為變量進行考察，實驗結果如圖3所示。結果表明，當料液比為1∶10時提取效果最好。當料液比繼續(xù)增加，魚腸中膠原蛋白得率逐漸降低，故確定最佳料液比為1∶10。

圖3 最佳料液比的確定

2.2 提取多糖最佳條件的選擇

2.2.1 最佳料水比的選擇

因為多糖易溶于水，所以用蒸餾水為溶劑，固定提取溫度為90℃，提取時間為2 h，比較料水比1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7 時魚腸多糖的提取率。如圖4所示，當料水比為1∶5時多糖的提取率最高，故最佳料水比定為1∶5。

圖4 最佳料水比

2.2.2 最佳提取時間的選擇

由2.2.1可知最佳料水比為1∶5，同時固定提取溫度 90℃，比較提取時間 1 h、2 h、3 h、4 h 時的多糖提取率。以魚腸多糖提取率為指標，以提取時間為橫坐標，進行魚腸多糖的提取研究。由圖5可見，當提取時間為2 h時，提取效果最好。

圖5 最佳提取時間

3 吸濕性(M M V/%)測試結果

在室溫下使用電容皮膚水分含量測試儀測試皮表水分，以不涂試劑為空白，比較了常用的保濕劑透明質酸原液、丙三醇和本實驗從安康魚腸中提取的膠原蛋白、多糖[9]（各5 g）在人體皮膚上的保濕性，結果如表1所示。

表1 各種保濕劑在皮膚上的含水量

由表1可見，安康魚中的膠原蛋白和多糖有一定的保濕功效。

4 結語

利用單因素實驗選取了提取安康魚腸中膠原蛋白及多糖的最佳工藝，結果發(fā)現(xiàn)安康魚魚腸膠原蛋白提取時，最佳液料比為1∶10，最佳胃蛋白酶質量分數(shù)為1%，最佳酶解時間為4 h條件下，提取效果最好，其提取率為11.3%。多糖在脫脂1.5 h后以蒸餾水為溶劑，料水比1∶5、溫度90℃和提取時間2 h時，提取效果最好，其提取率為1%。分析發(fā)現(xiàn)，本實驗提取膠原蛋白的價值較大，對于多糖的提取效果較差，有待于進一步改進。

安康魚腸中多糖與膠原蛋白質均具有良好的吸水性和保濕性，如果和一些無機吸水物質復配可以配成良好的化妝品[10]及皮革復鞣劑，為皮革復鞣劑合成提供了新思路，這是我們下一步要做的工作。若能對大量廢棄魚腸規(guī)模化處理，有效提取魚腸中的膠原蛋白和多糖，不僅可以節(jié)約資源及減少環(huán)境污染，而且還綠色環(huán)保，符合現(xiàn)代的綠色可持續(xù)發(fā)展理念。