殷淑君 張 坤 蔣知新

(1 北京回龍觀醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京市 100096，電子郵箱：Yinshujunots@163.com；中國(guó)人民解放軍第三〇五醫(yī)院2 泌尿外科，3 中心實(shí)驗(yàn)室，北京市 100017)

肝癌是發(fā)病率和病死率均較高的惡性腫瘤之一。原發(fā)性肝癌按照病理類型可分為3種，其中90%為肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，因早期癥狀不明顯，多數(shù)HCC患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)為中晚期[1]。目前，肝癌診斷主要依賴于影像學(xué)檢查和組織活檢，在腫瘤早期篩查及診斷方面仍存在困擾[2]。隨著對(duì)腫瘤標(biāo)志物的了解加深與重視，腫瘤相關(guān)蛋白標(biāo)志物已成為重要的輔助診斷、判斷預(yù)后和指導(dǎo)治療的生物學(xué)指標(biāo)[1]。甲胎蛋白為臨床常規(guī)使用的肝癌相關(guān)血清學(xué)標(biāo)志物，而妊娠、生殖腺胚胎癌和普通活動(dòng)性肝病等患者也會(huì)出現(xiàn)甲胎蛋白的持續(xù)升高，且部分HCC患者，尤其是高分化和低分化或已壞死液化HCC患者的甲胎蛋白水平并不升高，因此亟須尋找新的更可靠的標(biāo)志物。α-烯醇化酶(alpha-enolase,ENO1)作為糖代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，在細(xì)胞能量代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]。近年有大量研究證實(shí)了其表達(dá)量的變化與多種疾病之間密切相關(guān)[4-5]。也有研究證實(shí)，相對(duì)于正常癌旁組織，肝癌組織中的ENO1呈高表達(dá)，且ENO1的高表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲[6-7]。以上提示ENO1可能為潛在的肝癌相關(guān)血清學(xué)指標(biāo)，但目前關(guān)于ENO1在肝癌患者外周血中的表達(dá)研究極少。本研究旨在探究HCC患者外周血血清中ENO1蛋白水平在肝癌診斷中的意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2017年10月至2019年8月解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心及中國(guó)人民解放軍第305醫(yī)院肝病科、肝膽外科、腫瘤科收治的所有HCC、肝硬化患者作為研究對(duì)象，其中90例HCC患者作為HCC組，45例肝硬化患者作為肝硬化組。均由經(jīng)驗(yàn)豐富的臨床醫(yī)生嚴(yán)格按照相關(guān)指南[8-9]做出診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)檢查、病理學(xué)檢查最終診斷為HCC或肝硬化且未接受過(guò)放療、化療及手術(shù)治療的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他癌癥患者；接受過(guò)手術(shù)、放化療及其他抗腫瘤治療者；其他原因?qū)е碌膰?yán)重肝損害者或其他嚴(yán)重疾??；存在認(rèn)知障礙和語(yǔ)言障礙、無(wú)法進(jìn)行良好溝通者；臨床資料不完善，不符合本研究需求者。另選取同期于上述醫(yī)院體檢中心進(jìn)行健康查體者45例作為健康對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：各項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物值均正常，影像學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)、占位等。排除標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)存在異常，影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)、占位者；合并其他嚴(yán)重疾病者。HCC組年齡(58.58±9.59)歲，男性73例；肝硬化組年齡(60.58±11.28)歲，男性35例；健康對(duì)照組年齡(61.96±7.87)歲，男性36例。3組患者的年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究通過(guò)中國(guó)人民解放軍第305醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理部門審查，所有調(diào)查對(duì)象在調(diào)查取樣前均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本的采集與保存：治療前，所有研究對(duì)象均空腹12 h以上，于次日清晨采集空腹靜脈血4 mL，采血后30 min內(nèi)以3 000 r/min離心10 min，分離上層血清，記錄患者信息及標(biāo)本收集時(shí)間后將血清儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱待檢。

1.2.2 ENO1的檢測(cè)：采用ELISA法檢測(cè)血清中的ENO1水平，人ENO1 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)：ab181417)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。(1)取出實(shí)驗(yàn)所需要的所有試劑，在室溫下平衡30 min，按照說(shuō)明書配制實(shí)驗(yàn)試劑。(2)配制ENO1標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液并進(jìn)行梯度倍比稀釋，稀釋后濃度依次為800 ng/mL、400 ng/mL、200 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL、25 ng/mL、12.5 ng/mL、0 ng/mL。(3)在96孔反應(yīng)板中依次加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣本、50 uL抗體混合液，將反應(yīng)板密封，室溫下置于搖板機(jī)上孵育1 h，棄去孔中液體，每孔加入350 μL清洗液，清洗3次。最后一次清洗后，將反應(yīng)板翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，用干凈的紙巾吸干多余的液體。隨后，每孔加入100 μL 四甲基聯(lián)苯胺反應(yīng)底物，室溫下避光放置于搖床上10 min。(4)每孔加入100 μL反應(yīng)終止液，混勻1 min，采用Multiskan FC全自動(dòng)酶標(biāo)比色儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)于450 nm處讀取吸光度值。

1.2.3 甲胎蛋白的檢測(cè)：采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)(Cobas e601，羅氏集團(tuán))檢測(cè)血清樣本中的甲胎蛋白水平，試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)：04491743)購(gòu)自德國(guó)羅氏診斷有限公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)以確定資料是否符合正態(tài)分布，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)[M(P25,P75)]表示，多組間比較采用非參數(shù)Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用拓展t檢驗(yàn)。雙變量之間的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析各指標(biāo)的診斷價(jià)值。ENO1或甲胎蛋白水平大于其單獨(dú)診斷HCC的最佳截?cái)嘀导磁袛酁槁?lián)合診斷陽(yáng)性，反之則為陰性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組血清ENO1水平和甲胎蛋白水平的比較及其相關(guān)性 3組患者的血清ENO1水平、甲胎蛋白水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，且健康對(duì)照組、肝硬化組、HCC組的血清ENO1水平、甲胎蛋白水平均依次升高(均P<0.05)，見表1。雙變量Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，3組患者的ENO1水平與甲胎蛋白水平呈正相關(guān)(rs=0.393，P=0.002)。

表1 3組患者血清ENO1蛋白水平、 甲胎蛋白水平比較[M(P25,P75),ng/mL]

2.2 3組ENO1、甲胎蛋白水平及二者聯(lián)合檢測(cè)診斷HCC的ROC曲線分析 結(jié)果顯示，ENO1、甲胎蛋白水平及二者聯(lián)合檢測(cè)診斷HCC的ROC曲線下面積分別為0.817(95%CI：0.755～0.879)、0.821(95%CI：0.756～0.886)、0.862(95%CI：0.809～0.914)(均P<0.05)，聯(lián)合診斷的曲線下面積均大于ENO1、甲胎蛋白水平單獨(dú)診斷(均P<0.05)。見表2、圖3。

表2 ENO1、甲胎蛋白及二者聯(lián)合檢測(cè) 診斷HCC的效能

圖3 ENO1聯(lián)合甲胎蛋白診斷HCC的ROC曲線

3 討 論

原發(fā)性肝癌是全球第五大常見腫瘤，其中90%為發(fā)病率和病死率均較高的HCC，有效的腫瘤標(biāo)志物可以輔助診斷、判斷預(yù)后和指導(dǎo)治療。目前用于輔助診斷HCC的標(biāo)志物主要為甲胎蛋白，但甲胎蛋白在診斷準(zhǔn)確率方面存在一定限制[10]。因此，廣大研究者正在尋找新的可以輔助肝癌診斷的標(biāo)志物，并將多個(gè)標(biāo)志物聯(lián)合起來(lái)建立模型來(lái)提高診斷效能。本研究探討了ENO1作為肝癌診斷血清標(biāo)志物的潛在可能性，并評(píng)估了ENO1聯(lián)合甲胎蛋白診斷肝癌的臨床應(yīng)用價(jià)值。

ENO1作為糖代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，主要位于細(xì)胞質(zhì)，可能通過(guò)腫瘤細(xì)胞損傷、壞死或者其他途徑被釋放到細(xì)胞外，從而進(jìn)入外周血[11]。目前已有研究證實(shí)，相對(duì)于正常癌旁組織，肝癌組織中的ENO1呈高表達(dá)，且ENO1的高表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲[6]。據(jù)此，我們推測(cè)HCC患者可能存在血清ENO1濃度升高的情況。本研究結(jié)果顯示，相比于健康人群和肝硬化患者，HCC患者血清中的ENO1、甲胎蛋白水平明顯升高(P<0.05)，這提示ENO1或可成為新的肝癌相關(guān)血清學(xué)標(biāo)志物。預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，ENO1 mRNA高表達(dá)者的全因生存時(shí)間及無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間均短于ENO1 mRNA低表達(dá)者[7]，這提示肝癌組織中ENO1的表達(dá)情況與患者的病情進(jìn)展、預(yù)后均存在關(guān)聯(lián)。本研究中肝硬化組的ENO1、甲胎蛋白水平高于健康體檢組(P<0.05)，提示ENO1在肝硬化期已開始輕度升高，但因本研究納入的肝硬化、HCC患者均為肝炎患者，結(jié)合肝炎、肝硬化、肝癌的經(jīng)典臨床進(jìn)展過(guò)程分析，我們認(rèn)為通過(guò)檢測(cè)血清ENO1水平的變化或可早期預(yù)測(cè)肝炎肝硬化患者的進(jìn)展，這為肝癌的早期篩查提供新的思路和依據(jù)，但這還需要根據(jù)患者的情況進(jìn)行細(xì)分，并需通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證。

本研究結(jié)果顯示，ENO1、甲胎蛋白對(duì)HCC具有較高的診斷效能，但ENO1聯(lián)合甲胎蛋白診斷HCC的曲線下面積高達(dá)0.862，高于任一指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)(均P<0.05)，這提示二者聯(lián)合檢測(cè)可有效輔助臨床診斷HCC。二者聯(lián)合檢測(cè)雖然提高了敏感度(93.3%)，但該方法的特異度較低，因此聯(lián)合檢測(cè)更適合用于HCC的篩查。

綜上所述，ENO1或可成為新的肝癌相關(guān)血液學(xué)標(biāo)志物，其診斷HCC具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。聯(lián)合使用甲胎蛋白和ENO1可獲得比單個(gè)標(biāo)志物更強(qiáng)的輔助診斷效能，因此ENO1可作為甲胎蛋白診斷HCC的互補(bǔ)指標(biāo)，推薦兩者聯(lián)合使用以提高診斷的準(zhǔn)確性。