李宗龍 李 英 白文輝 馬志娟 沈國雙

(青海紅十字醫(yī)院1 乳腺外科，2 手術(shù)室，西寧市 810000，電子郵箱：lizonglong2893@163.com；3 青海大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺甲狀腺外科，西寧市 810000)

乳腺癌發(fā)病率占女性腫瘤首位，且近年來呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅女性身心健康[1]。由于乳腺癌早期臨床癥狀不明顯，大多數(shù)患者確診時(shí)已錯(cuò)過最佳治療時(shí)期，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。因此，早診斷、早治療是提高乳腺癌患者生存質(zhì)量的有效手段。微小RNA(microRNA，miRNA)-424參與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及凋亡等過程，其異常表達(dá)與乳腺癌的發(fā)展進(jìn)程有關(guān)[2]。人胎球蛋白A又稱α2-HS糖蛋白(alpha-2-Heremans-Schmid glycoprotein，AHSG)，其抗體具有多種生物學(xué)功能，對(duì)乳腺癌患者的早期診斷及預(yù)后評(píng)估有指導(dǎo)意義[3-4]。精子相關(guān)抗原9(sperm-associated antigen 9，SPAG9)抗體與多種腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲及遷移有關(guān)，在乳腺癌患者中SPAG9抗體水平升高可作為乳腺癌患者早期診斷和療效評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一[5]。血清miRNA-424、AHSG抗體、SPAG9抗體單獨(dú)診斷乳腺癌的準(zhǔn)確度較低，容易出現(xiàn)漏診、誤診，因此，本研究分析血清miRNA-424、AHSG抗體、SPAG9抗體三者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)乳腺癌的診斷價(jià)值，以期為早期診斷乳腺癌提供參考。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2016年10月至2018年10月青海紅十字醫(yī)院乳腺外科收治的58例乳腺癌患者作為研究對(duì)象(乳腺癌組)，同時(shí)選取同時(shí)期該醫(yī)院收治的55例乳腺纖維腺瘤患者為良性疾病組，兩組患者均經(jīng)病理確診[6]；另選取同時(shí)期在該醫(yī)院體檢的51例健康女性為健康對(duì)照組。3組研究對(duì)象的納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床資料或體檢資料完整；(2)采集靜脈血前未接受任何手術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往有其他惡性腫瘤病史者；(2)既往有免疫系統(tǒng)疾病病史者；(3)近3個(gè)月有重大外傷或感染病史者；(4)肝、腎功能異常者。乳腺癌組年齡31～77(50.68±13.64)歲；浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌42例，導(dǎo)管內(nèi)癌11例，乳腺黏液癌5例；臨床分期Ⅰ期17例，Ⅱ期29例，Ⅲ期12例。良性疾病組年齡30～77(49.85±12.20)歲，健康對(duì)照組年齡30～76(49.97±12.51)歲。3組研究對(duì)象的年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具體可比性。本研究經(jīng)青海紅十字醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象或其家屬均對(duì)本研究知情，并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集與保存：乳腺癌組和良性疾病組患者均于住院第二天清晨采集空腹靜脈血5 mL，健康對(duì)照組女性于體檢當(dāng)天清晨采集空腹靜脈血5 mL，均在10℃～15℃下3 000 r/min離心5～10 min，取上清液，保存于-80℃冰箱，在12 h內(nèi)檢測(cè)血清miRNA-424、AHSG抗體、SPAG9抗體水平。

1.2.2 血清miRNA-424相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)法檢測(cè)3組受試者的血清miRNA-424相對(duì)表達(dá)水平，qRT-PCR儀購自瑞士羅氏公司(型號(hào)：LightCycler 96)。采用TRIzol Reagent試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號(hào)：20150212)提取血清總RNA，反轉(zhuǎn)錄(37℃，60 min；85℃，5 s)得cDNA。以U6作為內(nèi)參擴(kuò)增miRNA-424，引物序列見表1。qRT-PCR反應(yīng)體系共20 μL：cDNA(50 ng/μL)2 μL，miScript SYBR? Green Mix 10 μL，上下游引物(10 μM)各0.8 μL，ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)程序：95℃ 30 s；95℃ 10 s；60℃ 15 s；70℃ 20 s；共40個(gè)循環(huán)。qRT-PCR反應(yīng)均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)結(jié)束后，取平均值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算血清miRNA-424相對(duì)表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.2.3 血清AHSG抗體、SPAG9抗體水平檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清AHSG抗體、SPAG9抗體水平。人AHSG抗體、人SPAG9抗體標(biāo)準(zhǔn)品均由北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司提供(批號(hào)：20150612)，具體操作參照說明書進(jìn)行。取出實(shí)驗(yàn)所需板條，空白孔加入標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本稀釋液，其余孔加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100 μL/孔)，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，36℃孵育箱孵育90 min；洗板5次；空白孔加生物素化抗體稀釋液，其余孔加入生物素化抗體工作液(100 μL/孔)，用新封板膠紙封住反應(yīng)孔，36℃孵育箱避光孵育30 min；洗板5次，加入顯色底物(四甲基聯(lián)苯胺)100 μL/孔， 36℃避光孵育15 min。加入終止液100 μL/孔混勻后，終止反應(yīng)，然后以空白孔為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)零，3 min內(nèi)依序測(cè)量各孔在450 nm波長(zhǎng)下的吸光度(OD)值，根據(jù)所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線和OD值計(jì)算每個(gè)標(biāo)記物在血清中的相應(yīng)濃度。

1.2.4 乳腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)：本研究采用串聯(lián)試驗(yàn)，單獨(dú)診斷時(shí)采用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC) 曲線的最佳截?cái)嘀禐樵\斷界值，大于AHSG抗體、SPAG9抗體截?cái)嘀祷蛐∮趍iRNA-424截?cái)嘀禃r(shí)診斷為乳腺癌，聯(lián)合診斷時(shí)需同時(shí)滿足單獨(dú)診斷的條件方能診斷為乳腺癌。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；采用ROC曲線分析各指標(biāo)單獨(dú)及聯(lián)合診斷乳腺癌的效能。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組血清miRNA-424相對(duì)表達(dá)水平、AHSG抗體及SPAG9抗體水平比較 健康對(duì)照組、良性疾病組、乳腺癌組血清miRNA-424相對(duì)表達(dá)水平依次降低，血清AHSG抗體、SPAG9抗體水平依次升高(均P<0.05)。見表2。

表2 三組血清miRNA-424相對(duì)表達(dá)水平、AHSG抗體及SPAG9抗體水平比較(x±s)

2.2 乳腺癌患者血清miRNA-424相對(duì)表達(dá)水平、AHSG抗體及SPAG9抗體水平與臨床分期的關(guān)系 乳腺癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者的血清miRNA-424相對(duì)表達(dá)水平依次降低，血清AHSG抗體、SPAG9抗體水平依次升高(均P<0.05)。見表3。

表3 血清miRNA-424相對(duì)表達(dá)水平、AHSG抗體及SPAG9抗體水平與乳腺癌臨床分期關(guān)系(x±s)

2.3 各指標(biāo)單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)診斷乳腺癌的ROC曲線分析 以乳腺癌組和良性疾病組患者為研究對(duì)象，分析血清miRNA-424、AHSG抗體、SPAG9抗體水平單獨(dú)檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)診斷乳腺癌的效能。結(jié)果顯示，血清miRNA-424、AHSG抗體、SPAG9抗體、miRNA-424聯(lián)合AHSG抗體、miRNA-424聯(lián)合SPAG9抗體診斷乳腺癌的曲線下面積分別為0.796、0.846、0.866、0.902、0.868，三者聯(lián)合檢測(cè)診斷乳腺癌的曲線下面積為0.927。三者聯(lián)合檢測(cè)的曲線下面積高于miRNA-424水平單獨(dú)檢測(cè)(P<0.05)，而三者聯(lián)合檢測(cè)的曲線下面積與其他各項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表4、圖1。

表4 各指標(biāo)單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)診斷乳腺癌的ROC曲線分析結(jié)果

圖1 各指標(biāo)單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)乳腺癌診斷價(jià)值的ROC曲線

2.4 各指標(biāo)單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)診斷乳腺癌的效能 各組檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度及陰性預(yù)測(cè)值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，血清miRNA-424、AHSG抗體、SPAG9抗體三者聯(lián)合檢測(cè)診斷乳腺癌的準(zhǔn)確度高于AHSG抗體單獨(dú)檢測(cè)(P<0.05)，而各組陰性預(yù)測(cè)值的兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；各檢測(cè)方法的靈敏度、特異度和陽性預(yù)測(cè)值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表5。

表5 血清miRNA-424、AHSG抗體、SPAG9抗體水平單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)診斷乳腺癌的效能[%(n/N)]

3 討 論

乳腺癌發(fā)生于乳腺上皮組織，主要臨床表現(xiàn)有乳腺腫塊、乳頭溢液及腋窩淋巴結(jié)腫大等，且發(fā)病年齡趨于年輕化，大多數(shù)乳腺癌患者確診時(shí)已處于中晚期，治療預(yù)后較差[7]。因此，探索新的腫瘤標(biāo)志物，對(duì)于在乳腺癌發(fā)展早期發(fā)現(xiàn)疾病并盡早采取有效治療手段，降低死亡率具有重要意義。由于臨床常規(guī)檢查不能滿足早期診斷乳腺癌的需求，易延誤病情，而血清miRNA-424、AHSG抗體、SPAG9抗體在檢測(cè)乳腺癌上具有良好的臨床應(yīng)用前景。因此，本研究比較上述3個(gè)指標(biāo)單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)乳腺癌的診斷效能，以期為乳腺癌的早期診斷和臨床治療提供新方向。

miRNA是一類非編碼單鏈小分子RNA，在真核生物中廣泛存在，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育等過程，與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[8]。miRNA具有高度保守性，通過與靶標(biāo)基因3′端非翻譯區(qū)配對(duì)，能調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡等多種生物學(xué)功能。miRNA-424位于人染色體Xp26.3，在宮頸癌患者中表達(dá)失調(diào)，并與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[9]。欒磊等[10]發(fā)現(xiàn)，宮頸組織中miRNA-424水平與宮頸癌病變嚴(yán)重程度有關(guān)，宮頸病變?cè)絿?yán)重，miRNA-424水平越低。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌患者血清miRNA-424相對(duì)表達(dá)水平最低、乳腺良性疾病患者次之、健康對(duì)照組最高(P<0.05)；且乳腺癌Ⅲ期患者血清miRNA-424相對(duì)表達(dá)水平最低、Ⅱ期次之、Ⅰ期最高(P<0.05)，與上述研究結(jié)果相似，表明血清miRNA-424表達(dá)下調(diào)可能與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，其或可作為早期篩查和診斷乳腺癌的血清學(xué)腫瘤標(biāo)記物。但ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清miRNA-424診斷乳腺癌的曲線下面積較小，且特異度和靈敏度也較低，因此其單獨(dú)檢測(cè)診斷乳腺癌的價(jià)值不高，應(yīng)與其他指標(biāo)聯(lián)合診斷乳腺癌。

AHSG是由肝臟細(xì)胞分泌合成的糖蛋白，位于人3號(hào)染色體，包含6個(gè)內(nèi)含子和7個(gè)外顯子，具有調(diào)節(jié)鈣化、胰島素抵抗及負(fù)性應(yīng)激等生物學(xué)功能[11]。AHSG為腫瘤相關(guān)抗原，其抗體可作為腫瘤篩查的血清標(biāo)記物。SPAG9位于人染色體17p21.33，通過與c-Jun氨基端激酶結(jié)合，參與調(diào)節(jié)多種生理功能[12]。研究顯示，SPAG9在人體多種腫瘤中均有表達(dá)，且可誘發(fā)機(jī)體內(nèi)的自身免疫反應(yīng)產(chǎn)生SPAG9抗體，而SPAG9抗體表達(dá)異常與前列腺癌、肺癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，在腫瘤早期診斷及靶向治療方面具有一定作用[13-14]。李琳[15]發(fā)現(xiàn)，妊娠期糖尿病患者血清AHSG水平明顯高于健康孕婦，與糖脂代謝紊亂關(guān)系密切。Nimptsch等[16]的研究顯示，大腸癌患者血清AHSG表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)異常與大腸癌發(fā)展進(jìn)程有關(guān)。毛立軍等[17]發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組織中的SPAG9蛋白陽性率明顯高于前列腺增生組織，表明SPAG9參與前列腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中SPAG9蛋白的異常表達(dá)與病變大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)，提示SPAG9表達(dá)上調(diào)是乳腺癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[18]。本研究中，乳腺癌患者血清AHSG抗體和SPAG9抗體水平最高、乳腺良性疾病患者次之、健康女性最低，且乳腺癌臨床分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者的血清AHSG抗體和SPAG9抗體水平依次升高(均P<0.05)，與上述研究結(jié)果相似[14-17]，表明血清AHSG抗體、SPAG9抗體水平可反映乳腺癌病情變化，或可作為診斷和治療乳腺癌的新靶點(diǎn)。本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清AHSG抗體、SPAG9抗體單獨(dú)診斷乳腺癌的靈敏度高，但特異度均較低，提示血清AHSG抗體、SPAG9抗體單獨(dú)診斷乳腺癌容易出現(xiàn)誤診現(xiàn)象，延誤患者病情。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，血清miRNA-424、AHSG抗體、SPAG9抗體三者聯(lián)合檢測(cè)診斷乳腺癌的ROC曲線下面積較大，且準(zhǔn)確度高于AHSG抗體單獨(dú)檢測(cè)，但三者聯(lián)合檢測(cè)的曲線下面積僅高于血清miRNA-424單項(xiàng)檢測(cè)時(shí)的曲線下面積(P<0.05)，而與其他各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)的曲線下面積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。這提示單獨(dú)檢測(cè)一個(gè)或兩個(gè)指標(biāo)診斷乳腺癌有一定的局限性，而三者聯(lián)合檢測(cè)雖然能提高乳腺癌的診斷效能，但是提高幅度不大，分析其原因可能是由本研究納入的樣本量較少造成的，因此今后還有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來分析三者聯(lián)合檢測(cè)是否適用于乳腺癌的臨床診斷，并篩選出具有較高靈敏度和特異度的指標(biāo)，以達(dá)到節(jié)省醫(yī)療成本，提高診斷效能的目的。

綜上所述，乳腺癌患者血清miRNA-424相對(duì)表達(dá)水平降低、AHSG抗體和SPAG9抗體水平升高，三者聯(lián)合檢測(cè)診斷早期乳腺癌的效能較高，今后還需加強(qiáng)對(duì)乳腺癌臨床篩查指標(biāo)的研究。