朱明章 梁偉新 賴勇強(qiáng) 彭和平 黃尚書 馮偉兆 谷小玉 李林株 李志宏
(廣東省佛山市高明區(qū)人民醫(yī)院1 普外科,3 病理科,佛山市 528500,電子郵箱:358767716@qq.com;2 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普外科,廣東省廣州市 510260)
甲狀腺癌是頭頸部和內(nèi)分泌系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤,約占全身惡性腫瘤的1%,近年來其發(fā)病率呈上升趨勢[1]。甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)是甲狀腺癌最常見的病理類型,發(fā)病率高,生長緩慢,預(yù)后較好,但易發(fā)生早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)[2]。研究發(fā)現(xiàn),多種基因DNA甲基化與甲狀腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3-8]。原鈣黏蛋白8(protocadherin 8,PCDH8)是鈣黏附蛋白家族中的一員,在細(xì)胞黏附、增殖、分化和遷移中起著重要的作用[9]。已有研究證實(shí)PCDH8基因?yàn)橐粋€候選的抑癌基因,其通過突變或啟動子甲基化在多種癌癥中失活,包括乳腺癌、袖套淋巴細(xì)胞瘤、結(jié)直腸癌、腎細(xì)胞癌、鼻咽癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌等[10-19]。但目前關(guān)于PCDH8基因甲基化與甲狀腺腫瘤關(guān)系的研究仍鮮有報道。本研究檢測甲狀腺腫瘤和正常組織中PCDH8基因啟動子的甲基化狀態(tài)及蛋白表達(dá)水平,探討PCDH8基因啟動子甲基化與PTC臨床病理特征的關(guān)系,現(xiàn)報告如下。
1.1 標(biāo)本來源 收集2013年6月至2016年12月期間在佛山市高明區(qū)人民醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除甲狀腺組織的180例患者作為研究對象,其中PTC48例、甲狀腺濾泡狀腺瘤43例、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫44例和正常甲狀腺組織45例,所有患者均經(jīng)病理檢查確診,患者術(shù)前均未行放化療。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)PTC、甲狀腺腺瘤及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫均符合2012年《中國甲狀腺結(jié)節(jié)和分化型甲狀腺癌診治指南》;(2)年齡18~65歲;(3)入組前未接受放化療等治療。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)有其他惡性腫瘤病史或合并其他惡性腫瘤者;(2)合并其他嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病者。本研究已通過佛山市高明區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查,且獲得所有研究對象知情同意。
1.2 試劑及引物 DNA提取試劑盒購自上海基因科技公司(批號:2018111401),亞硫酸氫鹽修飾及純化試劑盒購自德國Qiagen公司(批號:20170531),焦磷酸測序試劑盒(PyroMark Gold Q96 Reagents)購自德國Qiagen公司(批號:154037384),免疫組化一抗人抗鼠PCDH8抗體購自美國SANTA CRUZ公司(批號:L-20170113),二抗羊抗鼠IgG抗體購自美國BIOWORLD公司(批號:BS12471),甲基化基因測序試劑盒購自德國Qiagen公司(批號:157025148),DAB顯色液購自杭州協(xié)博醫(yī)藥公司(批號:20024970);所有引物設(shè)計均采用Primer 5軟件設(shè)計,由上海英濰捷基公司合成并進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
1.3 焦磷酸測序檢測標(biāo)本DNA甲基化 按試劑盒說明書步驟提取標(biāo)本DNA,使用亞硫酸氫鹽修飾及純化試劑盒對提取好的組織DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾及純化,于-20℃保存?zhèn)溆谩;騊CR擴(kuò)增,亞硫酸輕鹽處理后測序,上游引物:5′-ATTAAAGGGATTGTTAGAGGTAGG-3′, 下游引物:5′-CTCATACCTCCAACCTCAAATAC-3′(5′端生物素標(biāo)記)。按照下列反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增:95℃預(yù)變性2 min;95℃ 25 s,48℃ 30 s,72℃ 30 s,40個循環(huán);72℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)目的條帶。甲基化基因測序:制備含生物素標(biāo)記DNA單鏈,按照PyroMark ID遺傳分析系統(tǒng)和試劑盒說明書,用序列分析和單核苷酸多態(tài)性模式進(jìn)行測序位點(diǎn)分析。檢測位點(diǎn):PCDH8基因啟動子,NCBI Reference Sequence:NC_000013.11(chromosome 13,GRCh38.p7,52848593-52848604)。檢測序列:CGGGTCCGCGCG。4個位點(diǎn)任意一個出現(xiàn)C,且測序比例大于20%,則表示發(fā)生甲基化;相反,4個位點(diǎn)C的測序比例均小于20%,則表示未甲基化。
1.4 免疫組化法檢測PCDH8蛋白表達(dá) 對石蠟包埋的甲狀腺標(biāo)本進(jìn)行厚度為5 μm的連續(xù)切片,標(biāo)記、分類及晾干后放入60℃烤箱中烤片1 h。脫蠟后用pH=7.3的10 mM磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)沖洗3次,5 min/次;使用3% H2O2浸泡標(biāo)本15 min,微波爐低火阻斷內(nèi)源性過氧化物酶5 min,再使用10 mmol/L檸檬酸鈉浸泡,高溫高壓(100℃~120℃,80~90 kPa)進(jìn)行抗原修復(fù),冷卻后采用PBS緩沖液沖洗3次,5 min/次,加入PCDH8一抗(1 ∶100)4℃孵育過夜。次日,采用PBS緩沖液沖洗切片3次,5 min/次,滴入二抗IgG(1 ∶200),37℃孵育40 min,PBS緩沖液再沖洗3次,5min/次,滴加DAB顯色液顯色3~5 min。水洗終止顯色,蘇木素染細(xì)胞核15 s,水洗、藍(lán)化、脫水、透明、封片。奧林巴斯CX31顯微鏡下觀察并照相。根據(jù)細(xì)胞顯色深淺記分,無陽性反應(yīng)細(xì)胞為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分, 0~2分判斷為PCDH8表達(dá)陰性,≥3分判斷為PCDH8表達(dá)陽性。
1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示,多組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法;焦磷酸測序甲基化率和免疫組化基因表達(dá)調(diào)控率比較采用McNemar檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 各組甲狀腺標(biāo)本PCDH8基因啟動子甲基化及蛋白表達(dá)情況的比較 4組甲狀腺組織的PCDH8基因啟動子甲基化焦磷酸測序及蛋白表達(dá)情況比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05),其中PTC的PCDH8基因啟動子甲基化率高于正常甲狀腺組織,PCDH8基因蛋白表達(dá)陽性率低于正常甲狀腺組織(均P<0.05),而其他3組的上述指標(biāo),差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。
表1 各組甲狀腺組織PCDH8基因啟動子甲基化及蛋白表達(dá)情況的比較[n(%)]
2.2 PCDH8基因啟動子甲基化和蛋白表達(dá)調(diào)控的相關(guān)性 正常甲狀腺組織PCDH8蛋白表達(dá)陽性的24例標(biāo)本中,PCDH8基因未發(fā)生甲基化為20例,重合率為83.33%。甲狀腺癌標(biāo)本PCDH8蛋白表達(dá)陰性的37例標(biāo)本中,有33例發(fā)生PCDH8基因啟動子甲基化,重合率為89.18%。對兩種檢測方法結(jié)果進(jìn)行McNemar檢驗(yàn),焦磷酸測序和免疫組化檢測結(jié)果一致并無明顯差異(P=1.000),說明基因啟動子甲基化和蛋白表達(dá)陰性存在一定相關(guān)性。
2.3 PTC患者PCDH8基因啟動子甲基化與其臨床病理特征的相關(guān)性 PTC患者PCDH8基因啟動子甲基化與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)聯(lián)性(P<0.05),而與其年齡、性別、術(shù)前促甲狀腺激素水平、抗甲狀腺球蛋白抗體水平及腫瘤部位無明顯關(guān)系(均P>0.05)。見表2。
表2 PTC患者PCDH8基因啟動 子甲基化與其臨床病理特征的相關(guān)性(n)
抑癌基因失活是腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個重要分子生物學(xué)事件。有研究證實(shí),遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)機(jī)制都可能導(dǎo)致抑癌基因失活[20-22]。研究表明,抑癌基因的高甲基化是腫瘤發(fā)生發(fā)展的特征之一,并可作為診斷和預(yù)后評估的生物標(biāo)志物[20-21]。因此,抑癌基因的高甲基化水平在腫瘤的診斷、預(yù)后評估和基因靶向治療方面具有廣大前景。鈣黏蛋白被認(rèn)為在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中起構(gòu)建和維持組織結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵作用[22-25]。鈣黏蛋白家族分為經(jīng)典鈣黏蛋白、橋粒鈣黏蛋白和原鈣黏蛋白。原鈣黏蛋白是鈣黏附蛋白超家族中最大的亞群,鈣黏附家族基因的異常啟動子甲基化被發(fā)現(xiàn)與多種癌癥的發(fā)生密切相關(guān)[10,26-28]。PCDH8是原鈣黏蛋白家族成員之一,已有研究發(fā)現(xiàn)其在不同的腫瘤基因中發(fā)生異常甲基化,導(dǎo)致PCDH8基因發(fā)生突變或表觀遺傳性沉默,而外源性表達(dá)PCDH8基因可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,具有抑癌基因的作用[10-19]。
本研究觀察甲狀腺腫瘤中PCDH8基因DNA啟動子甲基化狀態(tài)及基因蛋白表達(dá)情況,結(jié)果顯示,PTC的PCDH8基因啟動子甲基化率高于正常甲狀腺組織,PCDH8基因蛋白表達(dá)陽性率低于正常甲狀腺組織(均P<0.05),而甲狀腺濾泡狀腺瘤、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫及正常甲狀腺組織的PCDH8基因啟動子甲基化率和蛋白表達(dá)陽性率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05),且PTC的PCDH8蛋白表達(dá)陰性率高達(dá)77.08%,PCDH8基因甲基化率高達(dá)81.25%,這表明與正常甲狀腺組織相比,PCDH8基因啟動子甲基化在PTC中更為常見。結(jié)合PCDH8基因的甲基化狀態(tài)和蛋白表達(dá)情況,本研究分析發(fā)現(xiàn)PCDH8基因發(fā)生甲基化與基因蛋白表達(dá)缺失在PTC的重合率為89.18%,這表明PCDH8基因甲基化與蛋白表達(dá)調(diào)控具有一定的關(guān)聯(lián)性,與國內(nèi)外相關(guān)研究報道[10,15,17,19]的結(jié)果相符合。此外,有研究發(fā)現(xiàn)PCDH8基因甲基化與腫瘤患者的甲胎蛋白水平、預(yù)后、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、組織形態(tài)、臨床分期和病理分級等具有相關(guān)性[17-19]。本研究結(jié)果顯示,PTC患者的PCDH8基因啟動子甲基化與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05),而與其年齡、性別、促甲狀腺激素水平、抗甲狀腺球蛋白抗體水平及腫瘤部位無明顯關(guān)系(P>0.05)。這可能與抑癌基因的甲基化失活,其內(nèi)在黏附、遷移、增殖功能改變,促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移侵襲有關(guān)。
綜上所述,PTC患者中的PCDH8基因啟動子甲基化率高,PCDH8蛋白表達(dá)水平低,PCDH8基因甲基化與蛋白表達(dá)調(diào)控具有一定的關(guān)聯(lián)性,且PCDH8基因啟動子甲基化與PTC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性,或可作為甲狀腺腫瘤診斷和預(yù)后評估的一個潛在生物標(biāo)志物。