高曉斌 武雪亮 趙軼峰 聶雙發(fā) 梁 峰 劉小飛 張迎春

1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院普通外科，河北張家口 075000；2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院小兒外科，河北張家口 075000

最新流調(diào)數(shù)據(jù)顯示，2014 年我國結(jié)直腸癌發(fā)病例數(shù)上升至第三，其整體5 年生存率并未有明顯提高，較歐美仍有較大差距[1-2]。目前，手術(shù)輔以放化療在結(jié)直腸癌的治療中已非常成熟，從分子生物學(xué)角度尋求敏感度高、特異性強(qiáng)的標(biāo)志物以提高腫瘤的早期診斷率已成為結(jié)直腸癌的研究熱點(diǎn)[3]。

DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶是人類表觀遺傳學(xué)中催化并維持DNA 基化結(jié)構(gòu)和功能的重要酶家族[4]，其包含3 個(gè)重要成員：DNMT1、DNMT2 和DNMT3，其中DNMT1是目前研究最為廣泛也最為深入的酶類，其在DNA修復(fù)和正常甲基化功能過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究證實(shí)，DNMT1 的活性增強(qiáng)或表達(dá)上調(diào)能介導(dǎo)DNA 異常甲基化，與胃癌、胰腺癌、宮頸癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5-7]，但在結(jié)直腸癌中的研究較少。鈉氫交換子調(diào)節(jié)因子-1（NHERF1）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的抑癌基因，目前僅在乳腺癌、胃癌中發(fā)現(xiàn)其抑癌作用[8-9]，在結(jié)直腸癌中的研究尚未見報(bào)道。本研究通過對(duì)結(jié)直腸癌和相應(yīng)正常組織中DNMT1、NHERF1 行熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）和免疫組織化學(xué)檢測，探討二者在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況及與相關(guān)臨床病理因素間的關(guān)系，同時(shí)初步探討二者的相互作用，為結(jié)直腸癌的早期診斷和預(yù)后監(jiān)測提供可靠的分子生物學(xué)標(biāo)志物，為結(jié)直腸癌的靶向診療提供科學(xué)參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2017 年2 月～2018 年2 月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院（以下簡稱“我院”）普通外科手術(shù)切除病理確診的結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織標(biāo)本各50 例，同時(shí)收集患者完整的臨床資料，本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)鑒定批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑、儀器

RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑（批號(hào)：RI90401）、PCR 試劑盒（批號(hào)：9AG03J）、PrimeScriptTMRT reagent 試劑盒（批號(hào)：PR036A）購自日本TaKaRa 公司；DNMT1、NHERF1和β-catenin 引物由生工生物（北京）有限公司設(shè)計(jì)合成，全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀購自瑞士羅氏公司E2010，DEPC 水購自美國Sima 公司，DNMT1 抗體、NHERF1 抗體均購自美國Santa Cruz 公司，DAB 顯色試劑盒（批號(hào)：PV9000）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR 檢測癌組和正常組中DNMT1 mRNA和NHERF1 mRNA 表達(dá) 按TRIzol RNA 試劑盒說明書提取總RNA，用PrimeScriptTMRT reagent 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 2 μL 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增引物：DNMT1 正向引物：5′-CGATGAGGAAGTCGATGATAACAT-3′，反向引物：5′-ATGCGATTCTTGTTCTGTTTCTTCT-3′；NHERF1 正向引物：5′-AGGGAAACTGACGAGTTCTT-3′，反向引物：5′-ACTGAACCTGACCGTACATT-3′；β-catenin 作 為 內(nèi)參，正向引物：5′-AGGAAGCTTCCAGACACGC-3′，反向引物：5′-CGCACTGCCATTTTAGCTCC-3′。PCR 反應(yīng)條件：95℃變性10 min，進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)：95℃變性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸40 s，然后根據(jù)SYBR Green 染色法行相對(duì)定量分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理使用2△△Ct法，計(jì)算各樣本Ct 平均值[IACt 平均值（Ct=Ctnetl-Ctl3actin），計(jì)算2△△ct（mean2△△ct值）AACt=meanAACt 值。

1.3.2 免疫組織化學(xué)法檢測癌組和正常組中DNMT1和NHERF1 蛋白陽性表達(dá) 將癌組織標(biāo)本連續(xù)切片4 μL 貼附于經(jīng)多聚賴氨酸處理的玻片上，80℃烘烤50 min，光鏡下觀察切片中DNMT1、NHERF1 蛋白的表達(dá)和分布情況，每張切片選取5 個(gè)高倍視野（400×）。DNMT1 蛋白陽性主要分布于細(xì)胞核中，而NHERF1蛋白陽性主要分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中，均呈棕黃色顆粒。判斷標(biāo)準(zhǔn)：按染色強(qiáng)度[10]：無著色為0 分，淡黃為1 分，深黃2 分，棕褐或棕黃3 分；陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)：＜10%為0 分，10%～25%為1 分，＞25%～50%為2 分，＞50%～75%為3 分，＞75%為4 分，兩者相加＜2 分為陰性（-），2～3 分為弱陽性（+），4～5 分為中等強(qiáng)度陽性（++），6～7 分為強(qiáng)陽性（+++），由兩名具備高級(jí)職稱的病理醫(yī)師經(jīng)雙盲法獨(dú)立評(píng)分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。應(yīng)用Spearman 相關(guān)分析法分析二者的相關(guān)性。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組和正常組中DNMT1 mRNA、NHERF1 mRNA 表達(dá)

qRT-PCR 結(jié)果以目標(biāo)基因與β-catenin 的比值作為定量分析結(jié)果，癌組中DNMT1 mRNA 的表達(dá)水平為（0.36±0.07），明顯高于正常組（0.09±0.01）；而癌組中NHERF1 mRNA 的表達(dá)水平為（0.14±0.03），明顯低于正常組（0.35±0.05），差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.951、6.553，均P=0.000）。

2.2 結(jié)直腸癌組和正常組中DNMT1 和NHERF1 蛋白的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示癌組中DNMT1 陽性表達(dá)率為84.00%（42/50），明顯高于其在正常組中的陽性表達(dá)24.00%（12/50）；而癌組織中NHERF1 陽性表達(dá)率為32.00（16/50），明顯低于其在正常組中的表達(dá)[76.00%（38/50）]，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=21.545、15.559，均P=0.000）。見圖1。

2.3 DNMT1 和NHERF1 蛋白的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

DNMT1 和NHERF1 蛋白表達(dá)均與腫瘤的浸潤深度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移相關(guān)（均P ＜0.05）。TNM 分期高，DNMT1 表達(dá)水平越高，而NHERF1 表達(dá)水平越低（均P ＜0.05），伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移的患者DNMT1 表達(dá)水平高于未轉(zhuǎn)移的患者，而NHERF1的表達(dá)水平則低于未轉(zhuǎn)移患者（均P ＜0.05），而DNMT1 和NHERF1 蛋白表達(dá)水平與患者性別、年齡、腫瘤大小及分化程度均無關(guān)（均P ＞0.0505）。見表1。

2.4 結(jié)直腸癌組織中DNMT1 和NHERF1 蛋白表達(dá)的相關(guān)性

DNMT1 和NHERF1 蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.491，P=0.000）。見表2。

3 討論

研究證實(shí)，腫瘤的發(fā)生、演變不單單取決于遺傳因素，同時(shí)也受到表觀遺傳修飾的影響，后者通過DNA 甲基化、染色體重塑、組蛋白修飾和lncRNA 等4 種主要的調(diào)控方式來調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，激活致癌基因，沉默抑癌基因，其中DNA 甲基化是目前研究最為深入的機(jī)制[11]。

圖1 免疫組化檢測DNMT1、NHERF1 在結(jié)直腸組織和癌組織中的表達(dá)（SP 法，200×）

表1 臨床病理因素與DNMT1 和NHERF1 在結(jié)直腸癌組織中陽性表達(dá)的關(guān)系[例（%）]

表2 結(jié)直腸癌組織DNMT1 和NHERF1 表達(dá)的相關(guān)性

DNMT1 是DNA 甲基化的關(guān)鍵作用酶，主要介導(dǎo)甲基化模式的建立與維護(hù)，其高表達(dá)可以誘導(dǎo)甲基化模式異常，使啟動(dòng)子區(qū)的CpG 島發(fā)生甲基化，相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)受抑制，從而介導(dǎo)腫瘤發(fā)生[12-13]。張尤歷等[14]檢測DNMT1 mRNA 和蛋白在胰腺組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)二者在癌組織中的表達(dá)水平和陽性率均明顯高于正常組織，且其表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤的惡性度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和神經(jīng)浸潤密切相關(guān)；羅玉政等[15]通過小分子干擾劑抑制人結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞DNMT1 的表達(dá)，證實(shí)DNMT1-siRNA 能明顯抑制HT-29 細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其凋亡，降低其侵襲和遷移的能力。

NHERF-1 最初發(fā)現(xiàn)于人類上皮細(xì)胞，在肝臟、腎臟、胰腺、唾液腺、乳腺中均有表達(dá)，NHERFl 基因定位于染色體17q25.1，含6 個(gè)外顯子，其編碼蛋白質(zhì)N端含有PDZ-I 和PDZ-II 兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，C 端含有與ERM 家族蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域[16]。NHERF-1 通過PDZ和ERM 結(jié)構(gòu)域與包括血小板衍生生長因子受體、磷酸酶基因（PTEN）、脾酪氨酸激酶（SYK）等在內(nèi)的多種靶蛋白質(zhì)相互結(jié)合，參與調(diào)節(jié)多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，如Wnt 信號(hào)通路、PI3K/PTEN/Akt 通路、Hippo-YAP/TAZ 等，其中Wnt 信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及血管形成、浸潤等方面發(fā)揮重要作用[17]。李陽等[18]應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測乳腺癌組織及癌旁組織中NHERF-1 蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)癌組織中NHERF1 呈現(xiàn)弱陽性或不表達(dá)狀態(tài)，而在癌旁正常組織中兩者均有表達(dá)或高表達(dá)，考慮抑制NHERF1 蛋白的表達(dá)與乳腺癌發(fā)生關(guān)系密切。

本研究顯示，DNMT1 在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)明顯高于正常組，而NHERF1 癌組織中的表達(dá)明顯低于正常組，差異明顯，提示在腸黏膜癌變的過程中，DNMT1 的過表達(dá)和NHERF1 的表達(dá)受抑制參與結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生；進(jìn)一步研究顯示，DNMT1 和NHERF1表達(dá)水平與結(jié)直腸癌的浸潤深度、TNM 分期、淋巴結(jié)和肝轉(zhuǎn)移均關(guān)系密切，且二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。有研究表明：DNMT1 和NHERF1 均受Wnt 信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)，在DNMT1 高表達(dá)結(jié)直腸癌患者中，Wnt 信號(hào)通路與NHERF1 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，DNMT1 能抑制體內(nèi)NHERF1 的表達(dá)[19]；亦有研究證實(shí)，NHERF1 是Wnt信號(hào)通路的拮抗劑之一，NHERF1 通過抑制Wnt 通路降低DNMT1 的表達(dá)，從而抑制DNA 的異常甲基化，誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生[20]。

綜上，DNMT1 和NHERF1 的異常表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌的發(fā)生進(jìn)展有重要作用，本研究僅從基因和蛋白水平分析二者在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況，其具體的相互作用機(jī)制及相關(guān)通路的研究尚不明確，這也是本研究下一步的研究方向。