秦健 黃如葵 黃熊娟 劉杏連 梁家作 琚茜茜 黃玉輝

摘? 要：為了明確苦瓜雙色平臍蠕孢葉斑病菌（Bipolaris bicolor）的生物學(xué)特性及其對(duì)殺菌劑的敏感性，研究了不同培養(yǎng)條件對(duì)該病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響，并測(cè)定了10種殺菌劑對(duì)該病原菌的抑制作用。結(jié)果表明：該病原菌菌絲生長(zhǎng)最適溫度為25～30 ℃，最適pH范圍為6～7，適宜培養(yǎng)基為馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（PSA）和玉米粉培養(yǎng)基（CMA），持續(xù)黑暗和光暗交替有利于菌絲生長(zhǎng);不同碳源和氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響差異顯著，其中葡萄糖和蛋白胨分別為最適碳源和氮源，菌絲生長(zhǎng)致死溫度為45 ℃。250 g/L苯醚甲環(huán)唑乳油毒力最強(qiáng)，EC50為0.0233 mg/L，其次為250 g/L吡唑醚菌酯懸浮劑、20%抑霉唑水乳劑和50%嘧菌環(huán)胺水分散粒劑。

關(guān)鍵詞：苦瓜;葉斑病;雙色平臍蠕孢;生物學(xué)特性;毒力

中圖分類號(hào)：S436.429? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： To clarify the biological characteristics and sensitivity to different fungicides， the effects of different culture condition on the mycelial growth of Bipolaris bicolor were determined. The inhibitory activity of ten fungicides on B. bicolor were also studied. The optimum temperature and pH for the mycelial growth was 25-30 ℃ and pH 6-7， respectively. PSA and CMA medium were the appropriate medium for hyphal growth. Continuous darkness condition and the alternation of light and darkness were beneficial to mycelial growth. Effects for carbon and nitrogen sources on mycelial growth were significantly different， and the optimal carbon and nitrogen source was dextrose and peptone， respectively. The lethal temperature of mycelia was 45 ℃. The toxicity test showed that 250 g/L difenoconazole EC had the highest inhibitory activity with EC50 of 0.0233 mg/L among all fungicides， followed by 250 g/L pyraclostrobin SC， 20% imazalil EW and 50% cyprodinil WDG.

Keywords： Momordica charantia; leaf spot; Bipolaris bicolor; biological characteristics; toxicity

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.12.019

[]苦瓜（Momordica charantia L.）是重要的藥食兼用作物，苦瓜常見病害有白粉病、枯萎病和炭疽病等[1-3]，近年來，苦瓜蔓枯病時(shí)有發(fā)生[4]。近期，筆者在廣西南寧苦瓜基地發(fā)現(xiàn)一種苦瓜新的葉斑病，該病發(fā)生于苦瓜盛瓜期，發(fā)生率為3%～25%，該病害病斑剛開始表現(xiàn)為水漬狀小圓斑，嚴(yán)重時(shí)病斑擴(kuò)大，引起葉片萎蔫，死亡，嚴(yán)重影響苦瓜植株生長(zhǎng)。通過對(duì)病原菌的分離、純化、致病性測(cè)定，得到苦瓜葉斑病的致病菌株，命名為YB450101，觀察該菌株的菌落形態(tài)、孢子和孢子梗等特征，結(jié)合ITS-TEF-GPD基因測(cè)定結(jié)果將該病原菌鑒定為雙色平臍蠕孢菌（Bipolaris bicolor）[5]。

隨著作物栽培面積的增大，病蟲害發(fā)生為害的概率也相應(yīng)地增加。雙色平臍蠕孢菌可以為害橡膠樹[6]、桃棕[7]、小麥[8]和牛筋草[9]等作物，但是，侵染苦瓜為首次報(bào)道，目前該病菌的生物學(xué)特性和藥劑篩選也未見報(bào)道。本研究開展雙色平臍蠕孢菌的生物學(xué)特性和室內(nèi)殺菌劑毒力研究，建立基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫，為該病害綜合防控提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 供試病原菌? 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所實(shí)驗(yàn)室保存的雙色平臍蠕孢菌（Bipolaris bicolor），命名為YB450101[5]。

1.1.2? 供試藥劑? 室內(nèi)藥劑毒力測(cè)定所用殺菌劑均為市售品種，具體信息見表1。

1.1.3? 供試培養(yǎng)基? 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（PSA）、察氏培養(yǎng)基（Czapek）、燕麥片培養(yǎng)基（OMA）、玉米粉培養(yǎng)基（CMA）、碳或氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基和水瓊脂培養(yǎng)基（WA）[10]。

1.2? 方法

1.2.1? 病原菌生物學(xué)特性的測(cè)定? 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響：用打孔器打取菌塊（d=7 mm），轉(zhuǎn)接到PDA平板上，分別置于5、10、15、20、25、28、30、35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理重復(fù)3次，詳情參考鄭麗等[11]的方法。

pH對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響：用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液將PDA培養(yǎng)基的pH分別調(diào)配成4、5、6、7、8、9、10、11，采用上述接種方法，每個(gè)處理重復(fù)3次，28 ℃恒溫培養(yǎng)，5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，詳情參考康迅等[10]的方法。

碳（氮）源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響：用含有相同碳元素質(zhì)量的蔗糖、可溶性淀粉、果糖、乳糖、麥芽糖、木糖、山梨醇置換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，配制成不同碳源培養(yǎng)基。用含有相同氮元素質(zhì)量的氯化銨、硫酸銨、硝酸鈉、甘氨酸、半胱氨酸、尿素、蛋白胨、牛肉浸膏置換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的硝酸鉀，配制成不同氮源培養(yǎng)基。采用上述接種方法，每個(gè)處理重復(fù)3次，28 ℃恒溫培養(yǎng)，5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，詳情參考康迅等[10]的方法。

光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響：設(shè)24 h全光照、12 h光照+12 h黑暗及24 h全黑暗3種處理，采用上述接種方法，每個(gè)處理重復(fù)3次，28 ℃恒溫培養(yǎng)，5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，詳情參考康迅等[10]的方法。

培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響：采用上述接種方法，接種于PDA、PSA、Czapek、OMA、CMA的平板中央，以WA平板作對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，28 ℃恒溫培養(yǎng)，5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，詳情參考康迅等[10]的方法。

病原菌菌絲致死溫度的測(cè)定：在滅菌的5 mL試管中加無菌水2 mL，分別加熱到40、45、50、55、60、65 ℃，將菌塊（d=7 mm）分別放入以上處理后的試管中并搖勻，處理10 min后取出試管冷卻至室溫，再將菌塊接種到PDA平板中央，以28 ℃為對(duì)照（CK），每個(gè)處理重復(fù)3次，28 ℃恒溫培養(yǎng)，5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，詳情參考康迅等[10]的方法。

1.2.2? 病原菌室內(nèi)藥劑篩選? 采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定菌株對(duì)不同藥劑不同濃度的敏感性[12]。具體方法如下：稱取一定量的藥劑，加入無菌水，配制成某個(gè)濃度的母液，用移液槍取一定量母液加入到一定體積的PDA培養(yǎng)基中，配制5個(gè)濃度（有效成分濃度）梯度的含藥培養(yǎng)基平板，然后從純化的菌落邊緣打取菌餅（d=7 mm），接種，并以不含藥劑的處理為對(duì)照，28 ℃恒溫培養(yǎng)，菌落直徑為培養(yǎng)皿的2/3時(shí)，即測(cè)量菌落直徑，并計(jì)算抑菌率。每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。將藥劑濃度（mg/L）轉(zhuǎn)換成以10為底的對(duì)數(shù)值（x），菌絲生長(zhǎng)抑制率換算成幾率值（y），并用DPS軟件求出各供試藥劑的毒力回歸方程、有效抑制中濃度（EC50）及相關(guān)系數(shù)r。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel軟件和DPS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 病原菌的生物學(xué)特性分析

2.1.1? 溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響? 試驗(yàn)結(jié)果表明，在15～35 ℃范圍內(nèi)，病原菌菌絲均能生長(zhǎng)。當(dāng)溫度低于10 ℃時(shí)，菌絲停止生長(zhǎng)，25～30 ℃生長(zhǎng)最快，28 ℃時(shí)菌落直徑達(dá)78.50 mm。表明該病原菌最適生長(zhǎng)溫度為25～30 ℃（圖1）。

2.1.2? pH對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響? 不同pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)有不同程度的影響（圖2）。病原菌在pH為4～11的范圍內(nèi)，其菌絲均能生長(zhǎng)。但是，當(dāng)pH為4時(shí)，菌絲生長(zhǎng)最緩慢，顯著慢于其他處理，菌落直徑僅為8.00 mm;pH為5或11時(shí)，菌絲生長(zhǎng)也較為緩慢，菌落直徑為13.80～18.50 mm;pH為6或7時(shí)，菌絲生長(zhǎng)最適宜，菌落直徑達(dá)62.80 mm或60.50 mm。適宜菌絲生長(zhǎng)的pH范圍為6～9，最適pH為6～7。

2.1.3? 碳（氮）源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響? 不同碳源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響存在較大差異（圖3）。葡萄糖利用率最高，菌落直徑達(dá)79.20 mm，與果糖、麥芽糖、可溶性淀粉、乳糖和蔗糖相比未達(dá)差異顯著水平，但均顯著高于山梨醇中的菌落直徑。所以，葡萄糖是最有利于病原菌菌絲生長(zhǎng)的碳源。

不同氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響也存在較大差異（圖4）。半胱氨酸、甘氨酸和氯化銨均不利于菌絲生長(zhǎng)，其菌落直徑顯著低于其他處理。病原菌對(duì)蛋白胨利用率最高，菌落直徑為63.17 mm，其次為硫酸銨。由此可見，蛋白胨是最有利于病原菌菌絲生長(zhǎng)的氮源。

2.1.4? 光照對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響? 光照處理后，不同光照條件對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)略有差異（圖5）。在光暗交替或連續(xù)黑暗的條件下，病原菌的菌落直徑相當(dāng)，在64.25～64.30 mm之間，并顯著高于連續(xù)光照的處理。因此，光暗交替或者連續(xù)黑暗更有利于病原菌的生長(zhǎng)。

2.1.5? 培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響? 不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)存在一定影響（圖6）。病原菌在PSA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好，菌落直徑達(dá)80.00 mm，但與CMA培養(yǎng)基上的菌落直徑相比未達(dá)差異顯著水平，OMA、Czapek和PDA培養(yǎng)基在生物統(tǒng)計(jì)學(xué)上處于同一水平并顯著高于WA培養(yǎng)基的菌落直徑。因此，PSA和CMA培養(yǎng)基最有利于病原菌菌絲生長(zhǎng)。

2.1.6? 病原菌菌絲致死溫度的測(cè)定? 不同溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響見圖7。病原菌在超過45 ℃的水浴中處理10 min后，病原菌基本不能生長(zhǎng)。由此說明，病原菌的致死溫度為45 ℃。

2.2? 不同藥劑對(duì)病原菌的抑菌效果

10種殺菌劑的毒力測(cè)定表明，不同殺菌劑對(duì)病原菌的毒力存在差異（表2）。其中，250 g/L苯醚甲環(huán)唑乳油毒力最強(qiáng)，EC50為0.0233 mg/L，其次為250 g/L吡唑醚菌酯懸浮劑、20%抑霉唑水乳劑和50%嘧菌環(huán)胺水分散粒劑，EC50分別為0.0246、0.0400和0.0518 mg/L。而23.4%雙炔酰菌胺懸浮劑毒力最差，EC50為20.4604 mg/L，其余藥劑的EC50為0.2086～1.5296 mg/L。

3? 討論

雙色平臍蠕孢菌可以侵染橡膠樹[6]、桃棕[7]、小麥[8]和牛筋草[9]等植物，然而侵染苦瓜，國內(nèi)外尚屬首次報(bào)道，該病菌的生物學(xué)特性和藥劑篩選也未見報(bào)道。該病害為害苦瓜，發(fā)生率為3%～25%，隨著苦瓜栽培面積的擴(kuò)大，病菌的快速繁殖，該病害將會(huì)有大面積發(fā)生的趨勢(shì)。因此，開展該病害的生物學(xué)特性和藥劑篩選研究，了解病菌生長(zhǎng)的環(huán)境條件，明確對(duì)病原菌具有較好防治效果的藥劑，從而制定相應(yīng)的防治措施，對(duì)于防控該病害具有重要的意義。

本文對(duì)苦瓜葉斑病病原（Bipolaris bicolor）進(jìn)行生物學(xué)特性測(cè)定。結(jié)果表明，該病原菌菌絲生長(zhǎng)最適溫度為25～30 ℃，與狗牙根平臍蠕孢（B. cynodontis）[13]和稻平臍蠕孢（B. oryzae）[14]的結(jié)果相似，這與南寧地區(qū)5—9月病害發(fā)生為害直接相關(guān);在pH為4～11的范圍內(nèi)，其菌絲均能生長(zhǎng)，其中最適pH范圍為6～7，說明，弱酸堿至中性的環(huán)境條件下利于菌絲生長(zhǎng)，與小麥根腐病菌（B. sorokiniana）[15]的結(jié)果相似;在馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基和玉米粉培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)最快，碳源和氮源利用率最高為葡萄糖和蛋白胨，這與狗尾草平臍蠕孢（B. setariae）[16]的結(jié)果相似。持續(xù)黑暗和光暗交替有利于B. bicolor菌絲生長(zhǎng)，說明菌絲生長(zhǎng)對(duì)光照的要求不高;B. bicolor菌絲生長(zhǎng)致死溫度為45 ℃，低于B. sorokiniana和B. setariae的致死溫度，說明B. bicolor對(duì)高溫比較敏感。

通過對(duì)苦瓜葉斑病病原菌的室內(nèi)藥劑篩選試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)250 g/L苯醚甲環(huán)唑乳油毒力最強(qiáng)，EC50為0.0233 mg/L，其次為250 g/L吡唑醚菌酯懸浮劑、50%嘧菌環(huán)胺水分散粒劑和20%抑霉唑水乳劑。EC50數(shù)值越小，毒力回歸方程的斜率越大，表明隨著濃度的增大，該藥劑的抑制效果越明顯[17]。23.4%雙炔酰菌胺懸浮劑斜率較小，EC50數(shù)值較大，說明該藥劑抑菌效果較差。馮思琪[18]、房寬峰[19]、郭煒[20]研究發(fā)現(xiàn)苯醚甲環(huán)唑?qū). oryzae、B. australiensis、B. sorokinianum具有很好的抑制效果，說明三唑類（苯醚甲環(huán)唑）殺菌劑可能對(duì)平臍蠕孢屬普遍具有較強(qiáng)的抑制作用。另外，甲氧基丙烯酸酯類（吡唑醚菌酯）和嘧啶胺類（嘧菌環(huán)胺）殺菌劑對(duì)病原菌B. bicolor也具有很好的抑制作用。

此次藥劑篩選試驗(yàn)，獲得了抑菌效果較好的3種不同類型藥劑，這對(duì)于防控該病害具有一定意義。但是，本研究?jī)H為室內(nèi)平板試驗(yàn)，由于田間生產(chǎn)中，藥劑的防治效果容易受到施藥時(shí)期、氣候、藥械和其他不可預(yù)計(jì)的因素的影響，因此，需要再進(jìn)行田間防效試驗(yàn)，以確定哪些藥劑為田間防治該病害的首選藥劑。

參考文獻(xiàn)

周萌萌， 田麗波， 商? 桑， 等. 苦瓜白粉病病原菌和生理小種的鑒定及苦瓜對(duì)白粉病的抗性遺傳分析[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)， 2019， 46（2）： 313-322.

陳振東， 袁高慶， 黎起秦， 等. 苦瓜枯萎病菌的鑒定及其遺傳多樣性分析[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2014， 44（1）： 36-45.

王會(huì)芳， 曾向萍， 芮? 凱， 等. 苦瓜炭疽病病原鑒定及生物學(xué)特性初步研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2011， 28（7）： 141-145.

秦? 健， 陳振東， 宋煥忠， 等. 廣西苦瓜蔓枯病的病原分離與鑒定[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2018（2）： 280-284.

秦? 健， 黃如葵， 陳振東， 等. 苦瓜平臍蠕孢葉斑病病原鑒定[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2019， 49（5）： 711-714.

Liang X Y， Peng Y， Liu Y C， et al. First report of Bipolaris bicolor causing a leaf spot disease on rubber tree[J]. Journal of Phytopathology， 2019（2）： 1-5.

Rodríguez-Morejón K， Kimati H， Fancelli M I. Bipolaris bicolor （Mitra） Shoemaker： Species associated to folial spot in pupunha palm （Bactris gasipaes Kunth） in Brazil[J]. Revista Iberoamericana de Micología， 1998， 15（1）： 55-57.

Morejon K R， Moraes M H D， Bach E E. Identification of Bipolaris bicolor and Bipolaris sorokiniana on wheat seeds （Triticum aestivum L.） in Brazil[J]. Brazilian Journal of Microbiology， 2006， 37（3）： 247-250.

Marin Y， Cheewangkoon R， Crous P W. New species and records of Bipolaris and Curvularia from Thailand[J]. Mycosphere， 2017， 8（9）： 1556–1574.

康? 迅， 靳鵬飛， 馮? 霞， 等. 辣木枝枯病病原菌鑒定及其生物學(xué)特性[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)， 2017， 44（3）： 481-487.

鄭? 麗， 張海鵬， 林? 江， 等. 油棕草莖點(diǎn)霉葉斑病病原菌的生物學(xué)特性和毒力測(cè)定[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2017， 38（9）： 1694-1699.

徐漢虹. 植物化學(xué)保護(hù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 2版. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 2012： 48-49.

楊成德， 陳秀蓉， 薛? 莉， 等. 牧草根際狗牙根平臍蠕孢菌的研究[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)， 2008（3）： 86-92.

張建萍， 周勇軍， 韓? 川， 等. 六蕊假稻病原菌稻平臍蠕孢菌生物學(xué)特性研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2014， 30（36）： 124-127.

劉正坪， 王立新， 李榮禧， 等. 小麥根腐病菌鑒定及其生物學(xué)特性測(cè)定[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)， 2002， 17（2）： 44-48.

牛曉慶， 余鳳玉， 朱 輝， 等. 椰子平臍蠕孢葉斑病病原鑒定及生物學(xué)特性測(cè)定[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2015， 36（3）： 581-586.

鄭? 麗， 楊? 威， 覃新導(dǎo)， 等. 鋸葉棕苗期葉斑病菌（Calonectria pteridis）生物學(xué)特性及其對(duì)11種殺菌劑的毒力反應(yīng)[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2014， 35（8）： 1625-1631.

馮思琪. 水稻胡麻葉斑病菌生物學(xué)特性、藥劑篩選及品種抗性分析[D]. 大慶： 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)， 2019.

房寬鋒. 高爾夫球場(chǎng)狗牙根葉斑病病原學(xué)的研究[D]. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2006.

郭? 煒. 西北地區(qū)冬小麥普通根腐病和莖基腐病病原鑒定及種質(zhì)資源抗性篩選[D]. 蘭州： 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2018.