張妙宜 高祝芬 唐文 趙炎坤 李凱 王尉 謝江輝 張錫炎 黃綿佳

摘? 要：為分離和鑒定具有促生作用的內(nèi)生菌，開(kāi)發(fā)潛在功能的微生物菌株，本研究以諾尼（Morinda citrifolia L.）為研究對(duì)象，從植株不同組織中共分離得到621株內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)復(fù)篩得到具有促生和解磷作用的菌株，命名為QN2MO-1?；诰甑纳砩治龊?6S rDNA的序列比對(duì)，該內(nèi)生細(xì)菌與Bacillus siamensis KCTC 13613T（AJVF01000043）具有99.04%的同源性。藥敏性分析顯示，該菌對(duì)青霉素、硫酸鏈霉素和氨芐西林具有明顯的抗性。QN2MO-1可促進(jìn)番茄種子的萌發(fā);與對(duì)照相比，5%菌體發(fā)酵液處理能顯著提高植株的生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞：諾尼;暹羅芽胞桿菌;促生;種子萌發(fā);田間試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S641.2? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： To identify endophytic bacteria with growth-promoting function and develop potential functional microbial strains， we isolated 621 strains from different tissues of Noni （Morinda citrifolia L.）. After screening， a strain with growth-promoting and phosphate-solubilizing function was obtained and named QN2MO-1. Based on the physiological and biochemical analysis of the strain and the sequence alignment of 16S rDNA， the endophyte had 99.04% homology with Bacillus siamensis KCTC 13613T （AJVF01000043）. Antibiotic sensitivity analysis showed that the strain had obvious resistance to penicillin， streptomycin sulfate and ampicillin. Compared with the control， QN2MO-1 could promote the germination of tomato seeds and 5% of fermentation broth treatment could significantly improve plant growth.

Keywords： Morinda citrifolia L.; Bacillus siamensis; growth-promoting; seed germination; field trial

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.12.015

海濱木巴戟（Morinda citrifolia L.），俗稱諾尼，茜草科巴戟天屬，譽(yù)為“天賜之物”“長(zhǎng)壽之物”，為海南珍貴鄉(xiāng)土樹(shù)種，種植粗放、成本低、收益高、功效良好，兼具經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值[1]。諾尼果氨基酸種類多且蛋白質(zhì)含量高，早在2000多年前波利尼西亞人就以其為治療疼痛的最主要藥用植物[2-4]。有研究表明，藥用植物體內(nèi)含有大量功能內(nèi)生菌，為新的活性物質(zhì)和抗生素分離提供了重要的微生物資源。因此，開(kāi)展諾尼內(nèi)生細(xì)菌鑒定和功能研究可為開(kāi)發(fā)微生物菌劑提供重要的基礎(chǔ)。

植物內(nèi)生菌在現(xiàn)今耕作競(jìng)爭(zhēng)中優(yōu)勢(shì)日漸明顯[5]。內(nèi)生菌可將連作中秸稈碳氮等消耗和酚類化感物質(zhì)等累積物的木質(zhì)素、纖維素等降解為土壤微生物易吸收的小分子物質(zhì)，從而促進(jìn)碳氮源的有效循環(huán)，使土壤微生物種群主導(dǎo)結(jié)構(gòu)從真菌向細(xì)菌轉(zhuǎn)變，有效抑制重金屬離子對(duì)土壤酶活性和微生物活動(dòng)的脅迫，提高土壤質(zhì)量[6]。國(guó)內(nèi)外正逐漸關(guān)注植物內(nèi)生菌的潛在功能，童文君[7]從美花石斛（Dendrobium loddigesii Rolfe）內(nèi)生菌種群中分離到67株具不同解磷、解鉀和產(chǎn)生長(zhǎng)素（IAA）的潛能細(xì)菌，對(duì)菌株進(jìn)行分類確定芽孢桿菌屬為優(yōu)勢(shì)屬。鄧平香等[8]研究了內(nèi)生菌對(duì)富集重金屬土壤的修復(fù)作用，從東南景天（Sedum alfredii）根系分離純化到熒光假單胞菌R1，對(duì)不同處理的鋅、鎘污染土接種R1，R1代謝產(chǎn)酸能促進(jìn)東南景天生長(zhǎng)和溶解土壤Zn和Cd。由此，探究創(chuàng)新農(nóng)業(yè)循環(huán)模式，發(fā)掘植物內(nèi)生菌促生優(yōu)勢(shì)及改良土壤潛力，具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究以藥用植物諾尼為研究對(duì)象，從植株各部位分離和鑒定內(nèi)生細(xì)菌，對(duì)其生理生化特性進(jìn)行表征，通過(guò)田間試驗(yàn)分析其對(duì)番茄生長(zhǎng)和發(fā)育的影響。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 樣品來(lái)源及處理? 諾尼的根、莖、葉、花和果實(shí)采自海南省澄邁縣橋頭鎮(zhèn)（19°58′35″N，109°55′35″E），分別將樣品進(jìn)行分類標(biāo)記，裝袋編號(hào)，4 ℃保存。

1.1.2? 培養(yǎng)基[9]? LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉l0 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 7.2～7.5;解磷培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，磷酸二氫鉀0.2 g，硫酸銨0.5 g，氯化鈉0.3 g，硫酸鎂0.3 g，氯化鉀0.2 g，0.5%硫酸錳6 mL，0.5%硫酸亞鐵6 mL，磷酸三鈣5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 7.2～7.4。

1.1.3? 供試作物? 供試材料為番茄（Lycopersicon esculentum Mill.），由海南澄邁老城濟(jì)光農(nóng)資店提供的常規(guī)主栽品種‘京丹1號(hào)。

1.2? 方法

1.2.1? 內(nèi)生細(xì)菌分離、初篩? 樣品消毒：取諾尼植株根、莖、葉、花、果實(shí)洗凈風(fēng)干。為了對(duì)各組織進(jìn)行滅菌處理，首先將各組織用75%乙醇處理5 min，后用次氯酸鈉（棕色瓶）處理20 min，再用10%的碳酸氫鈉浸泡10 min，無(wú)菌水沖洗5次，在滅菌濾紙上晾干并標(biāo)注。

樣品印跡試驗(yàn)[10]：采用組織印跡法將樣品貼放于LB培養(yǎng)基中5 min，28 ℃培養(yǎng)3 d作為無(wú)菌檢查。

樣品研磨：樣品徒手切成薄片后置于滅菌研缽中研磨至糊狀，各取汁液1 mL于離心管中（樣品之間處理需注意消毒），加入4 mL LB培養(yǎng)基，室溫180 r/min培養(yǎng)1 h，渦旋振蕩。

分離篩選：配制濃度梯度為10?1、10?2、10?3的樣品懸浮液，充分振蕩后各取200 μL滴于LB培養(yǎng)基上，涂布均勻，重復(fù)3次，常溫下倒置培養(yǎng)2 d，觀察菌落形態(tài)（樣品之間處理注意消毒）。用平板劃線法多次純化特征相異的單菌落至純培養(yǎng)。

1.2.2? 內(nèi)生細(xì)菌復(fù)篩? 將純化菌株轉(zhuǎn)接到固體解磷培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)2 d，觀察其是否產(chǎn)溶磷圈，產(chǎn)透明溶磷圈初定為解磷菌，選取溶磷圈明顯的10株菌株，擴(kuò)大培養(yǎng)并保存，進(jìn)行功能測(cè)定。

（1）解磷能力測(cè)定。將初篩解磷菌制成菌懸液過(guò)濾離心，按磷含量0、0.02、0.05、0.10、0.15、0.20、0.40、0.80、1.20、1.60 mg/L的濃度梯度配制磷標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用鉬銻抗比色法測(cè)定各濃度磷含量[9]，以未接種空白培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)濃度重復(fù)3次，利用分光光度計(jì)讀取OD700值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濾液中的磷含量（mg/L）。

（2）產(chǎn)生長(zhǎng)素（IAA）能力評(píng)估。將菌株接種于含100 mg/L L-色氨酸的LB培養(yǎng)基中，設(shè)3個(gè)重復(fù)，室溫、180 r/min培養(yǎng)2 d，取50 μL菌懸液滴于白色點(diǎn)滴板上，加入等體積“顯示劑”（Salkowski比色液），對(duì)照設(shè)置2組：等體積未接菌LB培養(yǎng)基和比色液的混合液為陰性對(duì)照，等體積50 μg/mL IAA液和比色液的混合液為陽(yáng)性對(duì)照，室溫避光靜置15 min，顏色不變色為陰性，不產(chǎn)IAA;變粉紅則為產(chǎn)IAA菌，可進(jìn)行IAA含量測(cè)定[11]。

產(chǎn)IAA能力測(cè)定：配制IAA母液（100 μg/mL），在25 mL定容瓶中定容濃度為0、10、20、30、40、50、60 μg/mL的IAA溶液，用分光光度計(jì)測(cè)定OD530，繪制IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線。將菌懸液離心（10 000 r/min，10 min），取上清液，加入等體積Salkowski比色液，方法同上，根據(jù)IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算菌株IAA產(chǎn)量[11]。

1.2.3? 內(nèi)生細(xì)菌分類鑒定? （1）形態(tài)學(xué)與生理生化鑒定。將菌株活化，37 ℃培養(yǎng)2 d，參考《常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[12]、《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[13]對(duì)其菌落形態(tài)特征及酶學(xué)特性、碳氮源利用、耐受性等進(jìn)行生理生化鑒定[14]。

（2）分子生物學(xué)鑒定。將活化菌株接種于LB培養(yǎng)基中，用細(xì)菌通用引物（27F： 5′-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3′和1492R： 5′-GGTTA?CCTTGTTACGACTT-3′）擴(kuò)增16S rDNA基因[9]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（25 μL）：DNA模板1 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，2TaqPCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL，反應(yīng)條件包括94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，72 ℃后延伸10 min，4 ℃保存。

取5 μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳預(yù)檢測(cè)，并送至華大基因測(cè)序。將序列與Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)，選取同源性較高序列，運(yùn)用MEGA 7.0軟件鄰接法[14]進(jìn)行聚類分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4? 內(nèi)生細(xì)菌對(duì)多種抗生素的藥敏性分析? 在LB培養(yǎng)基中滴加100 μL菌懸液，涂布均勻后放置抗菌藥物藥敏紙片，封口培養(yǎng)2 d，觀察記錄透明圈大小。

1.2.5? 內(nèi)生細(xì)菌對(duì)番茄種子萌芽和生長(zhǎng)的影響? 將菌種接入LB培養(yǎng)基中，常溫下?lián)u瓶培養(yǎng)（180 r/min，2 d），以不接菌種LB培養(yǎng)基為空白對(duì)照。對(duì)番茄種子進(jìn)行表面消毒[15]。

將番茄種子放入鋪有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中，設(shè)置菌原液、不同菌液濃度（10?1、10?2、10?3）、清水、培養(yǎng)基6個(gè)處理，各重復(fù)3次，每皿放置15粒種子。人工氣候培養(yǎng)箱中以溫度30 ℃、濕度80%、光照40%，培養(yǎng)7 d，觀察記錄其萌芽情況（胚芽長(zhǎng)度1.5 mm以上），計(jì)算萌芽率：萌芽率=（萌芽終期正常萌芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)）× 100%。相同條件培養(yǎng)至10 d，并用游標(biāo)卡尺測(cè)算記錄胚軸長(zhǎng)度、胚根長(zhǎng)度、胚軸粗壯程度等。

1.2.6? 內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液田間試驗(yàn)? 試驗(yàn)地概況：坐標(biāo)為19°30'21"N，109°29'42"E，受熱帶季風(fēng)氣候影響光熱充足，土壤類型為磚紅壤，肥力中等。

發(fā)酵液制備：以平板劃線法將復(fù)篩所得目標(biāo)菌株接于LB培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)2 d。挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h。發(fā)酵液以豆粕和糖蜜為培養(yǎng)基（C/N=1∶16），加入6%種子液，常溫140 r/min培養(yǎng)7 d，吸取100 ?L稀釋10倍涂板計(jì)數(shù)，將發(fā)酵液活菌數(shù)稀釋至105 CFU/mL備用。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)：設(shè)計(jì)3個(gè)處理，以農(nóng)戶常規(guī)種植方式為對(duì)照，按自漚沼澤肥∶復(fù)合肥=40∶1的混合配比澆施;按2.5%和5%濃度發(fā)酵液澆施。各處理施肥次數(shù)及時(shí)間保持一致，試驗(yàn)數(shù)據(jù)測(cè)量采取隨機(jī)取樣方式。

田間管理：2018年10月8日播種育苗;11月27日定植移栽，株距55 cm，行距120 cm，保苗株數(shù)1株/m2[16];2019年1月15日為開(kāi)花坐果期;2月20日左右開(kāi)始采摘，4月12日試驗(yàn)結(jié)束。

指標(biāo)測(cè)定：各處理隨機(jī)固定15株，根據(jù)不同發(fā)育期采集樣品指標(biāo)進(jìn)行生物學(xué)性狀及農(nóng)藝學(xué)性狀分析，如株高、莖粗、葉綠素、葉面積、壯苗指數(shù)、花數(shù)、可溶性固化物、果縱徑、果橫徑、單果重、鮮重、干重、生物量增加、整齊度[17-18]。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007軟件和單因素方差分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，運(yùn)用鄧肯氏新復(fù)極差檢驗(yàn)法（DMRT法）進(jìn)行差異顯著性分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 促生內(nèi)生菌的篩選

對(duì)諾尼植株不同部位樣品進(jìn)行消毒制成懸濁液，通過(guò)稀釋平板法初步分離純化到621株內(nèi)生細(xì)菌，選取10株優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行解磷及促生功能復(fù)篩，挑取其中效果最佳的果實(shí)內(nèi)生菌為研究對(duì)象，命名QN2MO-1。該菌落在LB培養(yǎng)基上呈橢圓形，呈淡黃色，不透明，表面平整，邊緣鋸齒狀，中央隆起，橢圓或短桿狀，屬于革蘭氏陽(yáng)性菌（圖1）。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，菌落趨向干燥扁平、邊緣褶皺不規(guī)則。

2.2? QN2MO-1內(nèi)生細(xì)菌解磷能力和IAA產(chǎn)出分析

采用鉬銻抗比色法測(cè)定菌懸液水解磷能力，紫外分光光度計(jì)OD700測(cè)定磷標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度吸光度，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.415x+0.0132（R2= 0.9935）。將QN2MO-1懸浮液稀釋100倍后測(cè)得OD700值為0.416，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到該菌解磷能力為（103.42±1.07）mg/L，說(shuō)明該菌株具有高效解磷能力。

根據(jù)Salkowski比色法鑒定結(jié)果（圖2），菌株QN2MO-1混合液與IAA陽(yáng)性對(duì)照組呈粉紅色，而未接菌陰性對(duì)照組無(wú)顏色變化，說(shuō)明菌株QN2MO-1可分泌IAA。利用紫外分光光度計(jì)分析IAA的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0069x+0.0058（R2=0.9989），計(jì)算QN2MO-1在含L-色氨酸LB培養(yǎng)基下分泌IAA量為（39.81±0.31）μg/mL。

2.3? QN2MO-1內(nèi)生細(xì)菌生理生化特征分析

試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果顯示，QN2MO-1在淀粉水解、明膠液化、過(guò)氧化氫酶活性和H2S產(chǎn)出中呈陽(yáng)性反應(yīng)，V-P試驗(yàn)代謝得出QN2MO-1可發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)丙酮酸，能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽;但酶脂、脲酶和甲基紅（MR）試驗(yàn)表現(xiàn)出陰性反應(yīng)。

碳源利用試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，QN2MO-1可利用肌醇、D-果糖、山梨醇、蔗糖、可溶性淀粉、蜜二糖、松三糖、海藻糖、α-乳糖、無(wú)水乳糖、D-甘露醇等碳源，不可利用麥芽糖、甘露醇、D-半乳糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖;在氮源利用試驗(yàn)中可利用天門冬酰胺、組氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、草氨酸、苯丙氨酸、硝銨酸、硫氨酸和甲硫氨酸，但是不可利用精氨酸、絲氨酸、乙酸銨、氯化銨、酪氨酸、半胱氨酸和四水合鉬酸銨。

2.4? 內(nèi)生細(xì)菌對(duì)多種抗生素的敏感性

由表1可知，QN2MO-1菌株對(duì)供試抗生素表現(xiàn)出不同的敏感性，尤其對(duì)青霉素、硫酸鏈霉素和氨芐西林3種抗生素表現(xiàn)出明顯抗性，而對(duì)其他抗生素不具有抗性，這些抗生素可用于后期選擇性培養(yǎng)QN2MO-1菌株。

2.5? QN2MO-1細(xì)菌分子生物學(xué)鑒定

通過(guò)PCR擴(kuò)增反應(yīng)和測(cè)序得到1個(gè)QN2MO-1共1456 bp序列片段，在GeneBank和EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)分析，通過(guò)MEGA 7.0軟件鄰接距離矩陣法將選取的24株與QN2MO-1同源性較高的16S rDNA基因序列共建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3）。結(jié)果表明，菌株QN2MO-1與Bacillus siamensis KCTC 13613T（AJVF01000043）和Bacillus amyloliquefaciens DSM 7T（FN597644）有較高同源性，處于同一分支，Bootstrap值為54%，且相似率分別為99.04%和98.76%。根據(jù)16S rDNA序列分析及進(jìn)化學(xué)結(jié)果，結(jié)合形態(tài)、培養(yǎng)及生理生化特征，初步鑒定該菌為Bacillus sp. QN2MO-1。

2.6? 內(nèi)生細(xì)菌對(duì)番茄種子萌芽率的影響

設(shè)定不同濃度（10?1、10?2、10?3）的菌懸液分別處理平板的番茄種子，以菌原液和水作為對(duì)照。種子培養(yǎng)7 d后，10?1菌懸液處理的種子萌芽率為53.3%，是水（對(duì)照）的1.26倍;10?2菌懸液萌芽率與水處理的結(jié)果差異不顯著;當(dāng)菌懸液濃度下降時(shí)種子萌發(fā)率有所下降;菌原液濃度過(guò)高導(dǎo)致種子不萌發(fā)。因此，說(shuō)明該菌液在一定濃度時(shí)具有催芽效果，尤其在10?1時(shí)處理效果最佳（圖4）。

2.7? 內(nèi)生細(xì)菌對(duì)番茄幼苗生長(zhǎng)的影響

番茄發(fā)芽10 d后，分析不同濃度菌液對(duì)番茄幼體生長(zhǎng)的影響。稀釋菌懸液對(duì)萌芽幼苗地上部生長(zhǎng)影響明顯優(yōu)于水，10?1濃度處理的萌芽幼苗胚軸比對(duì)照的長(zhǎng)0.46倍，10?2處理的幼苗胚軸直徑比對(duì)照的增加0.29 mm，說(shuō)明10?2濃度可使幼苗莖部粗壯;10?3使幼苗整體長(zhǎng)勢(shì)均勻，胚根比對(duì)照處理長(zhǎng)2.86 mm，幼苗總長(zhǎng)平均值為12.01 mm;觀察種子總體發(fā)育情況，處理組幼苗葉片數(shù)均多于對(duì)照組（圖5）。結(jié)果表明，QN2MO-1菌懸液可促進(jìn)幼苗的生長(zhǎng)。

2.8? 內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液對(duì)番茄田間試驗(yàn)的結(jié)果分析

由圖6可知，發(fā)酵液對(duì)開(kāi)花坐果期番茄生物學(xué)性狀作用均優(yōu)于常規(guī)組，2.5%和5%濃度處理組的株高分別比對(duì)照高13.80 cm和33.00 cm，莖圍分別增1.17 cm和1.25 cm;發(fā)酵液濃度可提高植株的開(kāi)花率，分別比對(duì)照提高32.86%和52.09%。經(jīng)方差分析，3個(gè)處理間葉綠素和葉表面積無(wú)明顯差異。

在采果期，發(fā)現(xiàn)5%發(fā)酵液使葉綠素含量比對(duì)照高4.65;不同處理間可溶性固形物含量無(wú)明顯差異;較常規(guī)施肥方式，莖粗隨發(fā)酵液濃度增加而提高，2.5%、5%濃度處理的莖粗分別為17.17 mm和19.92 mm;從農(nóng)藝學(xué)性狀看，果實(shí)縱徑和橫徑也呈遞增趨勢(shì)，果縱徑分別增加1.78 mm和2.55 mm，果橫徑則分別增加1.74 mm和2.52 mm，而常規(guī)組果實(shí)大小差異明顯，果縱徑差74.13%，果橫徑差57.15%;但3個(gè)處理果形指數(shù)均為1.06，果形呈長(zhǎng)圓形，差異不顯著;在產(chǎn)量上，2.5%發(fā)酵液處理的單果重比對(duì)照增加16.96%，5%發(fā)酵液處理的則增加26.72%（圖7）。

采果后，植株生物量測(cè)定結(jié)果表明，發(fā)酵液處理組的植株長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)，澆施2.5%和5%濃度發(fā)酵液分別使整體株高比CK高0.14 m和0.38 m，整齊度也比對(duì)照91.03%高0.49%和0.84%，鮮重增加3.44%和10.78%。生物量增長(zhǎng)則增加3.7%和6.55%（表2）。

3? 討論

植物內(nèi)生菌種類多樣性取決于自身和寄主種類多樣性，以及寄主不同部位分布的可選性[19]，目前報(bào)道的原料研究對(duì)象中，內(nèi)生菌多為芽孢桿菌屬（Bacillu）、假單孢菌屬（Pseudomonas）等，存在于至少129種大田作物及工業(yè)原料作物中[20]。2010年發(fā)現(xiàn)的暹羅芽孢桿菌（B. siamensis）是從泰國(guó)螃蟹腌制品中分離獲得的芽孢桿菌屬新種，其功能研究報(bào)道甚少，Raquel Pastor-Bueis等[21]在大田試驗(yàn)研究了B. siamensis液態(tài)肥對(duì)甜椒的增產(chǎn)效果，Amanul Islam等[22]從豆科作物中分離出一株暹羅芽孢桿菌，該菌使番茄株高增加14.66%～15.68%。作為芽孢桿菌屬新種，開(kāi)發(fā)功能性暹羅芽胞桿菌類菌劑有很大的研究空間。近年來(lái)，隨著微生物資源庫(kù)的不斷擴(kuò)寬，“不爛果”——諾尼的奇特藥用功效早在數(shù)十年前已被科學(xué)家驗(yàn)證，國(guó)內(nèi)學(xué)者鄭學(xué)勤發(fā)現(xiàn)諾尼富含八碳酸可抗氧化[23]，而近年來(lái)關(guān)于諾尼內(nèi)生菌的報(bào)道以鑒定為主[24]，并未對(duì)其功能進(jìn)行研究。

基于充分開(kāi)發(fā)種間橫向傳播微生物資源庫(kù)和拓展促生劑有效成分來(lái)源的理念，從來(lái)源安全、方便收集的角度考慮，以保健性藥用植物諾尼為對(duì)象，研究其內(nèi)生細(xì)菌的農(nóng)業(yè)應(yīng)用潛能，本研究從諾尼葉、莖、果、根、花共分離篩選到621株內(nèi)生細(xì)菌，分離部位的菌株數(shù)量莖>果>葉>花>根，發(fā)現(xiàn)除根際內(nèi)生菌外，植株的其他功能部位也含有豐富的內(nèi)生菌資源，并從諾尼果實(shí)中發(fā)現(xiàn)并分離得到Bacillus sp.。通過(guò)菌株功能測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其具有高效解磷和產(chǎn)IAA能力。眾所周知，磷是植物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)元素之一，特別是在我國(guó)缺磷耕地達(dá)2/3以上，篩選優(yōu)勢(shì)解磷菌不僅可以促進(jìn)作物生長(zhǎng)[25]，也可以緩解磷資源枯竭的壓力。另外，已有大量研究證明植物生長(zhǎng)素活躍于植物整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期，可促進(jìn)嫩葉、莖端、根尖等細(xì)胞分化，也是種子萌發(fā)過(guò)程中生物合成的重要來(lái)源[26]，早在1999年Shafiq就提出了促生菌產(chǎn)IAA等激素參與植物生命活動(dòng)的調(diào)控過(guò)程[27-28]，而且當(dāng)濃度過(guò)高時(shí)反而抑制植物生長(zhǎng)，可見(jiàn)IAA具有兩重性，分泌量的多寡也直接干預(yù)植物生理性狀的表達(dá)[29]。大量研究以根際土壤為產(chǎn)IAA菌株的分離篩選材料，賈西貝等[30]從堿蓬根際土壤中篩選并優(yōu)化一株IAA分泌量達(dá)87.86 μg/mL的短小芽孢桿菌（B. pumilus）。本研究從諾尼果實(shí)中分離內(nèi)生菌拓寬了產(chǎn)生長(zhǎng)素內(nèi)生菌的篩選范圍。許明雙[31]從番茄和水稻種子中分離得到兼具溶磷、產(chǎn)IAA或固氮等促生特性的內(nèi)生菌可影響番茄幼苗根莖長(zhǎng)度，Goudjal等[32]也研究發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生菌可產(chǎn)IAA并促進(jìn)番茄幼苗的生長(zhǎng)，隨著IAA處理浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，可能因IAA濃度增加而抑制根部生長(zhǎng)，另外，唐玉娟[33]通過(guò)研究論證了促生內(nèi)生菌對(duì)宿主植株個(gè)體發(fā)育均有明顯促進(jìn)作用，經(jīng)處理，植株株高、莖粗、果重、鮮重、干重等生長(zhǎng)指標(biāo)顯著提高。

番茄營(yíng)養(yǎng)豐富，既是蔬菜也是水果，全球消費(fèi)量大。本研究從諾尼果實(shí)中分離到一株解磷能力達(dá)（103.42±1.07） mg/L和產(chǎn)IAA能力達(dá)（39.81± 0.31） μg/mL的內(nèi)生細(xì)菌Bacillus sp. QN2MO-1對(duì)番茄具有明顯促生效果。通過(guò)種子萌芽試驗(yàn)驗(yàn)證，不同濃度菌懸液對(duì)番茄種子和幼苗的作用有差異，菌原液可能因濃度過(guò)高反而抑制種子萌發(fā)，稀釋至一定濃度時(shí)則促進(jìn)幼苗不同部位的萌發(fā)和生長(zhǎng)，說(shuō)明菌液對(duì)不同部位的促進(jìn)作用因濃度不同而異，可根據(jù)培養(yǎng)需要?jiǎng)討B(tài)調(diào)節(jié)菌液濃度達(dá)到最佳促生效果。通過(guò)大田試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液對(duì)番茄生物學(xué)性狀和農(nóng)藝性狀均具促進(jìn)作用，5%發(fā)酵液更能提高番茄光合效率和有機(jī)物質(zhì)總量積累，田間對(duì)照組中為農(nóng)戶常規(guī)施肥方式，自漚肥可能造成新的農(nóng)業(yè)污染，因此，可考慮該發(fā)酵液在常規(guī)施肥中自漚肥與復(fù)合肥的替代作用，以提高養(yǎng)分利用率及產(chǎn)量，降低農(nóng)業(yè)化學(xué)污染源。后續(xù)將通過(guò)抗生素標(biāo)記方法對(duì)QN2MO-1菌株在番茄植株中的定殖作進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

楊? 焱， 楊樸麗， 徐? 通. 功能植物諾麗栽培技術(shù)研究[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科技， 2018， 41（2）： 28-32.

Rainer W Bussmann. Noni （Morinda citrifolia L.） – A gift from paradise[M]. Peru： Argoya inc， 2007.

Singh A K， Peter P， Singh K. Noni （Morinda citrifolia） the wonder plant： History and future perspective[J]. Asian Agri-History， 2011， 15（3）： 211-229.

Ali M， Kenganora M， Manjula S N. Health benefits of Morinda citrifolia （noni）： A review[J]. Pharmacognosy Journal， 2016， 8（4）： 338-344.

石晶盈， 陳維信， 劉愛(ài)媛. 植物內(nèi)生菌及其防治植物病害的研究進(jìn)展[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)， 2006， 26（7）： 2395-2401.

王? 玲. 拮抗青枯病菌的茄科植物內(nèi)生菌篩選鑒定與控病研究[D]. 長(zhǎng)沙： 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2014.

童文君. 美花石斛內(nèi)生菌多樣性分析及促生潛力研究[D]. 南京： 南京師范大學(xué)， 2014.

鄧平香， 張? 馨， 龍新憲. 產(chǎn)酸內(nèi)生菌熒光假單胞菌R1對(duì)東南景天生長(zhǎng)和吸收、積累土壤中重金屬鋅鎘的影響[J]. 環(huán)境工程學(xué)報(bào)， 2016， 10（9）： 5245-5254.

柯春亮， 陳宇豐， 周登博， 等. 香蕉根際土壤解磷細(xì)菌的篩選、鑒定及解磷能力[J]. 微生物學(xué)通報(bào)， 2015， 42（6）： 1032-1042.

Ting Ding， Bo Su， Xiaojie Chen， et al. An endophytic bacterial strain isolated from Eucommia ulmoides inhibits Sou thern Corn Leaf Blight[J]. Frontiers in Microbiology， 2017， 8： 903.

張東艷， 劉? 曄， 吳? 越， 等. 花生根際產(chǎn)IAA菌的篩選鑒定及其效應(yīng)研究[J]. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)， 2016， 38（1）： 104-110.

東秀珠， 蔡妙英. 常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 2001： 364-398.

Buchanan R E， Gibbons N E. 伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 1984.

張妙宜， 陳宇豐， 周登博， 等. 蓖麻根際土壤解鉀菌的篩選鑒定及發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2016， 37（12）： 2268-2275.

Hong K， Gao A H， Xie Q Y， et al. Actinomycetes for marine drug discovery isolated from mangrove soils and plants in China[J]. Marine Drugs， 2009， 7（4）： 495-496.

阿爾祖古麗·阿卜力孜， 努爾買買提·阿不林林. 奈安“微蜜”有機(jī)水溶肥料在哈密瓜上的田間試驗(yàn)[J]. 中國(guó)果菜， 2017， 37（5）： 34-36.

劉中良， 鄭建利， 焦? 娟， 等. 麥秸、菌渣和稻殼還田對(duì)日光溫室番茄品質(zhì)及產(chǎn)量的影響[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)， 2017， 31（11）： 2243-2249.

張煥裕. 作物農(nóng)藝性狀整齊度的指標(biāo)方法新論[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2006（1）： 24-26.

王志偉， 紀(jì)燕玲， 陳永敢. 植物內(nèi)生菌研究及其科學(xué)意義[J]. 微生物學(xué)通報(bào)， 2015， 42（2）： 349-363.

靳? 錦， 趙? 慶， 張曉梅， 等. 植物內(nèi)生菌活性代謝產(chǎn)物最新研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)雜志， 2018， 38（3）： 103-113.

Raquel Pastor-Bueis， Rebeca Mulas， Xiomar Gómez， et al. Innovative liquid formulation of digestates for producing a biofertilizer based on Bacillus siamensis： Field testing on sweet pepper[J]. Journal of Plant Nutrition and Soil Science， 2017（6）： 748-758.

Amanul Islam， Shahinur Kabir， Abul Khair. Characterization and evaluation of Bacillus siamensis isolate for its growth promoting potential in tomato[J]. Agriculture （Pol nohospodárstvo）， 2019， 65（2）： 42-50.

蘇文潘， 呂? 平， 韋麗君， 等. 海巴戟研究進(jìn)展[J]. 廣西熱帶農(nóng)業(yè)， 2006， 103（2）：37-39.

白飛榮， 劉? 洋， 曹艷花， 等. 西沙野生諾尼葉片內(nèi)生菌的分離與初步鑒定[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)， 2015， 33（1）： 32-37.

張中峰， 周龍武， 徐廣平， 等. 廣西喀斯特地區(qū)植物根際土壤解磷菌篩選及促生效應(yīng)研究[J]. 廣西科學(xué)， 2018， 25（5）： 590-598.

Bialek K， Michalczuk L， Cohen J D. Auxin biosynthesis during seed germination in Phaseolus vulgaris[J]. Plant Physiology， 1992， 100（1）： 509-517.

Duca D， Lorv J， Patten C L， et al. Indole-3-acetic acid in plant-microbe interactions[J]. Antonie van Leeuwenhoek， 2004， 106（1）： 85-125.

朱詩(shī)苗. IAA促生菌的分離鑒定及對(duì)煙草種子萌發(fā)與煙苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響[D]. 延吉： 延邊大學(xué)， 2019.

Glick B R， Todorvic B， Czarny J， et al. Promotion of plant growth by bacterial ACC deaminase[J]. Critical Reviews in Plant Sciences， 2007， 26（5/6）： 227-244.

賈西貝， 王琦琦， 李? 楊， 等. 一株產(chǎn)吲哚乙酸耐鹽促生菌的分離、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 中國(guó)釀造， 2019， 38（11）： 37-42.

許明雙. 番茄和水稻種子可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的多樣性分析及促生菌功能研究[D]. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2014.

Goudjal Y， Toumatia O， Sabaou N， et al. Endophytic actinomycetes from spontaneous plants of Algerian Sahara： Indole-3-acetic acid production and tomato plants growth promoting activity[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology， 2013， 29（10）： 1821-1829.

唐玉娟. 山豆根內(nèi)生細(xì)菌的促生活性菌株篩選及其促生作用研究[D]. 南寧： 廣西大學(xué)， 2017.