吳芹 許子洋 劉麗萍 張文英 宋思遠

（江蘇醫(yī)藥職業(yè)學院，鹽城 224005）

高血壓是最常見的慢性病之一，也是心、腦、腎疾病發(fā)生發(fā)展的主要危險因素，具有高患病率、高致殘率和高死亡率的特點。據(jù)《中國心血管病報告2018》概要報道，我國現(xiàn)有2.45億高血壓患者［1］。當今社會節(jié)奏快，競爭壓力大，長期過度的腦力工作負荷、持續(xù)緊張、長期情緒或精神刺激、煩惱、焦慮等心理應激，使高血壓及其并發(fā)癥心、腦、腎等疾病的發(fā)病率持續(xù)上升，嚴重威脅人群健康，并且造成巨大的社會和家庭負擔。這些與現(xiàn)代生活方式相關的慢性應激，正在成為新的心血管疾病的風險因素［2］。如果這些應激因素持續(xù)存在，可能引起長期的高血壓，通常稱為應激性高血壓（Stressinduced hypertension，SIH）［3-4］。近來的研究顯示，高血壓的發(fā)生與腸道菌群的變化相關［5-6］，菌群對宿主血壓有直接影響［7］。無菌鼠的血壓相對降低［8］。用16S rRNA檢測高血壓大鼠和高血壓患者糞便的結(jié)果顯示，腸道菌群豐度和多樣性顯著下降，厚壁菌門（Firmicutes，F(xiàn)）/擬桿菌門（Bacteroidetes，B）的比率增加，標志腸道菌群紊亂［9］。但慢性應激引起的應激性高血壓是否與腸道菌群的變化相關尚不清楚。本研究觀察應激情況下，腸道菌群的變化以及通過四聯(lián)抗生素制備偽無菌鼠，研究腸道菌群的變化與應激性高血壓發(fā)生的相關性，為預防應激性高血壓提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 24只200-250 g雄性Sprague Dawley（SD）大鼠購自上海杰思捷實驗動物有限公司［動物生產(chǎn)許可證：SCXK（滬）-2018-0004］。大鼠進行隨機編號并稱重，分籠飼養(yǎng)?？刂骑暳?、飲水、室溫等條件均相同。保持12 h光照/12 h黑暗日周期，自由采食和飲水。所有動物實驗均經(jīng)過江蘇醫(yī)藥職業(yè)學院動物實驗倫理委員會同意，并嚴格遵守實驗動物護理和使用指南開展相關實驗。

1.1.2 儀器和試劑 應激性高血壓造模系統(tǒng)（上海繼德教學實驗器械廠），Illumina公司的Miseq PE300測序平臺（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司），PowerLab 8/35數(shù)據(jù)分析處理系統(tǒng)（澳大利亞AD Instruments公司）；氨芐西林、萬古霉素、新霉素、甲硝唑購自上海源葉生物科技有限公司，去甲腎上腺素（NE）的ELISA試劑盒購自上海威奧生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 應激性高血壓大鼠模型制備 大鼠適應性飼養(yǎng)3 d后，使用計算機控制的足底電擊結(jié)合噪聲的刺激方法，制備應激性高血壓大鼠模型。電擊和噪聲的間隔時間與組合均隨機。電擊籠的尺寸為22×22×26 cm3，底部鋪有銅柵，銅柵上可以通間斷性交流電。模型制備時，電擊電壓為35-80 V，同時隨機由蜂鳴器發(fā)出強度為90-100 db的噪聲，每次持續(xù)50 ms。應激性高血壓大鼠（stress組）每天上、下午各接受1次（每日2次）應激刺激，每次2 h，中間間隔4 h，共14 d。對照組大鼠（sham組）飼養(yǎng)條件同stress組，并且每天2次，每次2 h放入同樣的電擊籠，但不給予任何應激刺激。造模結(jié)束，于上午8：00前留取糞便標本，然后使用PowerLab 8/35數(shù)據(jù)分析處理系統(tǒng)測量股動脈血壓后留取血液等標本備用。

1.2.2 偽無菌鼠模型制備 根據(jù)文獻［10］，使用四聯(lián)廣譜抗生素（Antibiotics，AB）制備偽無菌鼠。12只大鼠分為抗生素組（sham_AB）和應激抗生素組（stress_AB），每組6只。在飲用水中加入1g/L氨芐西林、500 mg/L萬古霉素、1 g/L新霉素、1 g/L甲硝唑四種抗生素（所有抗生素均購自于Sigma公司），飲用水4 d更換一次。2周后，stress_AB組大鼠和stress組大鼠一起接受應激；4周之后，收集大鼠糞便用于后續(xù)的測序分析。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附實驗方法（ELISA） 檢測血漿去甲腎上腺素（Norepinephrine，NE）根據(jù)ELISA試劑盒說明書，按梯度稀釋標準品8個濃度，用于制作標準曲線。分別設空白對照孔、標準孔和待測樣品孔。空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步驟操作相同；標準孔加不同濃度的標準品各100 μL；待測樣品孔加血清100 μL?；靹?，封板，37℃，溫育30 min。洗滌5次，拍干。所有標準孔和待測樣品孔各加酶標試劑50 μL。37℃，溫育30 min，洗滌5次，拍干?？瞻讓φ湛住藴士缀痛郎y樣品孔按序依次加入顯色劑A 和B各50 μL，混勻，37℃，避光顯色15 min，加終止液50 μL用于終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。加終止液后15 min內(nèi)，使用酶標儀測定各孔OD值。酶標儀設定在450 nm波長。根據(jù)標準品濃度和OD 值計算標準曲線的直線回歸方程式。根據(jù)樣品的OD 值計算樣品濃度。

1.2.4 腸道菌群測序及分析 每天上午8：00在超凈臺中采集大鼠的新鮮糞便于無菌凍存管中，所有樣品立即于-80℃保存?zhèn)溆?。所有樣品干冰保存送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行16S rRNA的測序。引物名稱：338F_806R；F端序列：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG；R端序列：GGACTACHVGGGTWTCTAAT；長度：468；測序方式：PE300。采用 Illumina MiSeq 測序技術，測定大鼠糞便中微生物 16S rRNA V3-V4 區(qū)序列，并對群落結(jié)構(gòu)和多樣性進行了比較分析。使用I-Sanger云平臺比較分析樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)、組成和差異［11］。

1.2.5 統(tǒng)計學處理 所有實驗數(shù)據(jù)均用GraphPad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)土標準差（x-±s）表示，n表示大鼠的例數(shù)。兩組間單因素分析采用Student’s t-test檢驗；血壓和心率等數(shù)據(jù)采用重復測量的方差分析，進行組間兩兩比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 應激性高血壓大鼠行為、體重、血壓、心率及NE的變化

應激性高血壓組（stress組）大鼠每天接受2次應激刺激，每次2 h，中間間隔4 h，持續(xù)14 d。與對照組（sham組）大鼠相比，stress組大鼠從第2天開始就發(fā)生明顯的行為方面的改變。表現(xiàn)為高度警覺，躁動不安。在電擊籠中，呼吸加深加快、體毛豎立，出現(xiàn)緊張恐懼和逃避行為，常表現(xiàn)為呈直立狀攀附在電擊籠側(cè)壁。而sham組大鼠行為正常，表現(xiàn)為悠閑狀態(tài)。無論是sham組還是stress組大鼠的體重均呈增長趨勢，但是stress組大鼠的體重增長緩慢。應激造模14 d，與sham組大鼠相比，stress組大鼠體重增長明顯低于sham組大鼠（圖1-C）。造模結(jié)束次日，使用PowerLab 8/35數(shù)據(jù)分析處理系統(tǒng)測量sham組和stress組大鼠股動脈血壓和心率。與sham組相比，stress組大鼠的血壓升高、心率增快（圖1-A-B）。大鼠處死前留取靜脈血5 mL，分離血清后-80℃?zhèn)溆谩Ｊ褂肊LISA方法檢測大鼠血清NE含量，用于評價大鼠外周交感神經(jīng)興奮狀態(tài)。與sham組相比，stress組大鼠血清NE含量顯著增高（圖1-D）。

圖1 應激性高血壓大鼠血壓、心率、體重增長及血清去甲腎上腺素的變化

2.2 慢性應激降低大鼠腸道菌群α多樣性

α多樣性反映群落中所含物種的種類數(shù)目和群落中各物種的相對密度是否均勻。分別取sham組和stress組大鼠糞便，進行群落多樣性測序及交互式分析。α多樣性分析顯示，應激性高血壓大鼠腸道菌群OTU數(shù)目少于對照組（圖2-A）；chao和ace 指數(shù)均小于對照組，表明群落豐富度低于對照組（圖2-B-C）；Shannon指數(shù)低于對照組，而Simpson指數(shù)高于對照組，說明群落多樣性高于對照組（圖2-DE）；converge顯示對照組和應激組的物種覆蓋度沒有差異（圖2-F）。結(jié)果顯示，引起高血壓的慢性應激顯著降低了腸道菌群的豐富度。

2.3 慢性應激改變大鼠腸道菌群OUT水平物種組成和β多樣性

通過Venn 圖分析應激性高血壓大鼠與對照大鼠腸道菌群的物種組成，應激性高血壓大鼠腸道菌群OTU數(shù)目為560種，低于stress組大鼠的613種，兩組共有的OTU數(shù)目為521種（圖3-A）。為了進一步評估兩組樣本間OTU組成的相似性和差異性，進行β多樣性分析，基于bray_curtis距離PCoA分析，應激性高血壓大鼠各樣本在平面圖的分布區(qū)域與對照組明顯不同，相互距離較遠，分界清楚（圖3-B），顯示了慢性應激降低了大鼠腸道菌群物種數(shù)目，并改變了物種組成。

圖2 慢性應激對大鼠腸道菌群α多樣性的影響。

2.4 慢性應激改變腸道菌群門水平的物種組成

慢性應激14 d大鼠腸道菌群的組成發(fā)生顯著改變。用Circos圖反映各組Phylum（門）分類學水平下物種的分布比例情況，對照組和應激組樣本中物種比較豐富，以厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為主（圖4-A）。

抗生素制備的偽無菌鼠腸道菌群的豐度和多樣性顯著下降。Sham_AB和stress_AB組物種單一，基本均為變形菌門（Proteobacteria）（圖4-B）。用Kruskal-Wallis秩和檢驗（Kruskal-Wallis H test）對4組樣本在Phylum（門）水平下進行顯著性差異分析，與Circos圖結(jié)果一致，對照組和應激組大鼠的優(yōu)勢菌是厚壁菌門和擬桿菌門，而sham_AB和stress_AB組的優(yōu)勢菌是Proteobacteria（圖4-C）。用PCA圖比較sham_AB和stress_AB組腸道菌群的β多樣性的結(jié)果顯示，sham_AB和stress_AB組樣本點非常接近，表明兩組物種組成在門水平相似（圖4-D），即飲用抗生素水的大鼠，腸道除了少量的變形菌門外，沒有其他菌群物種存在，提示慢性應激不能明顯改變偽無菌大鼠的腸道菌群在門水平的組成。

圖3 慢性應激對大鼠腸道菌群組成和多樣性的影響

2.5 慢性應激不改變偽無菌鼠BP、HR、體重及血清NE濃度

SD大鼠接受14 d的慢性足底電擊結(jié)合噪聲應激后，血壓升高、心率加快、體重增長緩慢及血清去甲腎上腺素濃度增加。飲用含四聯(lián)抗生素飲用水的偽無菌鼠，其血壓、心率、體重增長及血清去甲腎上腺素濃度與正常飲水組大鼠相比，無顯著變化。飲用四聯(lián)抗生素水的偽無菌鼠接受相同應激刺激后，未出現(xiàn)正常大鼠應激后血壓升高、心率加快、體重增長緩慢及血清去甲腎上腺素濃度增加的變化（圖5），顯示應激引起的這些變化對腸道菌群的依賴性。

3 討論

本研究采用足底電擊結(jié)合噪聲刺激方法建立應激性高血壓動物模型。這一方法是國際上普遍認可的大鼠應激性高血壓造模方法［12-13］。本研究結(jié)果顯示，這種應激方法，使大鼠血壓升高、心率增快，體重增長緩慢，血清NE濃度增加，表明高血壓模型成功。大鼠糞便標本應用16S rRNA測序分析顯示，腸道菌群豐富度、多樣性下降，物種組成數(shù)目下降。大鼠飲用含四聯(lián)廣譜抗生素水一個月后，腸道菌群基本殺滅，成為偽無菌鼠。給予偽無菌鼠相同的足底電擊結(jié)合噪聲的慢性應激，不再引起大鼠的血壓升高、心率增快和血清NE濃度增加。這些結(jié)果提示，應激性高血壓的發(fā)生與腸道菌群的紊亂密切相關。

應激可通過激活交感腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)和下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸引起血壓升高等應激反應［14-15］。本文通過足底電擊結(jié)合噪聲的方法建立的應激性高血壓大鼠模型一般在電擊第5天開始，血壓和心率就明顯升高，第10天達到峰值，持續(xù)應激到14 d，期間的血壓和心率維持在最高水平。應激性高血壓大鼠除了血壓和心率的變化，在行為上還表現(xiàn)為躁動不安、警覺性增高、且易于激惹；在飲食上發(fā)現(xiàn)飲水增多，但食用飼料量減少，有厭食現(xiàn)象，因此體重增長緩慢［16］。這些現(xiàn)象都顯示，應激引起了交感腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)和下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的激活。就血壓而言，交感腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)和下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的激活最終通過增加外周交感神經(jīng)的活動引起血壓升高。外周血中的NE濃度可反映交感活動的狀態(tài)。我們使用ELISA方法檢測大鼠血清NE濃度，發(fā)現(xiàn)應激性高血壓大鼠血清NE濃度明顯增加，說明交感神經(jīng)興奮性增強，是應激引起血壓升高的機制。

圖4 抗生素對腸道菌群豐度和多樣性的作用

研究表明，應激改變腸道菌群［17］。菌群介導應激反應得到了用益生菌和/或抗生素處理的無菌小鼠等嚙齒類動物實驗及臨床試驗的支持。無菌成年小鼠可放大應激誘導的腎上腺皮質(zhì)激素和皮質(zhì)酮的釋放，無菌小鼠的這種應激反應可以通過移植對照動物的糞便部分逆轉(zhuǎn)［18］。益生菌降低大鼠急性應激時的腸道通透性和下丘腦-垂體-腎上腺軸反應［19］；給予成年人補充益生菌植物乳桿菌P8可緩解壓力和焦慮，提高社會情緒認知、口頭學習和記憶能力，降低血漿皮質(zhì)醇水平和促炎細胞因子IFN-γ、TNF-α等水平［20］。本實驗發(fā)現(xiàn)，應激性高血壓大鼠腸道菌群的OTU數(shù)目下降，α多樣性分析顯示應激引起菌群的豐富度下降；通過β多樣性分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，應激性高血壓大鼠腸道菌群多樣性下降，且引起了菌群物種組成與正常組明顯差異。這些改變提示，應激引起了腸道菌群紊亂。高血壓的發(fā)生與腸道菌群的變化相關［7］的研究提示，應激引起的腸道菌群紊亂可能是應激性高血壓的原因。為了進一步探討應激引起的腸道菌群變化與應激性高血壓的發(fā)生存在因果關系，我們將四聯(lián)廣譜抗生素加在大鼠飲用水中4周，制備偽無菌鼠。使用抗生素清除腸道菌群是觀察菌群在疾病發(fā)生機制中的一種方法，比直接使用無菌鼠更便于實驗的開展。本研究使用抗生素的時間較長，一是應激性高血壓造模周期需2周時間，二是盡可能清除腸道菌群。本文對使用四聯(lián)抗生素4周大鼠糞便的進行16S rRNA測序分析顯示，僅存少量的變形菌門，基本達到無菌的目的。本實驗結(jié)果顯示，引起正常大鼠產(chǎn)生高血壓的慢性應激方法不再引起偽無菌大鼠的交感神經(jīng)活動增強、血壓升高，這一結(jié)果表明，腸道菌群參與了應激性高血壓的發(fā)生。雖然許多研究都顯示，腸道菌群紊亂與人和動物高血壓的發(fā)生密切相關，但腸道菌群紊亂引起高血壓的機制還不清楚［21］。最近的文獻表明，腸道菌群的代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸（Short-chain fatty acids，SCFAs）參與高血壓的調(diào)節(jié)，腸道菌群紊亂引起SCFAs減少可能成為血壓升高的因素［5，22］。在血管緊張素 II誘發(fā)的高血壓小鼠模型中，補充丁酸鹽可顯著降低血壓，而高血壓患者循環(huán)丁酸鹽降低［23］。SCFAs可通過通過分布在腎臟或血管內(nèi)膜上的受體對血壓進行調(diào)節(jié)［24］。臨床研究顯示通過高纖維食物補充SCFAs具有抗高血壓的作用［25］。腸道菌群紊亂可能導致交感神經(jīng)活性增加而成為高血壓的機制［26］。我們過去的工作表明，下丘腦室旁核小膠質(zhì)細胞激活引起的神經(jīng)炎癥是應激性高血壓發(fā)生的重要機制［13］，下丘腦室旁核促炎型小膠質(zhì)細胞增多，炎癥因子表達增加丁酸具有抑制促炎型小膠質(zhì)細胞的作用，在應激情況下，是否由于腸道丁酸的減少，影響室旁核神經(jīng)炎癥的機制引起血壓的改變等，都有待進一步探討。

圖5 慢性應激對偽無菌大鼠血壓、心率、體重增加及血清去甲腎上腺素濃度的變化

4 結(jié)論

應激性高血壓大鼠腸道菌群豐富度和多樣性下降，菌群物種組成變少，差異性變大。抗生素處理形成的偽無菌鼠，腸道菌群物種單一，僅有少量的變形菌門。給予偽無菌鼠慢性應激，不再引起大鼠血壓升高，心率增快，血清去甲腎上腺素濃度未升高。這提示了應激性高血壓的發(fā)生對腸道菌群的依賴性。