張 勤（通信作者） 王永亮 曹曉婉 鄭州海關(guān)（河南，鄭州，450003）

左 鋒 天津海關(guān)（天津，300450）

邱英華 付玉和 杭州眾測(cè)生物科技有限公司（浙江，杭州，310000）

登革熱是由4 種血清型的登革病毒（denguevirus，DVI～Ⅳ）引起的、經(jīng)伊蚊傳播的急性傳染病。登革病毒感染除引起登革熱外， 嚴(yán)重的還會(huì)導(dǎo)致登革出血熱或登革休克綜合征。 登革熱廣泛流行于全球熱帶及亞熱帶的100 多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)， 全球大約有25 億人口受到該病的威脅，每年約有5100 萬(wàn)人感染登革熱病毒，造成25000 人死亡［1，2］。四種登革病毒在抗原上是密切相關(guān)的，一種登革病毒誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的抗體可與其他型別的登革病毒結(jié)合，非但不能中和異形病毒，反而導(dǎo)致感染后病情的加重， 發(fā)展為登革出血熱或登革休克綜合征［3］。監(jiān)測(cè)與防控登革熱已成為國(guó)際公共衛(wèi)生亟待解決的問(wèn)題， 對(duì)登革病毒進(jìn)行快速檢測(cè)和分型，具有重要意義。 本研究采用RAA 技術(shù)，以DV NS1 基因區(qū)段分別設(shè)計(jì)DVⅠ、DVⅡ、DVⅢ和DV Ⅳ特異性引物和探針， 建立快速、 準(zhǔn)確DENV 分型鑒定體系， 為口岸登革病毒防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

登革病毒陽(yáng)性血清、黃熱病毒陽(yáng)性血清、基孔肯雅病毒陽(yáng)性血清、寨卡病毒陽(yáng)性血清、乙型腦炎病毒陽(yáng)性血清均為本實(shí)驗(yàn)室保存的確診血清樣本。

1.2 主要試劑及儀器

QIAamp Viral RNA Mini Kit 購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，RT-RAA 核酸擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自杭州眾測(cè)生物科技有限公司，QIACUBE 全自動(dòng)核酸提取儀購(gòu)自Qiagen 公司，核酸蛋白檢測(cè)儀購(gòu)自BioDrop DUO 公司，Genchek-2 熒光檢測(cè)儀購(gòu)自杭州眾測(cè)生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品RNA 提取

取140μL 血清樣本，采用Qiagen RNA Mini Kit按試劑盒說(shuō)明書(shū)及QIACUBE 全自動(dòng)核酸提取儀使用要求提取樣本總RNA。 BioDrop DUO 核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定核酸濃度，分裝后保存于-80℃冰箱。

1.3.2 I 型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型登革病毒RT-RAA 引物、探針的設(shè)計(jì)合成與篩選

根據(jù)GenBank 公布的登革病毒序列號(hào)，進(jìn)行多序列比對(duì)， 應(yīng)用Oligo 7.0 軟件分別設(shè)計(jì)引物和探針。RT-RAA 引物長(zhǎng)度一般為28～33bp，探針長(zhǎng)度為48～52bp，設(shè)計(jì)多條正向引物和反向引物，將上游引物和下游引物分別進(jìn)行組合，分別對(duì)不同的引物組合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，來(lái)對(duì)引物組合進(jìn)行篩選。 引物探針由擎科生物技術(shù)有限公司合成。 所對(duì)比的登革病毒序列號(hào)：DV I 所對(duì)比的登革病毒序列號(hào)為：

KT751350.1，KT751349.1，KT751348.1，KT751347.1，KT751346.1，KF385907.1，KF385907.1，KF385906.1，KF385905.1，KF385904.1，KF385903.1，KF385902.1，KF385901.1，KF385900.1，KF385891.1，KF385890.1，KF385889.1，KF385888.1，KF385887.1，KM925074.1，KM925073.1，KR057905.1，KR057904.1，KR057903.1，AY089980.1，AY089979.1，X69396.1，X69395.1，KJ418180.1，KU509249.1，KU509250.1，KU509251.1，KU509252.1，KU509253.1，KU509254.1，KU509255.1，KU509256.1，KU509257.1，KU509258.1，KU509259.1，KU509260.1，KU509261.1，KU509262.1，KU509263.1，KU509264.1，KU509265.1，KU509266.1，KX225483.1，KX225484.1，KX225490.1，KX225489.1，KX225488.1，KX225487.1，KX225491.1，KX225492.1，KX225493.1，KX452051.1，KX452052.1，KX452053.1，KX452054.1，KX452055.1，KX452056.1，KX452057.1，KX452058.1，KX452059.1，KX452060.1，KX452061.1。 DV Ⅱ所對(duì)比的登革病毒序列號(hào)為：

Z17213.1，U51930.1，U51929.1，U51928.1，M58493.1，M58492.1，M58491.1，M58490.1，M58489.1，M58488.1，M58487.1，M58486.1，U19778.1，AF457574.1，X69191.1，KT751363.1，KT751362.1，KT751361.1，KT751360.1，KT751359.1，KT751358.1，AY422469.1，AY871815.1，KF385913.1，KF385912.1，KF385911.1，KF385910.1，KF385909.1，KX452031.1，KX452046.1，KR779786.2，KX452015.1，KX452016.1，KX452017.1，KX452018.1，KX452019.1，KX452020.1，KX452021.1，KX452022.1，KX452024.1，KX452025.1，KX452026.1，KX452027.1，KX452028.1，KX452029.1，KX452030.1，KX452032.1，KX452037.1，KX452038.1，KX452039.1，KX452040.1，KX452041.1，KX452042.1，KX452043.1，KX452045.1，KX621245.1，KX621246.1，KY427084.1，KY427085.1，KY627762.1，KY627763.1，KY921904.1，KY921905.1，KY923048.1，LC129169.1，LC129170.1。 DV Ⅲ所對(duì)比的登革病毒序列號(hào)為：U93298.2，U93295.2，U93294.2，U93302.2，U93301.2，U93303.1，U93300.1，U93299.1，U93297.1，U93296.1，AY422470.1，KF385930.1，KF385929.1，KF385928.1，KF385927.1，KF385926.1，KF385925.1，KF385924.1，KF385923.1，KF385922.1，KF385921.1，KF385920.1，KF385919.1，KF385918.1，KF385917.1，KF385916.1，KF385915.1，KF385914.1，KC261634.1，GU189648.1，GU370053.1，GU370052.1，KX380842.1，KX380841.1，KX380840.1，KX380839.1，JQ920489.1，JQ920488.1，JQ920487.1，JQ920486.1，JQ920485.1，JQ920484.1，JQ920483.1，JQ920479.1，JQ920480.1，JQ045695.1，JQ045693.1，JQ045691.1，JQ045692.1，JQ045689.1，JQ045687.1，AB214881.1，M93130.1，AB214881.1，KU216208.1，MF370226.1。DV Ⅳ所對(duì)比的登革病毒序列號(hào)為：KR011349.2，KP140942.1，KR922405.1，JQ915090.1，JQ915089.1，JQ915088.1，JQ915087.1，JQ915086.1，JQ915085.1，JQ915084.1，JQ915083.1，JQ915082.1，JQ915081.1，F(xiàn)J196850.1，F(xiàn)J196849.1，KU523872.1，KU523871.1，KT794007.1，KP406806.1，JF262780.1，KC333651.1，JX024758.1，JX024757.1，JQ822247.1，JF741967.1，JN983813.1，KY920910.1，KY920909.1，KU745648.1，KU745647.1，KU745641.1，KU745640.1，KU745639.1，KU745645.1，KU745644.1，KU745643.1，KU745642.1。

1.3.3 反應(yīng)體系和反應(yīng)程序

采用Genchek-2 熒光檢測(cè)儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RAA 檢測(cè)，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)配制RAA 反應(yīng)體系，總體積50μL ：A buffer 12.5μL，上下游引物各2μL，探 針0.6μL， 模 板2μL， 滅 菌ddH2O 28.4μL，B buffer2.5μL。 擴(kuò)增條件設(shè)定在39℃，25min。

1.3.4 靈敏度檢測(cè)

分別合成含有待檢測(cè)DV I、DV Ⅱ、DV Ⅲ、DVⅣ基因序列的質(zhì)粒， 將質(zhì)粒梯度稀釋為103、102、101copies/μl，檢測(cè)方法的靈敏度。

1.3.5 特異性檢測(cè)

用建立的方法分別檢測(cè)黃熱病毒陽(yáng)性血清、基孔肯雅病毒陽(yáng)性血清、寨卡病毒陽(yáng)性血清、乙型腦炎病毒陽(yáng)性血清、 四種登革病毒陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)方法的特異性。

1.3.6 穩(wěn)定性檢測(cè)

用建立的方法重復(fù)檢測(cè)黃熱病毒陽(yáng)性血清、基孔肯雅病毒陽(yáng)性血清、寨卡病毒陽(yáng)性血清、乙型腦炎病毒陽(yáng)性血清、 四種登革病毒陽(yáng)性血清4～6 次，評(píng)價(jià)方法的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 引物的篩選及反應(yīng)體系的建立

分別提取DV I 陽(yáng)性血清、DV Ⅱ陽(yáng)性血清、DVⅢ陽(yáng)性血清、DV Ⅳ陽(yáng)性血清核酸， 分別對(duì)DV I 7對(duì)引物組合、DV Ⅱ13 對(duì)引物組合、DV Ⅲ9 對(duì)引物組合和DV Ⅳ的5 對(duì)引物組合進(jìn)行RT-RAA 擴(kuò)增，根據(jù)對(duì)陽(yáng)性樣本檢測(cè)中熒光值的強(qiáng)弱優(yōu)選出引物探針，如表1 所示。 測(cè)定在50μL 反應(yīng)體系中，當(dāng)上下游引物工作濃度為10μmol/L 加入2μL，探針工作濃度為10μmol/L 加入0.6μL， 擴(kuò)增溫度為39℃，能獲得最佳熒光吸收信號(hào)（見(jiàn)表1）。

2.2 靈敏度檢測(cè)試驗(yàn)

表1 DVⅠ、DVⅡ、DVⅢ和DV Ⅳ特異性引物探針序列

測(cè) 定DV I、DV Ⅱ、DV Ⅲ、DV Ⅳ4 種 質(zhì) 粒 濃度，以10 倍梯度稀釋，進(jìn)行RT-RAA 反應(yīng)，結(jié)果如圖1～圖4 所示，5 分鐘左右開(kāi)始擴(kuò)增，20 分鐘可以完成，隨著樣品質(zhì)粒濃度的降低，擴(kuò)增時(shí)間相應(yīng)延長(zhǎng)，102copies/μl 濃度的樣品都能被有效擴(kuò)增。

圖1 DV I 陽(yáng)性質(zhì)粒靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

圖2 DV Ⅱ陽(yáng)性質(zhì)粒靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

圖3 DV Ⅲ陽(yáng)性質(zhì)粒靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

圖4 DV Ⅳ陽(yáng)性質(zhì)粒靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

2.3 特異性檢測(cè)試驗(yàn)

提取基孔肯雅病毒陽(yáng)性血清、黃熱病毒陽(yáng)性血清、寨卡病毒陽(yáng)性血清、乙型腦炎病毒陽(yáng)性血清、四種登革病毒陽(yáng)性血清核酸，分別用DV I、DV Ⅱ、DVⅢ、DV Ⅳ引物探針及DV 通用型引物探針對(duì)上述樣本進(jìn)行RT-RAA 擴(kuò)增， 每個(gè)試驗(yàn)設(shè)4～6 個(gè)重復(fù)，結(jié)果如圖5～圖8 顯示， 使用DV I 特異性引物探針進(jìn)行擴(kuò)增， 則僅DV I 陽(yáng)性血清出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線；使用DV Ⅱ特異性引物探針?lè)謩e檢測(cè)上述樣本，則僅DV Ⅱ陽(yáng)性血清出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線， 使用DV Ⅲ特異性引物探針?lè)謩e檢測(cè)上述樣本，則僅DVⅢ陽(yáng)性血清出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線， 使用DV Ⅳ特異性引物探針?lè)謩e檢測(cè)上述樣本， 則僅DV Ⅳ陽(yáng)性血清出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，而四種登革病毒特異性引物探針擴(kuò)增基孔肯亞病毒陽(yáng)性血清、黃熱病毒陽(yáng)性血清、寨卡病毒陽(yáng)性血清、乙型腦炎病毒陽(yáng)性血清均為陰性，說(shuō)明所建立的RT-RAA 方法具有良好的特異性。

1 為DVI 陽(yáng)性血清的擴(kuò)增曲線；2 為DV Ⅱ陽(yáng)性血清、DV Ⅲ陽(yáng)性血清、DV Ⅳ陽(yáng)性血清、基孔肯雅病毒陽(yáng)性血清、黃熱病毒陽(yáng)性血清、乙型腦炎病毒陽(yáng)性血清、寨卡病毒陽(yáng)性血清擴(kuò)增曲線

圖5 DV I 特異性試驗(yàn)結(jié)果

1 為DVⅡ陽(yáng)性血清的擴(kuò)增曲線；2 為DV I 陽(yáng)性血清、DV Ⅲ陽(yáng)性血清、DV Ⅳ陽(yáng)性血清、基孔肯雅病毒陽(yáng)性血清、黃熱病毒陽(yáng)性血清、乙型腦炎病毒陽(yáng)性血清、寨卡病毒陽(yáng)性血清擴(kuò)增曲線

圖6 DV Ⅱ特異性試驗(yàn)結(jié)果

1 為DVⅢ陽(yáng)性血清的擴(kuò)增曲線；2 為DV I 陽(yáng)性血清、DV Ⅱ陽(yáng)性血清、DV Ⅳ陽(yáng)性血清、基孔肯雅病毒陽(yáng)性血清、黃熱病毒陽(yáng)性血清、乙型腦炎病毒陽(yáng)性血清、寨卡病毒陽(yáng)性血清擴(kuò)增曲線

圖7 DV Ⅲ特異性試驗(yàn)結(jié)果

1 為DVⅣ陽(yáng)性血清的擴(kuò)增曲線；2 為DV I 陽(yáng)性血清、DV Ⅱ陽(yáng)性血清、DV Ⅲ陽(yáng)性血清、基孔肯雅病毒陽(yáng)性血清、黃熱病毒陽(yáng)性血清、乙型腦炎病毒陽(yáng)性血清、寨卡病毒陽(yáng)性血清擴(kuò)增曲線

圖8 DV Ⅳ特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 重復(fù)性檢測(cè)試驗(yàn)

如圖5～圖8 顯示， 用建立的方法重復(fù)檢測(cè)6次，熒光值相同，且擴(kuò)增曲線走勢(shì)差異較小，說(shuō)明具有很好的重復(fù)性。

3 討論

登革病毒的四種血清型在中國(guó)內(nèi)陸均引起過(guò)登革熱的暴發(fā)流行［4-8］。DV Ⅲ是早期（1978 年）報(bào)道的主要流行血清型病毒，隨后則報(bào)道了DVⅠ和DVⅣ。鄭夔等對(duì)在廣東省四次暴發(fā)的登革熱（1991 年、1995 年、1997 年和1999 年）中分離得到的DVⅠ病毒株序列進(jìn)行了遺傳分析，證實(shí)廣東省的DVⅠ來(lái)源于菲律賓、 印尼和泰國(guó)等東南亞國(guó)家和西太平洋國(guó)家； 方美玉等對(duì)比分析了廣東省1993 年和1998 年登革熱暴發(fā)DVⅡ病毒株和1985 年海南省DVⅡ分離株NS1 序列， 表明它們來(lái)自于不同的傳染源；姚海軍等對(duì)1990 年和1978 年引起廣東省登革熱的DVⅣ毒株基因序列進(jìn)行了分子溯源。 研究表明，基因組核苷酸序列分型和血清學(xué)分型法完全吻合［9］。

實(shí)時(shí)熒光RAA 技術(shù)是在普通RAA 的基礎(chǔ)上，利用熒光染料在激發(fā)光作用下所釋放熒光光能的變化來(lái)動(dòng)態(tài)反映RAA 擴(kuò)增產(chǎn)物量的新技術(shù)［10］。 本研究根據(jù)RAA 引物和探針設(shè)計(jì)原則， 分別設(shè)計(jì)了DVI～Ⅳ的引物和探針， 建立了實(shí)時(shí)熒光RT-RAA登革病毒血清型鑒定方法， 在39℃下等溫反應(yīng)20min，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的有效擴(kuò)增，檢測(cè)的靈敏度可達(dá)102copies/μl，試驗(yàn)的重復(fù)性好，又縮短了反應(yīng)時(shí)間提高了工作效率。 此方法不但可以在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，還可以現(xiàn)場(chǎng)操作，有利于口岸登革病毒的準(zhǔn)確、快速分型鑒定，該方法的建立為口岸登革熱的篩查及溯源提供了技術(shù)保障。