黃素珍 張 璐 彭 雪 葛芳杰 劉碧云 周巧紅 吳振斌

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

藻類是水生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分, 在水生態(tài)系統(tǒng)食物網(wǎng)、生物地球化學(xué)循環(huán)和氣候調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[1]。研究發(fā)現(xiàn), 環(huán)境變化(如水體富營養(yǎng)化)既會(huì)導(dǎo)致藻類生物量快速增長而爆發(fā)水華,也會(huì)誘導(dǎo)水華的快速消退, 當(dāng)前的研究認(rèn)為細(xì)胞程序性死亡(Programmed cell death, PCD)可能在藻類快速消亡過程中發(fā)揮重要的作用[1]。

PCD是一種由特定基因參與調(diào)控的細(xì)胞死亡模式, 是維持多細(xì)胞生物體正常發(fā)育和穩(wěn)態(tài)的重要自我調(diào)控機(jī)制[2]。雖然PCD是多細(xì)胞生物常見的一種死亡途徑, 然而, 近年來的研究也發(fā)現(xiàn)環(huán)境脅迫下的藻類細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)、生理和生化等方面均有類似PCD的響應(yīng), 故在很多研究中也使用類PCD來描述藻類的死亡方式。如首先在形態(tài)學(xué)上觀察到細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸外翻、細(xì)胞皺縮、細(xì)胞器降解、染色質(zhì)凝集、核變化和DNA片段化等PCD特征[3—6]; 其次在蛋白質(zhì)水平上表現(xiàn)出具有啟動(dòng)細(xì)胞PCD功能的caspase-like蛋白[3,7,8]; 并且在分子水平上還證實(shí)了藍(lán)藻、綠藻、硅藻和甲藻等均廣泛存在與多細(xì)胞生物caspase同源的基因[1,3,9—11]。藻類細(xì)胞的類PCD在種群調(diào)控中發(fā)揮著重要作用,其有可能在營養(yǎng)限制條件下通過部分細(xì)胞死亡來釋放出營養(yǎng)物以供其他細(xì)胞使用, 減輕營養(yǎng)脅迫壓力; 或是作為消除衰老和/或受損的細(xì)胞、增加生物量、限制感染期間病毒的繁殖和調(diào)控捕食者種群的策略, 從而達(dá)到為同種群其他細(xì)胞提供生存機(jī)會(huì), 保存種群的目的[1,12—14]。

許多研究表明, 信號(hào)分子對(duì)PCD具有重要調(diào)控作用。到目前為止, 藻細(xì)胞內(nèi)主要有ROS/NO/Ca2+三種信號(hào)分子。ROS/NO/Ca2+介導(dǎo)藻細(xì)胞類PCD的作用主要取決于其濃度。高濃度的ROS/NO/Ca2+對(duì)藻細(xì)胞具有損傷和破壞作用, 而低濃度的ROS/NO/Ca2+能夠作為信號(hào)分子來減輕環(huán)境脅迫對(duì)細(xì)胞的壓力。針對(duì)信號(hào)分子的調(diào)控作用, 本文綜述了不同的信號(hào)分子介導(dǎo)藻類類PCD的研究進(jìn)展。

1 ROS/H2O2

活性氧(Reactive oxygen species, ROS)是生物體內(nèi)正常有氧代謝的副產(chǎn)物, 在生物體的生長、脅迫適應(yīng)和PCD過程中起著重要作用。高濃度的ROS會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的氧化損傷, 而低濃度的ROS能作為信號(hào)分子誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡[15]。

此外, 在使用水生植物穗花狐尾藻分泌的次生代謝物多酚化感物質(zhì)焦性沒食子酸處理的原核藍(lán)藻Microcystis aeruginosa研究中, 也觀察到了胞內(nèi)ROS產(chǎn)生, ROS與核仁解體、光合片層破裂、核固縮、空泡形成、DNA斷裂化以及caspase-3-like酶活升高等類PCD的現(xiàn)象存在明顯相關(guān)性, 表明了ROS很可能介導(dǎo)了藍(lán)藻類PCD的發(fā)生[11]。當(dāng)M.aeruginosa細(xì)胞在受到鹽度, 物理損傷(例如超聲處理), 化學(xué)除草劑以及紫外線照射時(shí), 相對(duì)于對(duì)照,處理組檢測到H2O2濃度顯著增加。通過外源添加微摩爾濃度的H2O2可激活誘發(fā)M. aeruginosa細(xì)胞中類PCD發(fā)生的關(guān)鍵caspase-like酶, 但當(dāng)藻細(xì)胞與H2O2和過氧化氫酶一起溫育時(shí), caspase-like酶活卻被明顯抑制, 表明H2O2誘導(dǎo)并介導(dǎo)了藍(lán)藻M. aeruginosa類PCD的發(fā)生[19]。

盡管當(dāng)前大部分研究認(rèn)為ROS產(chǎn)生先于細(xì)胞死亡, 從而起到介導(dǎo)細(xì)胞的死亡的作用, 但也有研究認(rèn)為caspase-like酶更早的參與到細(xì)胞的死亡[20],而這還需要進(jìn)一步的證據(jù)證明。

2 NO

近年來, 一氧化氮(Nitric oxide, NO)作為細(xì)胞的一種重要信號(hào)分子受到了越來越多的關(guān)注[21]。NO是一種高活性的氣體自由基, 具有重要的生物學(xué)功能。大量的證據(jù)表明, 在多細(xì)胞生物中, NO 參與細(xì)胞抗逆性作用, 調(diào)節(jié)生長、發(fā)育過程, 被認(rèn)為是誘導(dǎo)PCD的非生物脅迫的重要參與者[22]。一些藻類研究中也發(fā)現(xiàn)藻細(xì)胞中的NO可以很好的反映藻細(xì)胞的生長狀態(tài), 可以為監(jiān)測水華和赤潮的發(fā)生及消亡機(jī)理提供新思路[23—25]。因?yàn)镹O能夠作為一種可擴(kuò)散的氣態(tài)分子在細(xì)胞間進(jìn)行傳遞, 并誘發(fā)藻細(xì)胞出現(xiàn)類PCD的現(xiàn)象[21,26,27]。

使用兩種不同的NO供體SNAP和SNP處理綠藻M. denticulata, 發(fā)現(xiàn)以上的處理能夠抑制M.denticulata細(xì)胞生長, 形態(tài)上表現(xiàn)出次生壁缺失、高爾基體功能受損等類PCD特征, 表明NO可能誘導(dǎo)類PCD的發(fā)生[28]。在綠藻Chlamydomonas reinhardtii細(xì)胞中, 黃蜂毒素誘導(dǎo)了NO的產(chǎn)生, 藻細(xì)胞生物量明顯降低, 同時(shí)藻細(xì)胞表現(xiàn)出核濃縮和細(xì)胞質(zhì)收縮等PCD的形態(tài)學(xué)特征, 而處理體系中添加NO清除劑cPTIO后, 藻細(xì)胞內(nèi)NO水平顯著降低, 藻細(xì)胞死亡率相應(yīng)降低, 表明NO介導(dǎo)藻細(xì)胞的類PCD過程[29]。還有研究發(fā)現(xiàn), 高劑量(2 mg/mL)的反式-2,4-癸二烯醛暴露誘導(dǎo)了海洋硅藻Phaeodactylum tricornutum胞內(nèi)NO產(chǎn)生, 并導(dǎo)致細(xì)胞密度顯著降低。然而, 用亞致死劑量(0.1 mg/mL)的這種醛預(yù)處理該藻細(xì)胞反而誘導(dǎo)了藻細(xì)胞對(duì)隨后致死劑量反式-2,4-癸二烯醛的抗性。這種現(xiàn)象可能與NO濃度有關(guān): 低濃度的NO有利于藻細(xì)胞的生長,而高濃度的NO則促進(jìn)藻細(xì)胞的死亡[26]。Vardi等[30]還發(fā)現(xiàn), 在反式-2,4-癸二烯醛暴露下, 硅藻P. tricornutum細(xì)胞編碼與NO合成相關(guān)蛋白的基因PtNOA1的表達(dá)水平上升。過量表達(dá)PtNOA1可引發(fā)藻細(xì)胞內(nèi)NO濃度升高, 導(dǎo)致質(zhì)體MnSOD表達(dá)被抑制、光合效率和生長速率下降、基因metacaspase表達(dá)量上升以及caspase-like活性增加等, 表明了NO在類程序性細(xì)胞死亡中的重要作用。在硅藻S. costatum中, 當(dāng)光系統(tǒng)Ⅱ和光系統(tǒng)Ⅰ之間的電子流被阻斷時(shí), 死亡特異性蛋白ScDSP-1高度表達(dá)。當(dāng)采用NO供體Diethylamine nitric oxide處理后, 也顯著誘導(dǎo)ScDSP-1表達(dá), 并且該誘導(dǎo)型表達(dá)可被NO清除劑抑制。此外, 若在光系統(tǒng)Ⅱ和光系統(tǒng)Ⅰ之間的電子流被阻斷前, 使用NO清除劑預(yù)處理藻細(xì)胞, ScDSP-1的表達(dá)被顯著降低。這些研究結(jié)果表明NO是指示ScDSP-1表達(dá)的關(guān)鍵第二信使[31]。由于ScDSP-1具有在藻細(xì)胞脅迫適應(yīng)與類PCD之間進(jìn)行切換的功能, 推測NO也是作為類PCD關(guān)鍵信號(hào)分子。熱應(yīng)激也會(huì)導(dǎo)致共生雙鞭毛藻Symbiodinium microadriaticum藻細(xì)胞死亡率上升, NO水平增加, caspase-3-like酶活性升高, 但運(yùn)用caspase-3特異性抑制劑可部分(65%)的抑制caspase-3-like酶活性的上升。此外, 如果在實(shí)驗(yàn)的處理組中補(bǔ)充NO供體SNP和NOC-18, 則可以顯著提高 caspase-3-like酶活性, 但若在添加不同的NO供體之前, 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)用caspase-3特異性抑制劑預(yù)處理藻細(xì)胞, 則可以完全阻止caspase-3-like酶活性的增加。這些研究結(jié)果表明NO可通過介導(dǎo) caspase 3-like活性的增加在細(xì)胞死亡中發(fā)揮作用[32]。

類似的現(xiàn)象在藍(lán)藻M. aeruginosa中也觀察到,在化感物質(zhì)N-苯基-1-萘胺暴露下, 藻細(xì)胞NO濃度顯著升高, caspase-3-like酶活性也顯著上升, 且單獨(dú)NO溶液或NO外源供體SNP處理均可以引起藻細(xì)胞的生長抑制[33]。另一項(xiàng)研究表明外源NO供體SNP誘導(dǎo)了藻細(xì)胞NO濃度的增加和caspase-3-like酶活性升高, 但并未檢測到ROS水平升高[34]。這些研究均表明了caspase-3-like酶活性升高與NO濃度有關(guān),NO水平的上升可加劇M. aeruginosa的類程序性細(xì)胞死亡。在共培養(yǎng)條件下, 穗花狐尾藻通過釋放次生代謝物化感物質(zhì)來抑制M. aeruginosa的細(xì)胞生長, 誘導(dǎo)藻細(xì)胞NO過量產(chǎn)生并上調(diào)caspase-3-like酶活性, 進(jìn)而引發(fā)藻細(xì)胞類PCD的發(fā)生[34]。上述結(jié)果進(jìn)一步表明NO在類PCD過程的重要作用。

3 Ca2+

Ca2+是細(xì)胞中重要第二信使, 它的生物學(xué)功能非常多樣化, 包括了細(xì)胞周期、基因表達(dá)和細(xì)胞程序性死亡等。在高等動(dòng)植物細(xì)胞中, 處于一定濃度水平的ROS與NO可以調(diào)控細(xì)胞的死亡途徑包括PCD[35]。在正常情況下, 與大多數(shù)多細(xì)胞生物一樣,藻細(xì)胞的Ca2+水平非常低。但當(dāng)藻細(xì)胞遭受環(huán)境脅迫時(shí), 胞內(nèi)積累的高濃度游離Ca2+將會(huì)影響到藻細(xì)胞生長, 且不同的藻細(xì)胞受到的影響可能會(huì)不一樣。

在類PCD過程中, 藍(lán)藻細(xì)胞可能具有不同的Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在藍(lán)藻Anabaena中, 鹽脅迫(KCl或NaCl)誘導(dǎo)了藻細(xì)胞類PCD的發(fā)生, 藻細(xì)胞表現(xiàn)出PCD的特征, 包括質(zhì)膜完整性喪失, 細(xì)胞質(zhì)空泡化, 液泡中的蛋白酶活性增加, DNA含量降低,特異性DNA片段化, 細(xì)胞進(jìn)行解體, 破裂以及隨后的細(xì)胞自溶等, 但在實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中補(bǔ)充0.1 mol/L CaCl2的實(shí)驗(yàn)體系中, 活細(xì)胞數(shù)量顯著增加, DNA片段化的細(xì)胞數(shù)量顯著減少, 且樣品處理的時(shí)間越長,Ca2+拮抗鹽脅迫對(duì)細(xì)胞死亡的影響作用就越顯著。但若在這些實(shí)驗(yàn)中用Mg2+代替Ca2+時(shí), 并未觀察的類PCD現(xiàn)象。這些結(jié)果表明, Ca2+可以阻斷或減緩鹽脅迫誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡[36]。但也有研究發(fā)現(xiàn), Ca2+水平升高在啟動(dòng)藻細(xì)胞類PCD過程中起著關(guān)鍵性作用。例如在藍(lán)藻M. aeruginosa中, Ca2+引起藻細(xì)胞死亡的最低作用濃度為0.1 mol/L; 在Ca2+作用下,M. aeruginosa細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞內(nèi)含物有規(guī)律、有步驟的降解, 細(xì)胞徹底瓦解前只剩下類囊體搭建的細(xì)胞框架, 同時(shí), 在細(xì)胞死亡過程中還觀測到了DNA斷裂與caspase-3-like酶活性升高[37]。

在真核藻類中, Ca2+信號(hào)似乎也與類細(xì)胞程序性死亡的緊密相關(guān)。在綠藻C. reinhardtii中, 三氯生24h內(nèi)顯著誘導(dǎo)胞質(zhì)游離Ca2+水平上升, 這與細(xì)胞質(zhì)膜完整性喪失和去極化、線粒體膜去極化、caspase 3/7酶活性上升以及指示類PCD的metacaspase基因的表達(dá)增加等PCD特征的出現(xiàn)密切相關(guān),但外源添加的胞內(nèi)鈣離子螯合劑BAPTA-AM在較短時(shí)間內(nèi)(1h和4h)完全消除或是在24h后部分(30%)消除了這種胞質(zhì)游離Ca2+水平的升高, 并抑制了類PCD的發(fā)生, 表明Ca2+可能誘導(dǎo)了類PCD的發(fā)生[38]。在硅藻P. tricornutum中, 反式-2,4-癸二烯醛以劑量依賴的方式觸發(fā)了藻細(xì)胞Ca2+的釋放, 持續(xù)數(shù)分鐘后又恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。該醛引發(fā)藻細(xì)胞內(nèi)Ca2+瞬變和隨后的NO的產(chǎn)生, 進(jìn)一步導(dǎo)致了細(xì)胞死亡的發(fā)生, 表明NO參與調(diào)控類PCD過程[26]。

4 信號(hào)分子H2O2、NO和Ca2+間的級(jí)聯(lián)關(guān)系

所有上述研究結(jié)果表明了, H2O2/NO/Ca2+在觸發(fā)藻類細(xì)胞PCD的過程中起到關(guān)鍵信號(hào)分子的作用。前期研究表明ROS、NO和Ca2+可以單獨(dú)或者相互地在高等動(dòng)植物細(xì)胞死亡過程中發(fā)揮生物學(xué)作用, 然而到目前為止它們?nèi)唛g的關(guān)系仍然不明確, 但是研究結(jié)果證明它們之間具有十分復(fù)雜而靈活的關(guān)系[39—41]。與高等動(dòng)植物細(xì)胞一樣, 在藻類細(xì)胞受到環(huán)境脅迫時(shí), 一些藻類細(xì)胞中的ROS、NO和Ca2+也顯示出復(fù)雜的作用關(guān)系。

在高等植物細(xì)胞PCD研究體系中, 有研究發(fā)現(xiàn)位于H2O2/NO下游的Ca2+水平的變化[42—45], 但在藻類細(xì)胞中, 研究發(fā)現(xiàn)Ca2+可以位于H2O2/NO上游。例如三氯生在綠藻C. reinhardtii細(xì)胞中促進(jìn)了ROS的大量產(chǎn)生, 包括超氧陰離子和H2O2, 但在用胞內(nèi)鈣螯合劑BAPTA-AM預(yù)處理時(shí)卻可顯著減少ROS含量, 表明Ca2+在由三氯生誘導(dǎo)的藻細(xì)胞內(nèi)ROS過量產(chǎn)生中起作用。通過使用胞質(zhì)游離Ca2+螯合劑BAPTA-AM和抗氧化劑NAC, 發(fā)現(xiàn)ROS產(chǎn)生和胞質(zhì)游離Ca2+水平增加之間存在相互聯(lián)系。由于BAPTA-AM的作用較大且明顯抑制了三氯生誘導(dǎo)的ROS, 因此推測三氯生首先上調(diào)了藻細(xì)胞胞質(zhì)游離Ca2+水平, 隨后激活了ROS的產(chǎn)生。但是, 由于NAC在一定程度上也抑制了胞質(zhì)游離Ca2+水平的升高, 表明了ROS的產(chǎn)生可能進(jìn)一步增加了藻細(xì)胞中的Ca2+水平[38]。與機(jī)械損傷后的D. vermicularis細(xì)胞對(duì)比, 將機(jī)械損傷之前的D. vermicularis細(xì)胞與Ca2+離子載體A23187一起溫育, A23187能夠?qū)2O2水平提高35%, 而在與100 μmol/L 鈣離子通道阻斷劑methoxyverapamil一起溫育下, H2O2水平降低了20%。這說明Ca2+與H2O2存在著強(qiáng)烈的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用, H2O2濃度的增加依賴于Ca2+水平的升高[46]。在海洋硅藻P. tricornutum中, 反式-2,4-癸二烯可顯著誘導(dǎo)鈣離子依賴性一氧化氮合成酶活性上升, 這一結(jié)果表明NO可能在信號(hào)級(jí)聯(lián)中位于Ca2+下游; 如果在P. tricornutum中添加可提高Ca2+濃度的試劑(如nifedipine), 硅藻細(xì)胞NO濃度也表現(xiàn)出升高趨勢, 同時(shí)藻細(xì)胞死亡率提高, 但是, 如果將NO供體DEANO和SNP添加到藻細(xì)胞中, 不論是短期或長期處理均未導(dǎo)致藻細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加, 進(jìn)一步證實(shí)NO位于Ca2+下游[26]。

對(duì)于環(huán)境脅迫下藻細(xì)胞內(nèi)H2O2產(chǎn)生先于NO,或是NO位于H2O2上游, 目前仍然存在著分歧。在機(jī)械損傷的海洋綠藻D. vermicularis中, 檢測到H2O2和NO的產(chǎn)生, 且NO的產(chǎn)生早于H2O2產(chǎn)生(分別為25min和45min)[46]。對(duì)綠藻C. vulgaris的研究發(fā)現(xiàn), 除草劑阿特拉津在誘導(dǎo)其藻細(xì)胞死亡的過程中, 不同程度促進(jìn)了H2O2和NO的生成, 通過觀察NO和H2O2到達(dá)峰值的時(shí)間(分別為14min和6min),推測NO位于H2O2的下游[47]。

目前藻類細(xì)胞中信號(hào)分子間的級(jí)聯(lián)關(guān)系的系統(tǒng)性研究很少。在海洋綠藻Ulva compressa中, 亞致死劑量銅誘導(dǎo)的H2O2、NO和Ca2+水平升高, 并且H2O2、NO和Ca2+三者之間存在相互作用: Ca2+可以激發(fā)H2O2和NO的合成, H2O2和NO水平升高也可以導(dǎo)致Ca2+釋放的增加; H2O2可以激活NO合成, 但NO的合成卻并未導(dǎo)致H2O2濃度的變化[48]。信號(hào)分子在不同的藻細(xì)胞中可能具有不同的級(jí)聯(lián)關(guān)系, 這些信號(hào)分子之間如何合作或獨(dú)立地調(diào)控藻細(xì)胞生理活性, 還需要繼續(xù)開展更多的系統(tǒng)性研究。

5 展望

在一般情況下, 水生態(tài)系統(tǒng)的藻類群落處于一個(gè)相對(duì)平衡狀態(tài), 但是, 是什么因素誘發(fā)了平衡迅速的打破, 導(dǎo)致水華的快速爆發(fā)或水華消退？這是值得思考的問題, 或許信號(hào)分子在此過程中起著重要的作用。針對(duì)信號(hào)分子在藻細(xì)胞PCD過程中尚待揭示的機(jī)制, 建議開展以下方面工作:

(1)目前許多研究主要是通過外源供體和抑制和/或清除劑來驗(yàn)證信號(hào)分子介導(dǎo)藻類PCD過程的作用, 但由于信號(hào)分子與caspase-like酶上升間隔時(shí)間短, 難以區(qū)分先后, 故ROS/NO/Ca2+是否直接作為信號(hào)分子觸發(fā)藻細(xì)胞的PCD還需進(jìn)一步的證據(jù)。未來應(yīng)進(jìn)一步開展參與PCD過程相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的鑒定與表達(dá)研究。(2)不同來源途徑的信號(hào)分子的研究必將大大的促進(jìn)信號(hào)分子是如何作用于藻類PCD的研究。不同來源途徑的信號(hào)分子在藻類中是如何協(xié)作、哪些途徑在特定的位置或者特定的時(shí)間起作用, 這些均應(yīng)是未來重點(diǎn)研究的方向。(3)由于信號(hào)分子在藻類生命活動(dòng)過程中具有重要的作用, 但這取決于其在細(xì)胞中的濃度。因此,定量信號(hào)分子的胞內(nèi)濃度對(duì)探索信號(hào)分子的生理作用具有重要意義。但高精度的測定藻類細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子的絕對(duì)濃度的技術(shù)還有待研發(fā), 這對(duì)于認(rèn)識(shí)藻類細(xì)胞PCD過程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有重要意義。(4)在環(huán)境脅迫條件下, 藻類細(xì)胞PCD過程中的信號(hào)分子間級(jí)聯(lián)關(guān)系研究較少, 研究也缺乏系統(tǒng)性。加強(qiáng)對(duì)藻類特別是單細(xì)胞藻類環(huán)境脅迫下信號(hào)分子的系統(tǒng)研究, 對(duì)揭示藻類消亡和種群演替具有深遠(yuǎn)的意義, 也將為人工預(yù)防和控制水華藻類提供新的思路。