吳軒 ，曾葭儀，修光利 ,

1. 上海市環(huán)境保護(hù)化學(xué)污染物環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)管理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華東理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，上海 200237；2. 國(guó)家環(huán)境保護(hù)化工過(guò)程環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華東理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，上海 200237；3. 上海污染控制與生態(tài)安全研究院，上海 200092；4. 華東師范大學(xué)第二附屬中學(xué)，上海 200241

柴油機(jī)具有高能效、高熱效率、低成本等優(yōu)點(diǎn)，在重型卡車、工程機(jī)械、船舶等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。根據(jù)生態(tài)環(huán)境部發(fā)布的《2018年中國(guó)機(jī)動(dòng)車環(huán)境管理年報(bào)》，2017年全國(guó)柴油車保有量1956.7萬(wàn)輛，占汽車保有量的9.4%，雖然保有量低于汽油車，但其氮氧化物和顆粒物排放量分別占機(jī)動(dòng)車總排放量的70%和90%以上。2012年國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）將柴油機(jī)尾氣確定為人類致癌物（Kurt，2012）。柴油機(jī)尾氣顆粒（diesel exhaust particles，DEP）是由柴油不完全燃燒產(chǎn)生的，70%的粒徑小于0.3 μm，屬于典型的細(xì)顆粒物，對(duì)室外空氣PM2.5有重要貢獻(xiàn)。柴油機(jī)尾氣顆粒（DEP）由碳核和被其表面吸附的各種物質(zhì)如可溶性有機(jī)物（Soluble Organic Fraction，SOF）、重金屬、硫酸鹽等組成，其中90%的可溶性有機(jī)物都具有致癌、致畸、致突變性（劉樹(shù)模等，2007），對(duì)人類身體健康危害極大。DEP能長(zhǎng)時(shí)間在大氣環(huán)境中懸浮，且排放源距人類較近，可通過(guò)呼吸作用進(jìn)入人類呼吸道及肺部并沉積，造成肺部炎癥反應(yīng)（Sundeep et al.，1999）。除了肺部急性炎癥外，也有研究表明柴油機(jī)尾氣顆粒（DEP）與很多疾病密切相關(guān)，如神經(jīng)學(xué)效應(yīng)（Shannon，2011）、呼吸系統(tǒng)疾病（Ristovski et al.，2012；Inoue et al.，2007）、心血管系統(tǒng)疾?。⊿uleimani et al.，2017）及生殖健康及子代發(fā)育的影響等（Chunmei et al.，2009；方芳等，2008）。

秀麗隱桿線蟲(chóng)（Caenorhabditis elegans）作為模式生物已被廣泛應(yīng)用于水體（王曉祎等，2009），土壤（Hoss et al.，2009）和大氣（王云彪等，2012）等環(huán)境介質(zhì)毒理安全性評(píng)價(jià)。秀麗隱桿線蟲(chóng)體長(zhǎng)約1 mm，呈透明狀，其繁殖率高，壽命相對(duì)較短，僅3周左右，實(shí)驗(yàn)周期短，實(shí)驗(yàn)成本低，并且線蟲(chóng)的基因組已被完全測(cè)序，就人類基因組而言同源性可高達(dá) 60%—80%（Mano et al.，2007；Corsi，2006），是分子生物學(xué)中非常重要的工具（Brenner，1974；Chen et al.，2013），為化學(xué)品毒性效應(yīng)研究提供了一個(gè)有效的評(píng)價(jià)載體。如今秀麗隱桿線蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)行為、生長(zhǎng)發(fā)育、生殖水平、壽命子代數(shù)目、基因表達(dá)、ROS水平等指標(biāo)已被廣泛運(yùn)用于如殺蟲(chóng)劑等內(nèi)分泌干擾物（Zhou et al.，2016；何雪珠等，2018；金司儀等，2018）、重金屬、納米材料（Hongbo et al.，2009；Meyer et al.，2010；Khare et al.，2011）和有機(jī)農(nóng)藥（Dengg et al.，2004）的生態(tài)毒理學(xué)評(píng)估。

近年來(lái)已有研究（張文靜等，2019）基于秀麗隱桿線蟲(chóng)對(duì) PM2.5進(jìn)行有效的快速風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，通過(guò)模式生物秀麗隱桿線蟲(chóng)的應(yīng)激響應(yīng)，發(fā)現(xiàn) PM2.5可能對(duì)人體行為、免疫及生殖等方面都有不同程度的影響。而作為 PM2.5的重要組分，柴油機(jī)尾氣顆粒能否影響機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力及生長(zhǎng)發(fā)育尚不明確，且缺乏其對(duì)機(jī)體生化指標(biāo)影響的報(bào)道。研究報(bào)道環(huán)境空氣中 DEP 的濃度范圍為 10—5570 μg·m-3（Ghio et al.，2012），人群接觸DEP往往是長(zhǎng)期且微量的，現(xiàn)有研究?jī)H局限于高濃度短期急性暴露下 DEP的毒性，仍缺乏對(duì)其環(huán)境濃度下慢性毒性效應(yīng)的探究。本文通過(guò)監(jiān)測(cè)低濃度柴油機(jī)尾氣顆粒（DEP）慢性（10 d）暴露下線蟲(chóng)的生理指標(biāo)和生化指標(biāo)，如頭部擺動(dòng)頻率、體長(zhǎng)、體寬、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡水平和脂褐素水平來(lái)探討柴油尾氣顆粒影響下線蟲(chóng)的生理行為響應(yīng)，從而進(jìn)行柴油尾氣顆粒的毒性效應(yīng)評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑及儀器

試劑藥品：SRM2975標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院），N2秀麗隱桿線蟲(chóng)（野生型），2, 7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（H2DCF-DA，純度≥97%，阿拉丁試劑上海有限公司），吖啶橙（C17H19N3，純度≥99%，阿拉丁試劑上海有限公司），大腸桿菌菌株（E.coli OP50），瓊脂（西班牙 BIOWEST 公司），酵母蛋白胨（英國(guó)OXOID公司），膽固醇、二甲基亞砜、無(wú)水乙醇、氯化鈉、氯化鉀、次氯酸鈉、無(wú)水氯化鈣、無(wú)水硫酸鎂等化學(xué)藥品均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

儀器設(shè)備：SZM45B1型體視顯微鏡（舜宇光學(xué)科技（集團(tuán)）有限公司），Nikon Eclipse 80i熒光顯微鏡（尼康儀器（上海）有限公司），生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），VD-650型桌上式潔凈工作臺(tái)（浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司），LDZM立式高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）。

1.2 線蟲(chóng)培養(yǎng)與同步化

用移液槍吸取2 mL無(wú)菌K-medium從NGM培養(yǎng)基表面沖洗大量處于產(chǎn)卵期的秀麗隱桿線蟲(chóng)[雌雄同體株，美國(guó)線蟲(chóng)遺傳中心(CGC)]，轉(zhuǎn)移至離心管于3000 r·min-1下離心2 min，棄去上清液后加入1 mL新鮮配制的裂解液（NaOH 1 g，NaClO 1 mL，K-medium 14 mL），上下振蕩搖勻，裂解3 min后于3000 r·min-1下離心2 min，棄去上清液，用無(wú)菌的K-medium反復(fù)清洗底部沉淀3次，充分洗去裂解液成分。將裂解得到的蟲(chóng)卵轉(zhuǎn)移到涂有 E. coli OP50的NGM培養(yǎng)基上，放置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱下孵化并培養(yǎng)48 h，得到同步化的L4期幼蟲(chóng)。

1.3 DEP的表征方法

利用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察柴油機(jī)尾氣顆粒物（DEP）粉末狀態(tài)時(shí)的表面形態(tài)。用非常窄的電子束來(lái)回掃描樣品，并且通過(guò)樣品和電子束的互相作用，從而形成各種效應(yīng)，主要為樣品的二次電子發(fā)射效應(yīng)。

1.4 染毒液配制及染毒方法

由于柴油尾氣顆粒SRM2975顆粒難溶于水，故選用二甲基亞砜（DMSO）作為SRM2975顆粒的助溶劑，稱取0.01 g SRM2975顆粒于100 mL容量瓶，以DMSO定容，配制成濃度為100 mg·L-1的染毒母液。為保證空白對(duì)照組和暴毒組的DMSO濃度保持一致，接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)濃度采用等梯度稀釋法實(shí)現(xiàn)，最終的DMSO質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%。根據(jù)環(huán)境中DEP的質(zhì)量濃度范圍，以0.1 mg·L-1為染毒濃度范圍的中值，向低劑量組和高劑量組延伸，設(shè)置染毒液質(zhì)量濃度分別為 0（對(duì)照）、0.001、0.01、0.1、1 mg·L-1。

暴毒實(shí)驗(yàn)使用6孔培養(yǎng)板，每孔加入上述同步化培養(yǎng)到L4期的秀麗隱桿線幼蟲(chóng)及10 mL不同濃度的染毒液，放置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱染毒10 d，每隔24 h更換染毒液并加入100 μL E. coli OP50。暴毒結(jié)束后收集 6孔培養(yǎng)板內(nèi)的線蟲(chóng)，用無(wú)菌K-medium清洗3次用于后續(xù)指標(biāo)測(cè)定。

1.5 DEP在秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)的分布情況

暴毒結(jié)束后，向經(jīng)不同濃度組暴毒后并清洗完畢的線蟲(chóng)中加入 100 μL 60 μmol·L-1的左旋咪唑溶液，待麻醉1 min后用移液槍吸取適量線蟲(chóng)至NGM固體培養(yǎng)基上，在體視顯微鏡下觀察并拍攝線蟲(chóng)的身體形態(tài)。

1.6 秀麗隱桿線蟲(chóng)生理指標(biāo)的測(cè)定

1.6.1 頭部擺動(dòng)頻率測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的測(cè)定方法（Tsalik et al.，2003），將經(jīng)不同濃度組暴毒后并清洗完畢的線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至NGM固體培養(yǎng)基上，待其恢復(fù)1 min后，于體視顯微鏡下觀察并記錄其20 s內(nèi)頭部擺動(dòng)的次數(shù)（線蟲(chóng)頭部從一側(cè)擺到另一側(cè)再擺回此側(cè)），各濃度組至少記錄30條秀麗隱桿線蟲(chóng)。

1.6.2 體長(zhǎng)體寬測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的測(cè)定方法（周棟，2016），將經(jīng)不同濃度組暴毒后并清洗完畢的線蟲(chóng)置于 70 ℃水浴中45 min，燙死的線蟲(chóng)呈直線狀態(tài)，在體視顯微鏡下觀察拍照，結(jié)合顯微鏡微尺和圖像分析系統(tǒng)（ipwim 32軟件）處理記錄線蟲(chóng)身體的長(zhǎng)度和寬度，各濃度組至少記錄30條秀麗隱桿線蟲(chóng)。

1.7 秀麗隱桿線蟲(chóng)的生化指標(biāo)的測(cè)定

1.7.1 活性氧自由基測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的測(cè)定方法（周棟，2016），向經(jīng)不同濃度組暴毒后并清洗完畢的線蟲(chóng)中加入1 mL 2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（H2DCFDA），放置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)染色2 h，然后反復(fù)清洗3次去除熒光染劑成分。再加入 100 μL 60 μmol·L-1的左旋咪唑溶液，待麻醉1 min后用移液槍吸取適量線蟲(chóng)于瓊脂糖墊上，于Nikon Eclipse 80i型熒光顯微鏡下觀察每組線蟲(chóng)熒光并捕捉圖像，濾鏡選擇FITC。運(yùn)用 ImageJ軟件處理計(jì)算線蟲(chóng)的平均熒光強(qiáng)度值，反映線蟲(chóng)的 ROS水平，每個(gè)濃度組處理15條線蟲(chóng)。

1.7.2 脂褐素測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的測(cè)定方法（周棟，2016），向經(jīng)不同濃度組暴毒后并清洗完畢的線蟲(chóng)中加入100 μL 60 μmol·L-1的左旋咪唑溶液，待麻醉 1 min后用移液槍吸取適量線蟲(chóng)于瓊脂糖墊上，于Nikon Eclipse 80i型熒光顯微鏡下觀察每組線蟲(chóng)腸道的自發(fā)熒光并捕捉圖像，濾鏡選擇 UV-2A。運(yùn)用ImageJ軟件處理計(jì)算線蟲(chóng)腸道的平均熒光強(qiáng)度值，反映線蟲(chóng)體內(nèi)脂褐素積累水平，每個(gè)濃度組處理15條線蟲(chóng)。

1.7.3 細(xì)胞凋亡測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的測(cè)定方法（周棟，2016），向經(jīng)不同濃度組暴毒后并清洗完畢的線蟲(chóng)中加入 1 mL 吖啶橙溶液（25 μg·mL-1），放置于 20 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)染色2 h，然后反復(fù)清洗3次去除吖啶橙成分。再加入 100 μL 60 μmol·L-1的左旋咪唑溶液，待麻醉1 min后用移液槍吸取適量線蟲(chóng)于瓊脂糖墊上，于Nikon Eclipse 80i型熒光顯微鏡下觀察每組線蟲(chóng)熒光并捕捉圖像，濾鏡選擇FITC。運(yùn)用 ImageJ軟件處理計(jì)算線蟲(chóng)的平均熒光強(qiáng)度值，反映線蟲(chóng)的細(xì)胞凋亡水平，每個(gè)濃度組處理15條線蟲(chóng)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，多組比較采用方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析（One-way ANOVA）中的事后多重比較Dunnett test，所有數(shù)據(jù)均以Mean±SEM的形式表示，P＜0.05認(rèn)為差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DEP的組分及表征

由于采樣獲取的柴油機(jī)尾氣顆粒（DEP）來(lái)源具有不穩(wěn)定性，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的影響，本研究中使用標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)進(jìn)行分析。SRM2975是柴油機(jī)尾氣顆粒的標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)，購(gòu)自美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院，是從專為柴油動(dòng)力叉車設(shè)計(jì)的過(guò)濾系統(tǒng)中收集的，其具體組分見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)說(shuō)明書(shū)。

利用掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)柴油尾氣顆粒進(jìn)行形貌表征。柴油尾氣顆粒（SRM2975）的檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，SRM2975主要以灰黑色存在，結(jié)構(gòu)近似球形，表面呈現(xiàn)疏松多孔的形貌，易吸附可溶性有機(jī)物、重金屬及硫酸鹽等有毒有害物質(zhì)。

圖1 不同放大尺寸SRM2975的掃描電鏡圖Fig. 1 Representative scanning electron micrographs of SRM2975

2.2 DEP在線蟲(chóng)體內(nèi)的分布

DEP慢性暴毒后顆粒物在線蟲(chóng)體內(nèi)的分布情況如圖2B所示，與對(duì)照組比較，經(jīng)過(guò)高濃度（1 mg·L-1）染毒液10 d的慢性暴毒后，線蟲(chóng)的咽部和腸道可以明顯觀察到DEP的累積，而低、中濃度組（0.001、0.01、0.1 mg·L-1）的線蟲(chóng)體內(nèi)均未觀察到DEP的明顯分布。通過(guò)圖2A觀察到，經(jīng)過(guò)亞急性（72 h）暴毒后，DEP在線蟲(chóng)體內(nèi)也存在累積情況，主要分布在腸道后部，與慢性暴毒結(jié)果相比不明顯。

圖2 柴油機(jī)尾氣顆粒在秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)的分布情況Fig. 2 Distribution of diesel exhaust particles in C. eleganse

2.3 DEP對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)生理指標(biāo)的影響

2.3.1 DEP對(duì)線蟲(chóng)頭部擺動(dòng)頻率的影響

DEP慢性暴毒對(duì)線蟲(chóng)頭部擺動(dòng)頻率的影響如圖3所示，經(jīng)DEP染毒液10 d的慢性暴毒后，與對(duì)照組相比，最高濃度組（1 mg·L-1）的線蟲(chóng)頭部擺動(dòng)頻率明顯降低 18.8%，有極顯著性差異（P＜0.01），說(shuō)明DEP對(duì)線蟲(chóng)有神經(jīng)系統(tǒng)毒害。而低、中濃度組（0.001、0.01、0.1 mg·L-1）對(duì)其頭部擺動(dòng)頻率影響不大，與對(duì)照組相比有小幅度上升，不具有顯著性差異。

圖3 DEP對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)頭部擺動(dòng)頻率（F）的影響Fig. 3 The effects of DEP on the head swing frequency(F) of C. elegans

2.3.2 DEP對(duì)線蟲(chóng)體長(zhǎng)體寬的影響

DEP慢性暴毒對(duì)線蟲(chóng)體長(zhǎng)體寬的影響如圖4所示，經(jīng)DEP染毒液10 d的慢性暴毒后，最高濃度組（1 mg·L-1）的線蟲(chóng)平均體長(zhǎng)為548.1 μm，平均體寬為23.0 μm，與對(duì)照組平均體長(zhǎng)621.3 μm和體寬25.1 μm相比分別明顯降低了11.8%和8.5%，有極顯著性差異（P＜0.01）。而低、中濃度組（0.001、0.01、0.1 mg·L-1）處理后線蟲(chóng)的平均體長(zhǎng)分別為690.7、658.9、630.2 μm，平均體寬分別為 27.7、27.5、26.5 μm，與對(duì)照組相比體長(zhǎng)分別上升11.1%、6.0%和1.5%，體寬分別上升10.4%、9.6%和 5.6%，有顯著性差異（P＜0.05）。

圖4 DEP對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)體長(zhǎng)（L）和體寬（W）的影響Fig. 4 The effects of DEP on the body length (L) and width (W) of C. elegans

2.4 DEP對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)生化指標(biāo)的影響

2.4.1 DEP對(duì)線蟲(chóng)活性氧自由基水平的影響

DEP慢性暴毒對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)活性氧自由基水平的影響如圖5所示，經(jīng)DEP染毒液10 d的慢性暴毒后，與對(duì)照組相比，高濃度組（1 mg·L-1）的線蟲(chóng)體內(nèi) ROS水平升高了 10.2%，中濃度組（0.1 mg·L-1）的線蟲(chóng)ROS水平下降了14.1%，具有顯著性差異（P＜0.05）。

2.4.2 DEP對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)脂褐素的影響

DEP慢性暴毒對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)脂褐素水平的影響如圖5所示，經(jīng)DEP染毒液10 d的慢性暴毒后，與對(duì)照組相比，高濃度組（1 mg·L-1）及中濃度組（0.1 mg·L-1）的線蟲(chóng)的腸道自發(fā)熒光分別增加了6.2%和11.4%，具有顯著性差異（P＜0.05）。

2.4.3 DEP對(duì)線蟲(chóng)細(xì)胞凋亡水平的影響

DEP慢性暴毒對(duì)線蟲(chóng)細(xì)胞凋亡水平的影響如圖5所示，經(jīng)DEP染毒液10 d的慢性暴毒后，與對(duì)照組相比，高濃度組（1 mg·L-1）的線蟲(chóng)細(xì)胞凋亡水平上升 1.8%，無(wú)顯著性變化，中濃度組（0.1 mg·L-1）下降了 4.4%，具有顯著性差異（P＜0.05）。

3 討論

本研究利用秀麗隱桿線蟲(chóng)探究了柴油尾氣顆粒物（DEP）對(duì)生物體的慢性毒性效應(yīng)。通過(guò)體視顯微鏡觀察到在經(jīng)高濃度（1 mg·L-1）染毒液10 d的慢性暴毒后，DEP主要分布在線蟲(chóng)的咽部和腸道中，但在低、中濃度組的線蟲(chóng)體內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明顯的DEP生物富集現(xiàn)象。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，外源物質(zhì)通過(guò)攝食行為進(jìn)入線蟲(chóng)體內(nèi)，經(jīng)消化道至排出，停留時(shí)間一般不超過(guò)6 s。因此初步認(rèn)定線蟲(chóng)通過(guò)攝食行為將DEP一同攝入體內(nèi)，在低濃度條件下以及亞急性暴露后，吞食的DEP通過(guò)排泄行為及時(shí)排出體內(nèi)，而在高濃度慢性暴露條件下，攝入顆粒過(guò)多，超過(guò)體內(nèi)的自凈能力，以致DEP無(wú)法正常代謝排出，堆積在咽部和腸道。有研究發(fā)現(xiàn)粒徑較大的 GO納米顆粒主要分布在線蟲(chóng)的咽部和腸道，而顆粒較小的GODs納米顆粒（10—20 nm）分布在線蟲(chóng)的全身器官（李平，2017）。本實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn) DEP在除咽部和腸道外的其他器官有富集，可能是因?yàn)镈EP顆粒大小在20—50 nm之間，無(wú)法穿過(guò)腸部屏障進(jìn)入其他部位。此外，DEP也可能很難通過(guò)角質(zhì)層及陰戶等其他方式進(jìn)入線蟲(chóng)體內(nèi)。因此，認(rèn)為DEP主要是通過(guò)線蟲(chóng)的攝食行為進(jìn)入其咽部和腸道，并在體內(nèi)富集，具有產(chǎn)生毒性效應(yīng)的潛力。

頭部擺動(dòng)頻率是反映線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)行為的基本指標(biāo)，而線蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)行為與其神經(jīng)系統(tǒng)基本功能息息相關(guān)，有研究提出秀麗隱桿線蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)行為可以作為秀麗線蟲(chóng)神經(jīng)毒性效應(yīng)的量化指標(biāo)（Anderson et al.，2004）。線蟲(chóng)的神經(jīng)元可按功能分為三類：感覺(jué)神經(jīng)元、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元以及中間神經(jīng)元，其中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分別控制不同部位，如頭部、身體的肌肉細(xì)胞，感覺(jué)神經(jīng)元將外界刺激轉(zhuǎn)化為神經(jīng)沖動(dòng)后依次傳遞，在信號(hào)蛋白的協(xié)助下形成突觸，進(jìn)一步發(fā)揮運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能（Loria et al.，2004）。本實(shí)驗(yàn)中高劑量組的DEP對(duì)線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)行為的影響可能由于DEP被攝入體內(nèi)，刺激干擾信號(hào)蛋白的正常合成與代謝，進(jìn)而導(dǎo)致突觸功能與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能無(wú)法正常發(fā)揮。而低中濃度組出現(xiàn)的線蟲(chóng)頭部擺動(dòng)頻率變化不大甚至小幅度上升的現(xiàn)象可能是微量DEP進(jìn)入線蟲(chóng)體內(nèi)，小幅度刺激其進(jìn)行覓食等行為，從而導(dǎo)致頭部擺動(dòng)頻率小幅度升高。本結(jié)果提示秀麗隱桿線蟲(chóng)長(zhǎng)期接觸DEP可能造成一定的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)損害。

圖5 DEP慢性暴露對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)生化指標(biāo)的影響及其代表性熒光圖片F(xiàn)ig. 5 The effect of DEP chronic exposure on the bichemical indicators and its representative fluorescent pictures

體長(zhǎng)和體寬是衡量線蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育情況的重要指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DEP會(huì)降低線蟲(chóng)的個(gè)體發(fā)育速率，對(duì)其具有生長(zhǎng)發(fā)育毒性。結(jié)合不同劑量的DEP在線蟲(chóng)體內(nèi)的分布情況分析，低、中濃度條件下（0.001、0.01、0.1 mg·L-1）未觀察到 DEP在線蟲(chóng)體內(nèi)的累積，微量DEP進(jìn)入線蟲(chóng)體內(nèi)可能會(huì)對(duì)其產(chǎn)生刺激，加速其覓食行為，食物攝取量較對(duì)照組增大，從而導(dǎo)致其體長(zhǎng)、體寬高于對(duì)照組，生長(zhǎng)發(fā)育優(yōu)于對(duì)照組。而高濃度條件下（1 mg·L-1）DEP顯著富集于咽部和腸道，不僅會(huì)影響線蟲(chóng)的攝食行為導(dǎo)致其食物攝取量變少，積累在腸道的顆粒還可能損害腸壁細(xì)胞，影響腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和貯存，降低線蟲(chóng)免疫力，導(dǎo)致線蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育緩慢。Wu et al.（2013）研究發(fā)現(xiàn)氧化石墨稀（Graphene oxide）納米顆粒對(duì)線蟲(chóng)腸細(xì)胞造成直接損傷，并能損害控制排泄行為的神經(jīng)元，導(dǎo)致線蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育緩慢及畸形。在基于其他受試生物如小鼠、斑馬魚(yú)等的 DEP毒性研究中也有相似的結(jié)論，如Hougaard et al.（2008）發(fā)現(xiàn)了DEP會(huì)導(dǎo)致小鼠的早期發(fā)育緩慢，體重變輕。Wang et al.（2019）以線蟲(chóng)為模式生物的研究也發(fā)現(xiàn)，100 mg·L-1DEP暴露72 h后線蟲(chóng)的體長(zhǎng)與對(duì)照組相比顯著下降，與本研究的結(jié)果一致。

活性氧自由基（ROS）是反映生物體是否受到氧化損傷的重要指標(biāo)。當(dāng)生物體受到外部刺激時(shí)，過(guò)量的 ROS會(huì)使生物體處于氧化應(yīng)激的狀態(tài)，對(duì)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及DNA等細(xì)胞大分子造成損害，是造成細(xì)胞凋亡和腸道衰老的重要因素。腸道的自發(fā)熒光強(qiáng)度代表著脂褐素溶酶體沉積物水平，是氧化損傷和細(xì)胞自噬的產(chǎn)物，可以反映線蟲(chóng)的衰老程度和體內(nèi)氧化損傷程度（Yu et al.，2016）。細(xì)胞凋亡是生物體為了適應(yīng)生存環(huán)境，受基因調(diào)控的細(xì)胞主動(dòng)爭(zhēng)取死亡的過(guò)程，具有重要的生物學(xué)意義和復(fù)雜的分子生物學(xué)機(jī)制（Vaux et al.，1999），能作為毒理檢測(cè)的早期預(yù)警指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中，低濃度組（0.1 mg·L-1）線蟲(chóng)體內(nèi)ROS水平和細(xì)胞凋亡水平較對(duì)照組均有所降低，而高濃度（1 mg·L-1）的DEP顯著提高了線蟲(chóng)體內(nèi)的 ROS水平和細(xì)胞凋亡水平。本研究中高濃度組線蟲(chóng)頭部擺動(dòng)頻率降低，生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制，與其體內(nèi) ROS水平及細(xì)胞凋亡程度密不可分。大量文獻(xiàn)表明，正常細(xì)胞的過(guò)早凋亡會(huì)對(duì)生物體的生理水平造成負(fù)面影響，本研究中線蟲(chóng)的生理指標(biāo)和生化指標(biāo)結(jié)果也具有相關(guān)性。1 mg·L-1的DEP使線蟲(chóng)體內(nèi)的脂褐素水平與對(duì)照組相比提高6.2%，而濃度為0.1 mg·L-1的DEP使線蟲(chóng)體內(nèi)的脂褐素水平提高了11.4%，表明DEP能夠誘導(dǎo)線蟲(chóng)腸道的衰老。Yu et al.（2011）研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)Al2O3-NPs慢性暴露后線蟲(chóng)腸道脂褐素的積累主要是由于ROS的大量產(chǎn)生，但在本研究中未發(fā)現(xiàn)ROS水平與脂褐素積累的明顯相關(guān)性，DEP誘導(dǎo)線蟲(chóng)腸道老化的機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

綜上所述，柴油尾氣顆粒物的長(zhǎng)期暴露會(huì)在秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)的富集，影響其運(yùn)動(dòng)行為、抑制其生長(zhǎng)發(fā)育，具有調(diào)控線蟲(chóng)體內(nèi)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的作用，并能誘導(dǎo)其腸道老化，具有毒性效應(yīng)。