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        跨膜型抗CD3單鏈抗體介導(dǎo)淋巴細(xì)胞體外特異性殺傷AFP陽性肝癌細(xì)胞活性觀察

        2020-02-21 03:51:26宋月雯袁向飛熊夢裳林芳珍盧楊熊冬生張硯君范冬梅張晴
        山東醫(yī)藥 2020年2期
        關(guān)鍵詞:肝癌

        宋月雯,袁向飛,熊夢裳,林芳珍,盧楊,熊冬生,張硯君,范冬梅,張晴

        1 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 血液病醫(yī)院 血液學(xué)研究所,天津 300020;2 國家兒童醫(yī)學(xué)中心 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院 北京市兒科研究所

        國內(nèi)肝癌發(fā)病率高且普遍發(fā)現(xiàn)較晚,中晚期患者居多。肝癌最主要的根治性手段是肝切除術(shù)和肝移植術(shù),但肝源匱缺是世界性難題,很多患者在等待肝源期間病情加重;此外,由于大部分肝癌患者對放化療不敏感,預(yù)后差且易復(fù)發(fā)[1]。腫瘤細(xì)胞抗原表達(dá)水平較低或表達(dá)缺陷時,主要組織相容性抗原(MHC)表達(dá)不足,不能被細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)識別并攻擊[2];而表面表達(dá)CD3單鏈抗體(CD3scfv)分子的細(xì)胞可繞過MHC的限制,直接激活淋巴細(xì)胞[3]?;罨牧馨图?xì)胞不僅對修飾后的腫瘤細(xì)胞起殺傷作用,對于未修飾腫瘤細(xì)胞也具有一定的細(xì)胞毒作用[4,5]。這提示我們可將CD3scfv分子修飾于免疫原性較弱的腫瘤細(xì)胞膜表面,繞過抗原表達(dá)及MHC分子限制等抗原局限問題,激活淋巴細(xì)胞進(jìn)而達(dá)到治療目的。本實驗室在前期研究中成功構(gòu)建人AFP啟動子(hAFPp)操控的跨膜型抗CD3單鏈抗體(antiCD3scfv),并在AFP陽性(AFP+)肝癌細(xì)胞中特異性表達(dá)[6]。2018年8月~2019年7月,基于以上理論及研究基礎(chǔ),本文將針對antiCD3scfv分子體外活性進(jìn)行研究,為肝癌免疫治療提供新思路。

        1 材料與方法

        1.1 材料 AFP+人肝癌細(xì)胞HepG2、Huh-7和AFP陰性(AFP-)正常人肝細(xì)胞HL-7702、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7均購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC),由本實驗室凍存。正常人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)分離自正常人富含血小板白膜,經(jīng)科研用血審批購自天津市血液中心,培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基,加入100 U/mL人IL-2刺激細(xì)胞生長。所有細(xì)胞置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng),DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、FBS均購自GIBCO公司。AdCD3scfv及空載AdTrack腺病毒為本實驗室前期構(gòu)建并鑒定。CytoToX96非放射性細(xì)胞毒檢測試劑購自Promega公司,F(xiàn)ITC直標(biāo)抗CD69、抗CD25單克隆抗體購自BD公司,免疫細(xì)胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ檢測試劑盒均購自eBioscience公司?;罴?xì)胞工作站購自Nikon公司,倒置顯微鏡購自O(shè)lympus公司。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 AdCD3scfv修飾的HepG2靶細(xì)胞與PBMC結(jié)合情況觀察 取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞,分別感染AdCD3scfv、AdTrack腺病毒(100 MOI)。將感染后的細(xì)胞接種至24孔培養(yǎng)板,每種細(xì)胞各接種2孔,共4孔。次日,按效靶比10∶1,向上述4孔各加5×105個PBMC(100 μL);同時各向每種細(xì)胞的其中一孔加入可溶性anti-CD3單克隆抗體25 ng/mL,另一孔加等體積PBS。靜置3 h后,移除未結(jié)合的游離PBMC。每孔各加入100 μL PBS,于顯微鏡目鏡(40×)下觀察并拍照。

        1.2.2 AdCD3scfv修飾的HepG2靶細(xì)胞與PBMC相互作用觀察 采用活細(xì)胞工作站動態(tài)觀察。取分別感染AdCD3scfv和AdTrack腺病毒的HepG2,接種至24孔培養(yǎng)板。次日,按效靶比10∶1向孔內(nèi)各加入5×105個PBMC(100 μL),用水平離心機(jī)1 000 r/min離心1 min,使PBMC快速沉于孔底。將24孔板實驗孔及對照孔置于活細(xì)胞工作站下,于488 nm通道及白光通道分別辨別靶細(xì)胞(GFP標(biāo)記)及效應(yīng)T細(xì)胞;選取合適的視野,動態(tài)觀察效靶細(xì)胞的相互作用。

        1.2.3 AdCD3scfv介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞毒性作用觀察 采用細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性試驗(LDH法)。取對數(shù)生長期的HepG2、Huh-7、HL-7702和MCF-7細(xì)胞,分別以AdCD3scfv(100 MOI)、AdTrack(100 MOI)及PBS感染各種靶細(xì)胞48 h。消化收集各組靶細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL,按照分析板設(shè)置鋪于相應(yīng)96孔培養(yǎng)板內(nèi)。以不同的效靶比,將PBMC細(xì)胞懸液加于相應(yīng)孔內(nèi)(200 μL/孔),其中靶細(xì)胞最大釋放、靶細(xì)胞自發(fā)釋放、培養(yǎng)基背景對照、培養(yǎng)基體積對照孔只加100 μL含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基。按照Promega CytoToX96非放射性細(xì)胞毒檢測試劑盒說明書操作,1 h內(nèi)于490 nm處測吸光度值,計算細(xì)胞死亡率。細(xì)胞死亡率=(實驗孔-靶細(xì)胞自發(fā)釋放-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放)吸光度值/(靶細(xì)胞最大釋放-靶細(xì)胞自發(fā)釋放)吸光度值×100%。

        1.2.4 AdCD3scfv介導(dǎo)的PBMC活化情況觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測共培養(yǎng)體系中PBMC表面活化標(biāo)志CD69及CD25。細(xì)胞類型及感染同1.2.3,感染48 h后鋪96孔培養(yǎng)板,以10∶1加入PBMC(200 μL)共培養(yǎng)24 h。收集PBMC并轉(zhuǎn)移至流式管,每種靶細(xì)胞均分為兩2管;PBS洗2次,加入100 μL PBS重懸細(xì)胞。分別加入5 μL FITC直標(biāo)CD69和FITC直標(biāo)CD25流式抗體,每管平行設(shè)同型對照管,避光室溫孵育30 min。PBS洗3次,孔徑50 μm尼龍網(wǎng)過濾;上流式細(xì)胞儀檢測,用FlowJo 7.6軟件分析CD69及CD25陽性T細(xì)胞比例。

        1.2.5 AdCD3scfv介導(dǎo)的免疫細(xì)胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ檢測 采用ELISA法。細(xì)胞感染、鋪板同1.2.4;與PBMC共培養(yǎng)24 h后,以250 g離心5 min,收集各孔上清,檢測IL-2、TNF-α、IFN-γ。

        2 結(jié)果

        2.1 AdCD3scfv修飾的HepG2靶細(xì)胞與PBMC結(jié)合情況 感染AdCD3scfv的HepG2細(xì)胞表面表達(dá)antiCD3scfv分子并與PBMC表面CD3分子結(jié)合,使PBMC聚集于HepG2細(xì)胞周圍;加入可溶性anti-CD3單克隆抗體后,與HepG2細(xì)胞膜表面修飾的antiCD3scfv分子競爭,PBMC聚集僅少量減少。加入anti-CD3單克隆抗體前后,感染AdTrack的HepG2細(xì)胞均不與PBMC結(jié)合。見圖1。

        注:souble mAb為可溶性anti-CD3抗體。

        圖1 AdCD3scfv修飾的HepG2靶細(xì)胞與PBMC結(jié)合情況。

        2.2 AdCD3scfv修飾的HepG2靶細(xì)胞與PBMC相互作用 共培養(yǎng)3 h后,PBMC開始向HepG2周圍聚集;共培養(yǎng)6 h后,部分HepG2細(xì)胞從視野消失;共培養(yǎng)15 h后,幾乎所有靶細(xì)胞都因細(xì)胞毒作用漂起或消失。見圖2。

        注:綠色熒光為AdCD3scfv修飾的HepG2細(xì)胞(靶細(xì)胞),白光為PBMC(效應(yīng)細(xì)胞)。

        圖2 AdCD3scfv修飾的HepG2靶細(xì)胞與PBMC相互作用

        2.3 PBMC對不同靶細(xì)胞的殺傷水平比較 與PBMC共培養(yǎng)12 h,感染AdCD3scfv病毒的AFP+細(xì)胞死亡率較感染AdTrack、PBS者增加(P均<0.05);且隨著效靶比增加,死亡率也不斷增強(qiáng);當(dāng)效靶比增加至10∶1時,HepG2、Huh-7細(xì)胞死亡率分別達(dá)到78.59%±7.50%、63.26%±6.21%;感染AdTrack、PBS的各類細(xì)胞死亡率均無明顯變化,且PBMC對AFP-細(xì)胞的殺傷作用極為有限。見圖3。

        注:Blank是指感染病毒時僅加PBS,不加病毒;與感染AdTrack、PBS的同類細(xì)胞比較,*P<0.05。

        圖3 不同效靶比例下PBMC對不同靶細(xì)胞的殺傷作用比較

        2.4 效靶細(xì)胞共培養(yǎng)體系中PBMC活化表面標(biāo)志分子CD69及CD25表達(dá)比較 PBMC與不同靶細(xì)胞以效靶比10∶1共培養(yǎng)24 h,感染AdCD3scfv的AFP+細(xì)胞HepG2、Huh-7中CD69、CD25表達(dá)增加(P均<0.05),感染AdTrack、PBS的各類細(xì)胞CD69及CD25表達(dá)無明顯變化。見圖4。

        注:Blank是指感染病毒時僅加PBS,不加病毒;與感染AdTrack、PBS的同類細(xì)胞比較,*P<0.05。

        圖4 效靶細(xì)胞共培養(yǎng)體系中PBMC表面活化標(biāo)志CD69及CD25的表達(dá)水平

        2.5 效靶細(xì)胞共培養(yǎng)體系中PBMC細(xì)胞因子分泌水平比較 PBMC與不同靶細(xì)胞以效靶比10∶1共培養(yǎng)24 h,感染AdCD3scfv的AFP+細(xì)胞HepG2、Huh-7上清液IL-2、IFN-γ、TNF-α水平增加(P均<0.05),而感染AdTrack、PBS的各類細(xì)胞IL-2、IFN-γ、TNF-α無明顯變化。見圖5。

        注:Blank是指感染病毒時僅加PBS,不加病毒;與感染AdTrack、PBS的同類細(xì)胞比較,*P<0.05。

        圖5 效靶細(xì)胞共培養(yǎng)體系中PBMC細(xì)胞因子分泌水平比較

        3 討論

        肝癌是第六位常見的惡性腫瘤,全球范圍內(nèi)每年新確診病例約85萬人[7],且有逐年遞增的趨勢。目前,首選治療方案為肝切除術(shù),術(shù)后5年生存率可達(dá)29%~81%,但復(fù)發(fā)率仍有51%~69%[8]。肝移植為肝癌根治手段之一,存在肝源缺乏的世界性難題,且其術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險不容忽視。近年來,針對肝癌的分子靶向藥、PD-1抑制劑及其他多種靶向治療研究倍受矚目,但療效都十分有限[9,10]。索拉非尼是FDA惟一批準(zhǔn)的用于治療肝癌的分子靶向藥[11],但患者的預(yù)后仍然很差,反應(yīng)率低于5%,總體生存僅延長約2.5個月[12]。除此之外,尚無確定有效的二線藥物。因此,開發(fā)針對肝癌這種惡性腫瘤的新療法具有非常重要的臨床意義,迫切需要尋找到一種有效殺傷肝腫瘤細(xì)胞的免疫治療方法。

        癌癥免疫治療的核心是腫瘤抗原,近年來利用人體適應(yīng)性免疫系統(tǒng),針對腫瘤抗原出現(xiàn)了過繼療法、腫瘤疫苗、抗體藥物等治療手段,但由于諸多因素,免疫治療在實體瘤中未達(dá)到理想效果[13]。已有研究表明,當(dāng)活化的淋巴細(xì)胞與靶細(xì)胞緊密接觸時,可實現(xiàn)CTL介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用[4]??笴D3單克隆抗體(anti-CD3 mAb)可通過Fc段橋聯(lián)與Fc受體陽性腫瘤細(xì)胞緊密結(jié)合,同時激活T細(xì)胞,實現(xiàn)裂解靶細(xì)胞的功能,但該方法僅適用于Fc受體表達(dá)陽性的腫瘤細(xì)胞[14]。此外,有學(xué)者設(shè)計antiCD3scfv使其在腫瘤細(xì)胞膜表面穩(wěn)定表達(dá),可實現(xiàn)CTL對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[5,15]。這種免疫細(xì)胞的激活是抗體直接作用于T細(xì)胞表面CD3分子,并向下游傳遞活化信號的結(jié)果。

        在前期的研究中,我們成功將antiCD3scfv基因構(gòu)建于Ad-5腺病毒載體中,并通過hAFPp啟動子限制其只在AFP+肝癌細(xì)胞膜表面表達(dá),為治療系統(tǒng)提供靶向性,減少對正常細(xì)胞的傷害[6]。接下來為證實antiCD3scfv分子的活性,我們將轉(zhuǎn)染AdCD3scfv病毒的靶細(xì)胞與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)。在活細(xì)胞工作站觀察到,淋巴細(xì)胞在3 h內(nèi)與靶細(xì)胞結(jié)合,并在15 h內(nèi)將視野內(nèi)靶細(xì)胞全部裂解。加入商品化可溶性anti-CD3單克隆抗體后,感染AdCD3scfv的細(xì)胞僅有部分PBMC聚集減少。這說明表達(dá)于細(xì)胞表面的antiCD3scfv分子具有更強(qiáng)的結(jié)合能力,可以將靶細(xì)胞與PBMC更緊密地連接,使后者活化并發(fā)揮細(xì)胞毒殺傷作用。隨后,我們用LDH法檢測細(xì)胞毒水平,發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞僅對表達(dá)antiCD3scfv分子的靶細(xì)胞表現(xiàn)殺傷作用,且隨著效靶比升高殺傷作用也越強(qiáng)。在效靶細(xì)胞共培養(yǎng)體系中,表達(dá)antiCD3scfv分子的AFP+靶細(xì)胞能活化效應(yīng)細(xì)胞,且其共培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ及TNF-α的分泌水平升高。以上研究結(jié)果均表明,antiCD3scfv蛋白具有一定的生物學(xué)功能:具有橋連作用,可直接將淋巴細(xì)胞與靶細(xì)胞緊密接觸;能激活淋巴細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒作用,高效殺傷腫瘤細(xì)胞;并且,再次證明hAFP啟動子調(diào)控antiCD3scfv分子的轉(zhuǎn)錄,使上述作用具有AFP肝癌特異性。

        綜上所述,本研究通過腺病毒實現(xiàn)在肝癌細(xì)胞表面修飾antiCD3scfv分子,可繞過表面抗原表達(dá)及MHC分子限制等局限問題,直接激活淋巴細(xì)胞,為實體瘤的免疫治療提供新思路。

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