萬淑梅，彭萍，高妍

中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，廣州510010

子癇前期(PE)又稱先兆子癇，是孕產(chǎn)婦和胎兒死亡的主要原因之一[1]。PE的病因目前尚未明確，但胎盤發(fā)育缺陷與之相關，而胎盤滋養(yǎng)層細胞增殖和入侵不足可導致胎盤發(fā)育異常和功能異常[2]。研究認為，增加胎盤滋養(yǎng)層細胞遷移和浸潤能力是治療PE的新策略[3]。因此，研究調(diào)控胎盤滋養(yǎng)層細胞遷移和浸潤能力的關鍵因素至關重要。微小核糖核酸(miRNA)是一類長度為18～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，在細胞生長、分化和運動等正常生理活動中發(fā)揮重要調(diào)控作用[4]。據(jù)文獻報道，miRNA的異常表達譜在PE患者的臍帶血、血清、胎盤組織和間充質(zhì)干細胞中均有發(fā)現(xiàn)[5]。腫瘤進展和胎盤發(fā)育過程有許多共同的特征，包括遷移和浸潤。miR-181a-5p是腫瘤相關抑制因子，參與肝細胞肝癌、非小細胞肺癌和膠質(zhì)瘤等的增殖、轉移等惡性生物學行為[6～8]，其對胎盤滋養(yǎng)層細胞遷移和浸潤能力的影響引起我們的關注。miRNA的調(diào)控機制是通過其靶基因發(fā)揮作用[9]，胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白(IGF2BP2)是一種癌基因，而Wnt/β-catenin是經(jīng)典的信號通路。2017年1月～2019年1月，我們分析了miR-181a-5p對IGF2BP2的調(diào)控作用，觀察其對胎盤滋養(yǎng)層細胞HTR-8/SVneo浸潤、遷移的影響及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 PrimeScriptTMRT Reagent Kit逆轉錄、SYBR Premix Ex TaqTMqRT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；miR-181a-5p、IGF2BP2、內(nèi)參U6和GAPDH引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成；HTR-8/SVneo細胞由加拿大皇后大學的Graham教授實驗室饋贈；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自美國Hyclone公司；miR-181a-5p mimic和過表達IGF2BP2質(zhì)粒購自廣州瑞博公司；6孔板和Transwell購于美國Coring公司。Wnt1、β-catenin抗體購自英國Abcam公司。

1.2 miR-181a-5p靶向調(diào)控IGF2BP2的生物信息學預測與驗證 用TargetScan7.1軟件(http://www.targetscan.org/)預測miR-181a-5p的靶基因，觀察miR-181a-5p與IGF2BP2的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)是否存在結合位點。以PCR將IGF2BP2野生型(wt)和突變型(mut)全長3′-UTR片段進行擴增后，插入到pGLO載體中構建pGLO-IGF2BP2-wt和pGLO-IGF2BP2-mut。將HTR-8/SVneo細胞以4×103/孔接種96孔板中，分為干預組和對照組，接種12 h后采用Lip2000分別同時轉染miR-181a-5p(空白對照NC)與野生型或突變型IGF2BP2 mRNA 3′UTR熒光素酶報告基因pGLO載體；轉染48 h后收集細胞，采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測熒光素酶報告基因活性。

1.3 胎盤組織中miR-181a-5p和IGF2BP2 mRNA檢測 采用qRT-PCR法。經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會同意后，收集在2015年10月～2016年12月入住我院婦產(chǎn)科行剖宮產(chǎn)分娩產(chǎn)婦的胎盤組織，其中PE患者和正常妊娠產(chǎn)婦各30例。受試者均簽署知情同意書，均為單胎妊娠，未患有全身性疾病。PE產(chǎn)婦年齡(31.12±2.02)歲，正常妊娠產(chǎn)婦年齡(30.12±3.24)歲，兩者基本資料具有可比性。將新鮮胎盤組織液氮冷凍后，加入TRIzol裂解液，提取組織總RNA。細胞系采用PBS洗滌3次后，加入TRIzol裂解液，提取細胞總RNA。設計合成引物：miR-181a-5p上游為5′-CCGCGAACATTCAACGCTGTCG -3′、下游為5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′，U6上游為5′- CAAATTCGTGAAGCGTTCCATAT-3′、下游為5′-GCTTCACGAATTTGCGTGTCATCCTTGC-3′；IGF2BP2上游為5′-AGTGGAATTGCATGGGAAAATCA-3′、下游為5′-CAACGGCGGTTTCTGTGTC-3′，GAPDH上游為5′-ATGGAAATCCCATCACCATCTT-3′、下游為5′-CGCCCCACTTGATTTTGG-3′。PrimeScriptTMRT Reagent Kit逆轉錄體系將總RNA逆轉錄為cDNA，并將其作為模板，95 ℃預變性5 s，95 ℃變性5 s、65 ℃退火30 s共40個循環(huán)。使用7500 real-time PCR檢測各樣品的循環(huán)閾值(Ct)，計算方法為2-ΔΔCt。以U6為內(nèi)參計算miR-181a-5p相對表達量，GAPDH為內(nèi)參計算IGF2BP2 mRNA相對表達量。

1.4 細胞培養(yǎng)與分組轉染 采用含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HTR-8/SVneo細胞，置于37 ℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；細胞融合度達90%以上時，按1∶3進行傳代。選處于對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的細胞消化計數(shù)，以1.5×105/孔接種6孔板，分為NC組、miR-181a-5p過表達組和miR-181a-5p+IGF2BP2過表達組。接種12 h后用Lip2000進行轉染，分別轉染無關序列、miR-181a-5p mimic、miR-181a-5p mimic+IGF2BP2過表達質(zhì)粒；置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h更換新鮮培養(yǎng)基。

1.5 細胞中IGF2BP2 mRNA檢測 取各組細胞，采用qRT-PCR法檢測IGF2BP2 mRNA，方法同1.3。

1.6 細胞浸潤能力觀察 采用Boyden實驗。將無血清培養(yǎng)基和BD基質(zhì)膠以10∶1的比例進行稀釋，取45 μL加入Transwell小室聚碳酸酯微孔膜上，置于37 ℃培養(yǎng)箱中備用。收集各組細胞，以細胞1×106/孔、100 μL無血清培養(yǎng)基接種于基質(zhì)膠上，下室加入500 μL含10% FBS的培養(yǎng)基。10 h后終止培養(yǎng)，以PBS將未穿過的上室細胞洗去；穿過的細胞經(jīng)甲醇固定，蘇木素染色，顯微鏡下計數(shù)細胞個數(shù)。

1.7 細胞遷移能力觀察 采用Transwell實驗。在Transwell小室中無需加基質(zhì)膠，將1×106個細胞直接接種于Transwell小室聚碳酸酯微孔膜上，細胞只需穿過膜上的微孔，其余步驟同Boyden實驗。

1.8 細胞中Wnt1、β-catenin蛋白表達檢測 采用Western blotting法。收集各組細胞，加入蛋白裂解液完全裂解細胞；4 ℃下12 000 r/min離心20 min，將上清液移至新的EP管中，并檢測蛋白濃度；煮沸變性后，各組加入相同質(zhì)量的蛋白上樣進行SDS-PAGE電泳；濕轉，5% BSA室溫封閉PVDF膜2 h；加入Wnt1和β-catenin一抗稀釋液4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，采用ECL化學發(fā)光法曝光蛋白條帶。

2 結果

2.1 miR-181a-5p靶向調(diào)控IGF2BP2的生物信息學預測與驗證結果 TargetScan7.1軟件在線預測顯示，IGF2BP2啟動子區(qū)存在miR-181a-5p的結合位點，見表1。雙熒光素酶報道基因試驗顯示，與對照組比較，干預組能降低野生型IGF2BP2 mRNA 3′UTR熒光素酶報告基因活性(P<0.05)，但對突變型IGF2BP2 mRNA 3′UTR熒光素酶報告基因活性無明顯影響(P>0.05)。見表2。

表1 miR-181a-5p與IGF2BP2 mRNA 3′UTR結合位點預測結果

表2 miR-181a-5p對IGF2BP2 mRNA 3′UTR熒光素酶報告基因活性的影響

注：與對照組同型別比較，*P<0.05。

2.2 胎盤組織中miR-181a-5p、IGF2BP2 mRNA表達水平及二者的相關性 PE胎盤組織中miR-181a-5p、IGF2BP2 mRNA表達量分別為0.64±0.36、1.49±0.61，正常妊娠婦女胎盤組織中分別為0.85±0.34、1.02±0.28，兩者miR-181a-5p、IGF2BP2 mRNA比較差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。Pearson分析結果顯示，在PE胎盤組織中miR-181a-5p與IGF2BP2 mRNA表達呈負相關(r=-0.601,P<0.05)。

2.3 各組胎盤滋養(yǎng)層細胞中GF2BP2 mRNA表達比較 與NC組(1.00±0.10)比較，miR-181a-5p 過表達組(0.18±0.07)和miR-181a-5p +IGF2BP2過表達組(0.38±0.02)細胞中IGF2BP2 mRNA表達均降低(P均<0.05)；與miR-181a-5過表達組比較，miR-181a-5p +IGF2BP2過表達組細胞中IGF2BP2 mRNA表達增加(P<0.05)。

2.4 各組胎盤滋養(yǎng)層細胞浸潤、遷移能力比較 與NC組比較，miR-181a-5p 過表達組和miR-181a-5p+IGF2BP2過表達組細胞浸潤、遷移的穿膜細胞數(shù)減少(P均<0.05)；與miR-181a-5過表達組比較，miR-181a-5p +IGF2BP2過表達組細胞浸潤、遷移的穿膜細胞數(shù)增多(P均<0.05)。見表3。

表3 各組胎盤滋養(yǎng)層細胞浸潤、遷移能力比較

注：與NC組比較，*P<0.05；與miR-181a-5p 過表達組比較，#P<0.05。

2.5 各組胎盤滋養(yǎng)層細胞Wnt/β-catenin信號通路水平比較 與NC組比較，miR-181a-5p 過表達組和miR-181a-5p+IGF2BP2過表達組細胞中Wnt1和β-catenin蛋白表達降低(P均<0.05)；與miR-181a-5p過表達組比較，miR-181a-5p+IGF2BP2過表達組細胞中Wnt1和β-catenin蛋白表達增加(P均<0.05)。見表4。

表4 各組胎盤滋養(yǎng)層細胞Wnt/β-catenin信號通路水平比較

注：與NC組比較，*P<0.05；與miR-181a-5p 過表達組比較，#P<0.05。

3 討論

正常的胎盤功能是影響妊娠的重要因素，維持胎盤功能最重要的是胚胎滋養(yǎng)層細胞。滋養(yǎng)層細胞處于胚胎和母體血管系統(tǒng)之間的界面，在正常妊娠中，滋養(yǎng)層細胞通過蛻膜和子宮肌層的遷移，浸潤至內(nèi)皮和中膜的母體螺旋動脈，即間質(zhì)和血管浸潤；遷移和浸潤是滋養(yǎng)細胞分化的主要途徑，而滋養(yǎng)層細胞浸潤不足或過度浸潤均可能導致子宮胎盤灌注壓降低和胎盤缺血/缺氧。缺血誘導的氧化應激同時引起胎盤的損傷和壞死以及胎盤因子釋放，導致內(nèi)皮功能障礙和全身性炎癥，促使PE的發(fā)生，威脅孕婦和胎兒的生命健康[10]。PE主要特征為高血壓和蛋白尿，并發(fā)肝、腎、腦和凝血系統(tǒng)等全身問題，妊娠20周后孕婦發(fā)生比例>30%[11]。因此，研究PE的發(fā)病機制、干預胚胎滋養(yǎng)層細胞的遷移和浸潤能力對維持正常妊娠具有重要意義。

miRNA屬于一類小的非編碼RNA，在轉錄后水平的基因表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用，miRNA廣泛表達于各類組織中[4]。胎盤發(fā)育中的許多細胞過程，包括滋養(yǎng)層分化、遷移、浸潤、增殖、凋亡、血管發(fā)生/血管生成和細胞代謝等均受到miRNA的調(diào)控[12]。miRNA表達異?？梢鸢ㄌケP發(fā)育異常等多種疾病的發(fā)生[13]。胎盤組織中越來越多異常表達的miRNA被發(fā)現(xiàn)，miR-181a-5p是與血液系統(tǒng)中血管內(nèi)皮細胞和淋巴細胞發(fā)生及分化相關的miRNA[14]。然而，miR-181a-5p也是與腫瘤惡性生物學行為密切相關的miRNA之一，其在肝細胞肝癌、非小細胞肺癌和膠質(zhì)瘤等腫瘤組織中表達下調(diào)，并抑制腫瘤增殖和侵襲[6～8]。Huang等[15]報道，miR-181a-5p在PE胎盤組織中表達上調(diào)，并能引發(fā)抗細胞增殖和抑制細胞周期進程，誘導細胞凋亡，抑制細胞侵襲。胎盤發(fā)育和腫瘤進展有許多共同的特征，miR-181a-5p在腫瘤疾病和胚胎發(fā)育障礙中發(fā)揮的作用是一致的，具體的作用機制未明確。miRNA通過結合靶mRNA的3′-UTR中的互補位點，導致mRNA翻譯抑制或者降解，抑制靶基因的表達發(fā)揮功能[9]。TargetScan7.1軟件在線預測顯示，IGF2BP2 3′-UTR存在miR-181a-5p的結合位點，可能是miR-181a-5p的靶基因。進一步采用雙熒光素酶報道基因試驗和qRT-PCR實驗驗證，IGF2BP2是miR-181a-5p的直接靶基因。

IGF2BP2在胰腺癌、結直腸癌和急性髓細胞白血病等腫瘤組織中高表達，促進腫瘤的增殖、侵襲和轉移，并與患者的預后不良相關，被認為是促癌基因[16～18]。但IGF2BP2和PE與胎盤發(fā)育等相關研究未見報道，因此我們推測miR-181a-5p可能靶向負調(diào)控IGF2BP2抑制胎盤滋養(yǎng)層細胞遷移和浸潤能力。首先，我們在組織水平檢測miR-181a-5p和IGF2BP2 mRNA的表達情況，發(fā)現(xiàn)與正常妊娠胎盤組織相比，PE胎盤組織中miR-181a-5p表達下降，IGF2BP2 mRNA表達增加，且兩者在PE胎盤組織中的表達呈負相關，提示miR-181a-5p可能靶向IGF2BP2的表達導致胎盤發(fā)育障礙。在細胞水平生物功能實驗證實，miR-181a-5p抑制胎盤滋養(yǎng)細胞HTR-8/SVneo的浸潤和遷移能力，而增加IGF2BP2表達可減弱miR-181a-5p對胎盤滋養(yǎng)層細胞浸潤和遷移能力的抑制作用，表明miR-181a-5p是通過靶向調(diào)控IGF2BP2基因發(fā)揮抑制胎盤滋養(yǎng)層細胞浸潤和遷移的能力。Wnt/β-catenin信號通路是與腫瘤惡性進展密切相關的重要調(diào)控途徑之一[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路在PE患者胎盤中被抑制，導致滋養(yǎng)層細胞侵襲和增殖能力降低，從而促進了PE的發(fā)生發(fā)展[20]。在本研究中，我們檢測了Wnt/β-catenin信號通路中關鍵蛋白Wnt1和β-catenin的表達，發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p可抑制Wnt/β-catenin信號通路，而IGF2BP2基因可以減弱miR-185a -5p對Wnt/β-catenin信號通路的抑制作用。

綜上所述，在PE胚胎組織中miR-181a-5p表達下降，IGF2BP2基因表達增加。miR-181a-5p靶向負調(diào)控IGF2BP2基因可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的活性降低胎盤滋養(yǎng)層細胞的浸潤和遷移能力，miR-181a-5p可能是干預PE進展的潛在靶點。