楊靜，何浩，譚波，趙珂，陳麗

川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川南充637000

膿毒癥是感染導(dǎo)致宿主反應(yīng)失調(diào)的全身炎癥反應(yīng)綜合征，機(jī)體炎癥反應(yīng)失控可進(jìn)展至膿毒性休克，最終導(dǎo)致多器官功能障礙。膿毒癥是急性腎損傷(AKI)最常見的病因[1]，在膿毒癥患者中AKI的發(fā)生率為40%～50%[2]。膿毒癥患者發(fā)生AKI后，病死率可升高6～8倍[2，3]，且遠(yuǎn)期不良預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)升高[4]。尋找膿毒癥患者并發(fā)AKI相關(guān)的生物標(biāo)志物，有助于評(píng)估疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后。外周血Toll樣受體4(TLR4)及相關(guān)的炎癥因子在AKI的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮一定作用。乳脂球表皮生長因子8(MFG-E8)參與凋亡細(xì)胞的清除，其吞噬作用能夠預(yù)防死亡細(xì)胞可能造成的免疫損傷。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是真核細(xì)胞核內(nèi)蛋白，其作為晚期炎癥介質(zhì)，參與多種疾病的進(jìn)展。本研究擬探討血清TLR4、MFG-E8及HMGB1對(duì)膿毒癥患者并發(fā)AKI的診斷價(jià)值，以期為該病的早期診斷及病情評(píng)估提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年2月～2019年2月本院收治的膿毒癥患者130例，入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡>18歲，男女不限；②符合中國嚴(yán)重膿毒癥/膿毒性休克治療指南中的相關(guān)診斷[5]；③自愿參與，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①入院時(shí)已進(jìn)入慢性腎臟病5期或長期行腎臟替代治療；②由膿毒癥以外其他病因(腎小球腎炎、腎血管性疾病、腎小球壞死、泌尿系統(tǒng)梗阻、應(yīng)用腎毒性藥物或造影劑或尿路梗阻)導(dǎo)致的AKI；③截肢術(shù)后；④腎移植術(shù)后。參考改善全球腎臟病預(yù)后組織(KDIGO)[6]標(biāo)準(zhǔn)，與基線血肌酐比較，48 h內(nèi)血肌酐升高≥26.5 μmol/L或7 d內(nèi)血肌酐升高≥基線值的1.5倍為AKI；48 h內(nèi)血肌酐升高≥26.5 μmol/L或7 d內(nèi)血肌酐升高為基線值的1.5～1.9倍定義為AKI Ⅰ期；7 d內(nèi)血肌酐升高為基線值的2.0～2.9倍為AKI Ⅱ期；7 d內(nèi)血肌酐升高≥基線值的3.0倍或血肌酐≥353.6 μmol/L或開始腎臟替代治療為AKI Ⅲ期。根據(jù)KGIDO標(biāo)準(zhǔn)將患者分為AKI組63例、非AKI組67例。AKI組男30例，女33例；年齡(54.61±13.73)歲；合并高血壓16例，糖尿病13例，貧血12例，高尿酸血癥15例；機(jī)械通氣31例，無機(jī)械通氣32例；使用血管活性藥物29例，未用血管活性藥物34例。非AKI組男34例，女33例；年齡(52.31±12.92)歲；合并高血壓15例，糖尿病14例，貧血11例，高尿酸血癥15例；機(jī)械通氣29例，無機(jī)械通氣38例；使用血管活性藥物25例，未用血管活性藥物42例。兩組臨床資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?；颊呔炇鹬橥鈺?；本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 血清LR4、MFG-E8及HMGB1檢測(cè) 收集患者治療前空腹外周靜脈血5 mL，經(jīng)高速離心機(jī)3 000 r/min(有效離心半徑為10 cm)，離心10 min后貯存于不含抗凝劑或防腐劑的試管，于-80 ℃冰箱保存以備用。采用ELISA法檢測(cè)TLR4、MFG-E8、HMGB1。TLR4、MFG-E8試劑盒購自美國R&D公司，HMGB1試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。根據(jù)試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 相關(guān)指標(biāo)收集及檢測(cè)方法 相關(guān)指標(biāo)包括格拉斯哥昏迷(GCS)評(píng)分、基線急性生理功能和慢性健康狀況評(píng)分系統(tǒng)Ⅱ(APACHE II)評(píng)分、序貫器官衰竭(SOFA)評(píng)分、基線血肌酐、基線預(yù)估的腎小球?yàn)V過率(eGFR)、血紅蛋白、血小板、血清白蛋白、尿酸、乳酸、降鈣素原、C反應(yīng)蛋白。GCS評(píng)分[7]包括睜眼反應(yīng)、語言反應(yīng)和肢體運(yùn)動(dòng)三部分，總分0～30分，分?jǐn)?shù)越高表明昏迷程度越嚴(yán)重。APACHE Ⅱ評(píng)分[8]由急性生理學(xué)評(píng)分、年齡評(píng)分、慢性健康狀況評(píng)分三部分組成，總分0～71分，分?jǐn)?shù)越高提示患者病情越重，死亡風(fēng)險(xiǎn)越高。SOFA評(píng)分[9]主要從各個(gè)系統(tǒng)分析危重患者器官功能障礙的嚴(yán)重程度，總分0～24分，分?jǐn)?shù)越高提示合并器官功能障礙越嚴(yán)重。采用美國貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)型號(hào)為COULTER LH 750/LH 755的BECKMANCOULTER-AC.T5diff儀器檢測(cè)血常規(guī)，用庫爾特全自動(dòng)細(xì)胞分析儀(美國貝克曼公司)檢測(cè)肝腎功能，用便攜式乳酸鹽分析儀(德國Senslab公司)檢測(cè)乳酸，用BLA250型檢測(cè)儀(德國BERTHOLD公司)檢測(cè)降鈣素原，用P800全自動(dòng)生化分析儀(RCHE公司)檢測(cè)C反應(yīng)蛋白，按慢性腎臟病流行病協(xié)作研究(CKD-EPI)公式計(jì)算eGFR[10]。

2 結(jié)果

2.1 非AKI組與AKI組血清TLR4、MFG-E8及HMGB1水平比較 AKI組血清TLR4、HMGB1水平高于非AKI組，血清MFG-E8水平低于非AKI組(P均<0.05)。見表1。

表1 非AKI組與AKI組血清TLR4、MFG-E8及HMGB1水平比較

2.2 非AKI組與AKI組相關(guān)指標(biāo)比較 AKI組SOFA評(píng)分、基線血肌酐、基線eGFR、乳酸水平高于非AKI組，血清白蛋白水平低于非AKI組(P均<0.05)。兩組其他指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 非AKI組與AKI組相關(guān)指標(biāo)比較

2.3 不同AKI分期患者TLR4、MFG-E8、HMGB1水平比較 AKI Ⅲ期的膿毒癥患者TLR4、HMGB1水平比較：AKI Ⅲ期>AKI Ⅱ期>AKI Ⅰ期；MFG-E8水平比較：AKI Ⅲ期

表3 不同AKI分期患者TLR4、MFG-E8、HMGB1水平比較

注：與AKI Ⅰ期相比，#P<0.05；與AKI Ⅱ期相比，*P<0.05。

2.4 膿毒癥患者并發(fā)AKI的危險(xiǎn)因素 建立Logistic回歸模型，以膿毒癥患者的基線資料為樣本，以是否發(fā)生AKI作為因變量，賦值為1=AKI，0=非AKI。以前述單因素分析中P<0.05的指標(biāo)/因素作為因變量，選取SOFA評(píng)分、基線血肌酐、基線eGFR、血清白蛋白水平、乳酸、TLR4、HMGB1、MFG-E8作為自變量，連續(xù)變量按照兩組總均值進(jìn)行分段，轉(zhuǎn)化為兩分類變量，以提高統(tǒng)計(jì)效率使回歸結(jié)果清晰。回歸過程采用“進(jìn)入法”以進(jìn)行自變量的選擇和剔除，設(shè)定α剔除=0.10，α入選=0.05?；貧w結(jié)果：TLR4、HMGB1、MFG-E8這3個(gè)變量被保留入回歸方程。TLR4、HMGB1水平升高是膿毒癥患者并發(fā)AKI的危險(xiǎn)因素(OR均>1，P均<0.05)，MFG-E8水平升高是膿毒癥患者并發(fā)AKI的保護(hù)因素(OR>1，P<0.05)。見表4。

表4 膿毒癥患者并發(fā)AKI的危險(xiǎn)因素分析

2.5 TLR4、HMGB1、MFG-E8對(duì)膿毒癥患者并發(fā)AKI的診斷效能 TLR4、HMGB1及MFG-E8聯(lián)合檢測(cè)診斷膿毒血癥患者并發(fā)AKI的ROC曲線下面積大于三者單獨(dú)檢測(cè)(P均<0.05)，見表5。

表5 TLR4、HMGB1、MFG-E8診斷膿毒癥并發(fā)AKI的ROC曲線分析

3 討論

AKI是膿毒癥患者中最常見的并發(fā)癥，其發(fā)生率具有逐漸上升的趨勢(shì)。Rivers等[11]研究報(bào)道，在感染性休克患者中，近2/3患者并發(fā)AKI。另一項(xiàng)回顧性多中心研究[12]也發(fā)現(xiàn)，AKI在感染性休克的患者中的發(fā)生率高達(dá)64.4%?；颊卟l(fā)AKI可增加住院患者的病死率[13],且臨床預(yù)后不良，造成沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。膿毒癥并發(fā)AKI的病理生理學(xué)機(jī)制，可能由于膿毒癥患者血流動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定引起腎臟灌注不足導(dǎo)致腎小管壞死、炎癥因子激活以及細(xì)胞因子和趨化因子介導(dǎo)腎小管損傷、腎小管和間質(zhì)細(xì)胞凋亡等[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥并發(fā)AKI的發(fā)生率為48.5%，且合并AKI的膿毒癥患者基線SOFA評(píng)分、血肌酐、乳酸水平較高，但血清白蛋白、基線eGFR水平較低。由此可見，膿毒癥患者腎功能以及營養(yǎng)狀態(tài)較差，病情危重的患者更易并發(fā)AKI。目前膿毒癥相關(guān)的AKI無特效治療方案，且治療效果欠佳，尋找新的生物學(xué)標(biāo)志物協(xié)助膿毒癥相關(guān)AKI的診斷以及評(píng)估其嚴(yán)重程度和潛在治療靶點(diǎn)顯得尤為重要。

膿毒癥是指由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，多種炎癥因子參與膿毒癥的發(fā)病機(jī)制，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和炎癥損傷。Toll樣受體是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質(zhì)分子，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁，可以識(shí)別抗原并激活機(jī)體免疫細(xì)胞應(yīng)答。TLR4作為重要的受體家族成員，可識(shí)別革蘭陰性菌胞壁成分脂多糖的主要受體，參與炎癥反應(yīng)。其通過阻斷TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)炎癥免疫反應(yīng)，抑制炎癥介質(zhì)的表達(dá)，能夠提高膿毒癥患者的生存率[15]。HMGB1是參與膿毒癥發(fā)病過程的一種晚期炎性介質(zhì)，內(nèi)毒素及多種炎性因子均可誘導(dǎo)HMGB1釋放介導(dǎo)炎性反應(yīng)。既往有研究表明，HMGB1與膿毒癥的臨床表現(xiàn)、嚴(yán)重程度和預(yù)后轉(zhuǎn)歸具有一定的相關(guān)性。抑制HMGB1的表達(dá)能夠抑制膿毒癥的進(jìn)展，降低患者病死率。且有研究表明，部分TLR是HMGB1的重要受體。HMGB1可能通過TLR信號(hào)通路調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)和炎癥免疫反應(yīng)，介導(dǎo)損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥并發(fā)AKI的患者TLR4和HMGB1水平高于未并發(fā)AKI的膿毒癥患者，且AKI的分級(jí)越高，外周血TLR4和HMGB1水平越高，進(jìn)一步分析膿毒癥并發(fā)AKI的危險(xiǎn)因素得出，TLR4和HMGB1是膿毒癥患者并發(fā)AKI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。郭皓等[16]研究發(fā)現(xiàn)，TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與了膿毒癥AKI的發(fā)生過程。而邱英等[17]則發(fā)現(xiàn)，HMGB1在膿毒癥相關(guān)AKI患者中水平明顯升高，有助于診斷膿毒癥并發(fā)AKI，并評(píng)估患者的預(yù)后。因此，膿毒癥患者TLR4、HMGB1水平升高應(yīng)警惕并發(fā)AKI，TLR4和HMGB1水平可用于評(píng)估膿毒癥并發(fā)AKI的嚴(yán)重程度。

MFG-E8也稱為乳黏素，是最初在小鼠乳和乳腺上皮中發(fā)現(xiàn)的66 kD糖蛋白，其為抑制腸病原體結(jié)合和感染性的乳黏液蛋白相關(guān)防御重要組分，在組織動(dòng)態(tài)平衡和炎癥預(yù)防上起重要作用。MFG-E8參與凋亡細(xì)胞的清除，其吞噬作用能夠預(yù)防死亡細(xì)胞可能造成的免疫損傷，維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)，修復(fù)損傷組織，減輕炎癥反應(yīng)。既往有研究表明，MFG-E8可通過脂多糖-CD14途徑影響膿毒癥的預(yù)后[18]。本研究結(jié)果顯示，膿毒癥并發(fā)AKI的患者中，MFG-E8水平低于未合并AKI的膿毒癥患者，且隨著AKI分級(jí)越高，MFG-E8水平越低。MFG-E8水平升高是膿毒癥并發(fā)AKI患者的保護(hù)因素，同樣可以用于評(píng)估膿毒癥并發(fā)AKI患者的嚴(yán)重程度及預(yù)后。

此外，本研究采用ROC曲線分析，TLR4、HMGB1和MFG-E8聯(lián)合檢測(cè)可以提高膿毒癥并發(fā)AKI的診斷特異度和敏感度，有助于膿毒癥并發(fā)AKI的早期診斷。本研究同時(shí)探討TLR4、HMGB1和MFG-E8水平與膿毒癥并發(fā)AKI病情嚴(yán)重程度的關(guān)系，對(duì)于膿毒癥并發(fā)AKI預(yù)后的評(píng)估和尋找潛在治療靶點(diǎn)具有重要意義。

綜上所述，膿毒癥并發(fā)AKI患者血清TLR4、HMGB1水平升高，而MFG-E8水平降低。TLR4、HMGB1、MFG-E8水平與AKI分級(jí)密切相關(guān)，可以用于評(píng)估膿毒癥并發(fā)AKI患者的嚴(yán)重程度以及早期診斷膿毒癥并發(fā)AKI。但本研究為單中心臨床研究，樣本量相對(duì)較少，需要大樣本多中心臨床研究進(jìn)一步證實(shí)。此外，本研究缺乏在疾病進(jìn)展過程中對(duì)血清TLR4、HMGB1、MFG-E8水平的監(jiān)測(cè)，無法進(jìn)一步評(píng)估AKI進(jìn)展過程中TLR4、HMGB1、MFG-E8水平的變化。