李婷婷，趙樹(shù)蘭，多立安

（天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387）

堆肥技術(shù)基于有氧條件下有機(jī)物的生物降解，可有效回收生活垃圾并將其轉(zhuǎn)化為有機(jī)肥料.在土壤中添加堆肥可以改善土壤結(jié)構(gòu)，增加保水性，能夠?yàn)橹参锷L(zhǎng)提供養(yǎng)分并減少植物對(duì)化學(xué)肥料的依賴(lài)[1].然而，如果生活垃圾未實(shí)行分類(lèi)，堆肥中可能會(huì)含有大量的重金屬，長(zhǎng)期施用會(huì)將重金屬引入土壤中并被植物吸收，最終通過(guò)食物鏈威脅人類(lèi)健康[2].

草坪綠化是城市現(xiàn)代化的重要標(biāo)志.目前，我國(guó)草坪基質(zhì)的供應(yīng)不足是限制草坪建設(shè)的因素之一.在草皮生產(chǎn)中，為保證質(zhì)量，生產(chǎn)草皮的土壤條件必須良好，每完成1 次草皮生產(chǎn)過(guò)程，至少要鏟去2 cm 以上的熟土，連續(xù)3～4 次操作，肥沃的農(nóng)田將遭到破壞.近年來(lái)，將垃圾堆肥用于草坪及其他園林綠地建設(shè)的研究受到關(guān)注.如邵華偉等[3]研究生活垃圾堆肥對(duì)早熟禾生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)土壤中配以生活垃圾堆肥可以促進(jìn)早熟禾的生長(zhǎng)；趙樹(shù)蘭等[4]研究表明，用垃圾堆肥作為草坪基質(zhì)可以提高黑麥草和高羊茅的光合能力，且顯著增加植物葉片的葉綠素含量.然而基質(zhì)中的重金屬問(wèn)題如果得不到根本解決，則會(huì)存在污染地下水和影響植物生長(zhǎng)的風(fēng)險(xiǎn).鈍化可以將重金屬?gòu)纳锟衫脩B(tài)轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定態(tài)，降低重金屬的生物利用率，因此被廣泛用于重金屬污染土壤的修復(fù)[5].目前，用于土壤重金屬鈍化的納米材料主要包括納米結(jié)構(gòu)礦物、納米金屬和氧化物、生物質(zhì)納米碳和其他納米碳材料[6].森美思納米陶瓷材料是一種國(guó)內(nèi)自主研發(fā)的單層分子多孔陶瓷功能納米材料，在納米陶瓷材料表面引入官能團(tuán)使其具有較大的比表面積，從而有效去除土壤和水中的重金屬離子，可以作為鈍化劑改善重金屬污染的土壤和水體[7].但是在堆肥基質(zhì)里添加納米陶瓷材料可能會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生影響.

本研究以生活垃圾堆肥作為高羊茅（Festuca arundinacea）的培養(yǎng)基質(zhì)，選擇納米陶瓷材料為重金屬鈍化劑，探究草坪堆肥基質(zhì)添加納米陶瓷對(duì)高羊茅生長(zhǎng)和保護(hù)酶活性的影響，為納米材料安全應(yīng)用于堆肥基質(zhì)重金屬的鈍化和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

垃圾堆肥來(lái)自天津小淀垃圾堆肥處理廠，去除其中的雜質(zhì)，風(fēng)干后過(guò)2 mm 篩子.堆肥的理化性質(zhì)：pH 值為7.62，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.1%，全氮為1.35%，有效磷為78 mg/kg，碳氮比為8.37，飽和含水量為 0.76 mL/g，重金屬 Cd、Cr、Cu、Pb 和 Zn 的含量分別為 1.97、67.00、239.00、172.00 和 496.00 mg/kg.

測(cè)定高羊茅生理指標(biāo)的試劑盒購(gòu)自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司.納米陶瓷材料由格豐環(huán)保科技有限公司提供，比表面積為180～900 m2/g，粒徑為28 nm.高羊茅種子購(gòu)自江蘇瑞通種業(yè)有限公司.

1.2 方法

取生活垃圾堆肥70 g， 將納米陶瓷材料按質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0（對(duì)照）、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和 3.0%分別加入到直徑為90 mm 的培養(yǎng)皿中，混合均勻，作為高羊茅培養(yǎng)基質(zhì)，每個(gè)處理4 次重復(fù).每個(gè)培養(yǎng)皿播種100 粒大小均一、籽粒飽滿的高羊茅種子，為了易于出苗和促進(jìn)出苗時(shí)間的統(tǒng)一度，在播種之前，將種子在水中浸泡一晚，取出晾干，隨即播種[8].在培養(yǎng)期間定期澆水，使含水量保持在最大田間持水量的65%.培育溫度為15～27 ℃，相對(duì)濕度為22%～36%，自然光照.播種后第45 d 收獲植物地上部分.

1.3 指標(biāo)測(cè)定

種子萌發(fā)：種子從第4 天開(kāi)始萌發(fā)，每天記錄萌發(fā)的種子數(shù)；萌發(fā)12d 時(shí)測(cè)定發(fā)芽率（germinationrate，Gr）、發(fā)芽勢(shì)（germination potential，Gp）和發(fā)芽指數(shù)（germination index，GI）.發(fā)芽率 Gr（%）=（發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)）×100；發(fā)芽勢(shì) Gp（%）＝（萌發(fā)起 4 d 內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)）×100；發(fā)芽指數(shù) GI= ∑（Gt/Dt），式中Gt 為在t 日的發(fā)芽種子數(shù)，Dt 為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù).

生物量：將收獲的高羊茅地上部分在108 ℃下殺青20 min，再在80 ℃下烘干至恒重，稱(chēng)重.

葉綠素含量：稱(chēng)取0.1 g 新鮮葉片，切成1～2 mm薄片，浸泡在 10 mL 丙酮和乙醇混合液中（V丙酮∶V乙醇=1 ∶1），避光浸泡24 h 直至葉子完全脫色，浸泡液為測(cè)試液.以丙酮為對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定663 nm和645 nm 處的OD 值，計(jì)算葉綠素a、b 和總?cè)~綠素含量.

抗氧化酶活性和丙二醛（MDA）含量：稱(chēng)取0.1 g新鮮葉片，加入1 mL 提取液，并將混合物在冰浴中均化.在4 ℃、8 000 r/min 下離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至10 mL 離心管中進(jìn)行測(cè)定.SOD、POD、CAT 活性及MDA 含量的測(cè)定嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行.

核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶（RuBisco）活性：稱(chēng)取0.1 g 高羊茅葉片，加入1 mL 提取液，冰浴勻漿，超聲破碎.在4 ℃、8 000 r/min 條件下離心10 min，取上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行酶活性測(cè)定.

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan 法，在P=0.05 水平進(jìn)行數(shù)據(jù)差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義檢驗(yàn)，采用Origin 8.0 作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 納米陶瓷對(duì)高羊茅種子萌發(fā)的影響

播種4 d 后，高羊茅種子開(kāi)始萌發(fā)，在第12 天時(shí)趨于穩(wěn)定.不同的納米陶瓷添加量下，高羊茅種子的發(fā)芽情況如表1 所示.

表1 納米陶瓷對(duì)高羊茅種子萌發(fā)的影響Tab.1 Effect of nano-ceramics on seed germination of F.arundinacea

由表1 可以看出，與對(duì)照相比，納米陶瓷添加量為0.5%時(shí)，高羊茅種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)略有增加，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）.隨著納米陶瓷添加量的增加，發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)均呈顯著下降趨勢(shì)：發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)在3.0%處理組中數(shù)值最低，與對(duì)照相比分別降低了46.77%和63.28%；發(fā)芽勢(shì)在2.5%處理組中最低，與對(duì)照相比降低了66.67%.

2.2 納米陶瓷對(duì)高羊茅生物量和葉綠素含量的影響

基質(zhì)中添加納米陶瓷后高羊茅地上生物量和葉綠素含量的變化如表2 所示.

表2 納米陶瓷對(duì)高羊茅地上生物量及葉綠素含量的影響Tab.2 Effect of nano-ceramics on biomass and chlorophyll content of F.arundinacea

由表2 可以看出，納米陶瓷添加量為0.5%時(shí)，高羊茅地上生物量有所增加，但與對(duì)照之間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）.隨著納米陶瓷添加量的增加，高羊茅地上生物量呈下降趨勢(shì)，在3.0%處理組中達(dá)到最低，與對(duì)照相比降低了64.38%.葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量均隨著納米陶瓷添加量的增加呈上升趨勢(shì)，在3.0%處理組中達(dá)到最大值，與對(duì)照相比分別增加了27.78%、12.71%和22.64%.

2.3 納米陶瓷對(duì)高羊茅抗氧化酶活性和MDA 含量的影響

基質(zhì)中添加納米陶瓷對(duì)高羊茅抗氧化酶活性和MDA 含量的影響如圖1 所示.

圖1 納米陶瓷對(duì)高羊茅SOD、POD、CAT 活性和MDA 含量的影響Fig.1 Effect of nano-ceramics on SOD，POD，CAT activity and MDA content of F.arundinacea

由圖1（a）～圖1（c）可以看出，納米陶瓷添加量為0.5%時(shí)，高羊茅的抗氧化酶活性與對(duì)照相比顯著下降.隨著納米陶瓷添加量的增加，SOD、POD 和CAT 均顯著增加，在納米陶瓷添加量為1.5%時(shí)抗氧化酶活性達(dá)到最大值，分別比對(duì)照高出12.20%、19.43%和18.07%.隨著納米陶瓷添加量的進(jìn)一步增加，抗氧化酶的活性又呈下降趨勢(shì).

由圖1（d）可以看出，堆肥中納米陶瓷的添加量為0.5%時(shí)，MDA 含量降至最低，與對(duì)照相比降低了12.67%，而后MDA 含量隨著納米陶瓷添加量的增加而增加，在3.0%處理組中達(dá)到最大，與對(duì)照相比增加了116.87%.

2.4 納米陶瓷對(duì)高羊茅RuBisco活性的影響

基質(zhì)中添加納米陶瓷對(duì)高羊茅RuBisco 活性的影響如圖2 所示.

圖2 納米陶瓷對(duì)高羊茅RuBisco 活性的影響Fig.2 Effect of nano-ceramics on RuBisco activity of F.arundinacea

由圖2 可以看出，納米陶瓷添加量為0.5%時(shí)，與對(duì)照相比高羊茅的RuBisco 活性幾乎沒(méi)有變化.隨著添加量的進(jìn)一步增加，RuBisco 活性顯著下降，在3.0%處理組中達(dá)到最小值，與對(duì)照相比降低了38.8%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）.

3 討論

種子萌發(fā)是植物生命周期的第一階段，直接決定著植物后期的生長(zhǎng).本研究考察堆肥基質(zhì)添加納米陶瓷對(duì)高羊茅種子萌發(fā)和生長(zhǎng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.5%的納米陶瓷處理對(duì)種子萌發(fā)和地上生物量有輕微的促進(jìn)作用，超過(guò)0.5%的處理則顯著抑制了種子萌發(fā)和地上生物量的積累.Khan 等[9]的研究表明，基質(zhì)中的納米顆粒會(huì)誘導(dǎo)氧化脅迫，對(duì)植物產(chǎn)生細(xì)胞和遺傳毒性，從而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，主要表現(xiàn)為抑制種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng).Lin 等[10]的研究也表明，高濃度的納米Zn 和ZnO 抑制了黑麥草和玉米的種子萌發(fā)，納米顆粒對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響存在著濃度相關(guān)性，高濃度下會(huì)存在明顯的抑制效應(yīng).

葉綠素作為植物光合作用的主要色素，其含量高低可直接反映植物光合作用的強(qiáng)弱.本研究結(jié)果表明，隨著堆肥基質(zhì)中納米陶瓷添加量的增加，高羊茅的葉綠素含量逐漸增加.王國(guó)棟等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，納米碳能有效提高草莓葉片的葉綠素含量，這是由于納米碳有效促進(jìn)了葉綠體內(nèi)淀粉粒的合成和運(yùn)輸，提高了植物的光合利用效率，且納米碳的表面效應(yīng)和小尺寸效應(yīng)能促進(jìn)植物對(duì)氮素的吸收.彭鳴等[12]的研究表明，植物體內(nèi)的葉綠體結(jié)構(gòu)能被重金屬離子破壞.本研究中的堆肥重金屬也構(gòu)成了逆境脅迫，而納米陶瓷材料會(huì)在一定程度上吸附堆肥中的重金屬，降低高羊茅的吸收，從而減少重金屬對(duì)葉綠體的破壞，使葉綠素含量增加.

正常情況下，植物體內(nèi)的活性氧處于平衡狀態(tài).當(dāng)受到逆境脅迫時(shí)，植物體內(nèi)的活性氧會(huì)大量積累，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化，MDA 含量可以表示膜脂過(guò)氧化的程度.在本研究中，當(dāng)納米陶瓷添加量為0.5%時(shí)，高羊茅組織中的SOD、POD、CAT 活性及MDA 含量均低于對(duì)照組的數(shù)值，可能是由于納米陶瓷材料的鈍化作用使重金屬對(duì)高羊茅的毒性受到抑制.這與金睿等[13]的研究結(jié)果相似，他們用生物炭復(fù)配調(diào)理劑處理被重金屬污染的土壤后，小白菜植株的SOD、POD、CAT 活性及MDA 含量下降.當(dāng)納米陶瓷含量大于0.5%時(shí)，抗氧化酶的活性隨著納米陶瓷添加量的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，MDA 含量一直呈增加趨勢(shì).這是因?yàn)橹参镏械目寡趸赶到y(tǒng)起著活性氧清除劑的作用，當(dāng)活性氧在植物組織中被誘導(dǎo)時(shí)，抗氧化酶的活性逐漸增加[14]，當(dāng)脅迫繼續(xù)增加時(shí)，抗氧化酶系統(tǒng)對(duì)活性氧的清除能力受到抑制，過(guò)量的活性氧物質(zhì)會(huì)直接攻擊蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和DNA 等生物大分子，引起脂質(zhì)過(guò)氧化，從而導(dǎo)致機(jī)體損傷[15].這些結(jié)果說(shuō)明納米陶瓷的添加量超過(guò)0.5%時(shí)，隨著添加量的增加，納米陶瓷對(duì)高羊茅組織的損傷逐漸增大.Li 等[16]用納米顆粒處理水稻和擬南芥時(shí)，也發(fā)現(xiàn)水稻和擬南芥的活性氧增加并引發(fā)細(xì)胞死亡.Nel[17]認(rèn)為，納米顆粒產(chǎn)生毒性的首要原因就是活性氧的過(guò)度積累.

RuBisCO 是一種可溶性大分子，是植物光合作用過(guò)程中固定CO2的關(guān)鍵酶，同時(shí)也參與植物的光呼吸代謝途徑，消耗植物光合作用合成的有機(jī)物[18].本研究發(fā)現(xiàn)，隨著納米陶瓷添加量的增加，高羊茅的MDA 含量增加，RuBisCO 酶活性降低，這可能是因?yàn)檫^(guò)量的納米陶瓷會(huì)誘導(dǎo)活性氧積累，從而導(dǎo)致RuBisCO 蛋白的加速降解.高等植物的RuBisCO 活性與植物的生物量密切相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)，高羊茅葉片中RuBisco 的活性隨著納米陶瓷添加量的增加而下降，這與生物量的變化趨勢(shì)一致.

4 結(jié)論

（1）堆肥基質(zhì)中添加0.5%的納米陶瓷對(duì)高羊茅種子萌發(fā)和生物量有輕微促進(jìn)作用，隨著納米陶瓷添加量繼續(xù)增加，種子萌發(fā)受到明顯抑制，生物量也顯著下降，3.0%處理組中數(shù)值達(dá)到最小.高羊茅幼苗的葉綠素含量則隨著納米陶瓷添加量的增加而增大.

（2）納米陶瓷添加量為0.5%時(shí)，幼苗的抗氧化酶活性顯著低于對(duì)照，隨著添加量的增加，抗氧化酶活性先升后降，添加量為1.5%時(shí)酶活性達(dá)到最大，添加量為3.0%時(shí)酶活性受到顯著抑制.

（3）納米陶瓷添加量為0.5%時(shí)，幼苗的MDA 含量略有下降，RuBisCO 的活性保持不變.隨著添加量的增加，MDA 含量持續(xù)增加，RuBisco 活性持續(xù)下降.添加量達(dá)到1.5%時(shí)，納米陶瓷引起膜脂過(guò)氧化，MDA含量顯著增加，RuBisco 活性顯著下降.因此，以堆肥為基質(zhì)培養(yǎng)高羊茅時(shí)，納米陶瓷的添加量應(yīng)小于0.5%.