李亞杰

河南省周口市動物疫病預防控制中心，河南周口466000

1 布魯氏菌病概述

布魯氏菌是一種革蘭氏陰性兼性細胞內(nèi)寄生菌。布魯氏菌病（布?。┦怯刹剪斒暇鹋?、羊、豬、鹿、犬等哺乳動物和人類共患的一種動物源性傳染病，我國將其列為二類動物疫病。布病的傳播主要通過與血液、被感染宿主動物的糞便、尿液和胎盤的密切接觸，或通過吸入被污染的灰塵或氣溶膠。布病的典型癥狀是懷孕母畜流產(chǎn)，乳腺炎也是常見癥狀之一；公畜往往發(fā)生睪丸炎、附睪炎或關節(jié)炎；而人類感染布病多表現(xiàn)為持續(xù)性感染、波浪熱、多汗和關節(jié)痛等，而且可能復發(fā)或留下后遺癥。在地方病流行地區(qū)，接種疫苗是控制和消滅布魯氏菌病最經(jīng)濟和最關鍵的方法，也能最大程度地降低人感染的風險。

2 牛種布魯氏菌疫苗概述

2.1 經(jīng)典的弱毒活疫苗

S19 疫苗是在家畜中使用最廣泛的流產(chǎn)布魯氏菌疫苗，又稱作A19 疫苗。S19 菌株是強毒株在室溫培養(yǎng)1年意外分離得到的光滑型突變菌株，其中有一段720 bp 序列缺失，導致赤蘚糖醇分解代謝基因被破壞，與原代菌株相比，其毒力較低[1]。S19 疫苗接種可誘導相對較高的免疫原性，保護期較長，幾乎可達到對整個生產(chǎn)期的保護。小鼠動物模型研究顯示，可產(chǎn)生較高水平的IFN-γ、CD4+和CD8+[2]。然而，S19 疫苗也有一定的副作用：干擾布魯氏菌血清學診斷試驗；導致懷孕母畜流產(chǎn)，降低產(chǎn)奶量；而且對人類具有一定的致病性。RB51 疫苗菌株是一種耐利福平突變體，最初通過牛種布魯氏菌2308 在含青霉素和利福平的培養(yǎng)基多次傳代培養(yǎng)分離篩選得到的粗糙型菌株。研究表明，編碼O 側(cè)鏈合成必需的糖基轉(zhuǎn)移酶wboA基因在2308 菌株通過連續(xù)傳代培養(yǎng)后缺失[3]。RB51 疫苗菌株較為穩(wěn)定，無殘余毒力和毒力返祖的可能性，不干擾血清診斷試驗，可預防流產(chǎn)；若使用全劑量仍會導致懷孕母牛的流產(chǎn)，而且保護率低。此外，盡管RB51 疫苗的減毒程度更高，但它對人類依然具有傳染性，而且，它具有利福平抗性，不利于人類布魯氏菌病的治療。

2.2 亞單位疫苗

目前用于布魯氏菌亞單位疫苗進行研究，包括重組肽、蛋白質(zhì)、DNA、脂多糖（lps）和外膜囊泡（omvs）。與傳統(tǒng)的弱毒活疫苗相比，亞單位疫苗安全性高、無殘留毒力，可用于人類和懷孕動物。但保護率較低，需要高效免疫佐劑加強免疫效果。T 細胞抗原誘導分化的Th1 反應是主要的免疫應答，可增強亞單位疫苗的保護作用。其中，作為蛋白質(zhì)亞單位疫苗的OMp16、OMp19，脂質(zhì)體蛋白L7/L12、OMp25、p39 和AsnC，促進Th1 型免疫應答，和S19疫苗保護水平相當。相反，二氫硫辛酰胺琥珀酰轉(zhuǎn)移酶（rE2o）和半胱氨酸合酶A（rCysK）亞單位疫苗引發(fā)Th2 型免疫應答，保護力相對較低。SurA 和DnaK（熱休克蛋白70 家族）作為蛋白質(zhì)亞單位疫苗，與經(jīng)典活疫苗S19 相比，保護力較低。將重組蛋白混合物（rOMP19+rp39）接種小鼠可誘導Th1 介導的同型抗體和細胞免疫應答，對牛種布魯氏菌544菌株產(chǎn)生保護力。OMp19 和p39 結(jié)構(gòu)域組成的嵌合亞單位蛋白疫苗接種小鼠模型后，產(chǎn)生與Th1 型免疫反應相關的IgG 2a 和細胞因子，并誘導二次免疫應答。OMP25-BLS 融合蛋白和熱休克蛋白60 ku，以殼聚糖納米粒為載體制備的亞單位疫苗，對其免疫效果進行了評價，發(fā)現(xiàn)二者結(jié)合使用誘導的細胞免疫應答高于單獨使用時。布魯氏菌保守重組蛋白OMP25c 與弗氏佐劑混合可誘導Th1 和Th2 型免疫應答，與S19 保護水平相當。其他的重組蛋白如：AspC、Dps、lnpB 和Ndk 作為亞單位疫苗，可誘導產(chǎn)生高水平的IgG2a，與RB51 的保護效果相當。以DNA 為基礎的另一種亞單位疫苗能在多次免疫后誘導體液和細胞免疫反應。牛種布魯氏菌基因組島3（GI-3）區(qū)域編碼的幾個開放閱讀框（ORF），其表達的抗原對細胞內(nèi)生存和機體的發(fā)病機制起重要作用。因此，基于GI-3 區(qū)域設計的布魯氏菌DNA 疫苗可能是一種有效的候選疫苗。編碼GI-3 區(qū)域的BAB1-0263 或BAB1-0278 基因的DNA 疫苗，可刺激體液和細胞免疫，并產(chǎn)生高水平的IFN-γ。此外，表達BAB1-0278 基因的DNA 疫苗可以對感染2308 菌株產(chǎn)生保護力。評價GI-3 區(qū)域含ABC 型轉(zhuǎn)運體（pV278a）的DNA 疫苗發(fā)現(xiàn)，可顯著增強Th1免疫應答，并產(chǎn)生高水平的IgG2a。Gomez 等人構(gòu)建的含BAB1-0273 和/或BAB1-0278 和SOD C基因的多價融合DNA 疫苗，可產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫，IFN-γ、抗體和Th1 型反應，然而保護力低。編碼SOD-Cu/Zn 和IL-2 融合蛋白的DNA 疫苗，可誘導產(chǎn)生IgG2a 和TNF-α，與RB51 疫苗相比，可對2308 菌株產(chǎn)生有效保護[4]。

2.3 基因工程弱毒活疫苗

利用分子生物學技術(shù)敲除牛種布魯氏菌毒力基因，可導致明顯的衰減，正在開發(fā)的研究包括：嘌呤生物合成途徑基因，鐵螯合酶hem H 突變體，脂質(zhì)A 脂肪酸轉(zhuǎn)運基因，磷酸甘油酸激酶編碼基因，IV 型分泌virB基因和LPS 生物合成途徑基因。這些突變體的保護水平與經(jīng)典減毒活疫苗相似。Ugalde 等人通過缺失2308 菌株的磷酸葡萄糖變位酶（pgm）基因，研制了一種無血清診斷干擾的重組菌株，將光滑型改變成粗糙型，且Th1 免疫應答和S19 相當。將RB51 菌株cyd C cyd D 和cyd C pur D 基因進行單、雙基因缺失的疫苗，與RB51菌株相比，單劑量接種對小鼠的保護力較低，加大劑量即可誘導體液和細胞免疫反應，還可產(chǎn)生更高水平的保護力，對牛的免疫評價還需進一步驗證。牛種布魯氏菌野外分離株（BA15）中也進行相同的雙重缺失，可提供相同的保護效果，但不需要加大劑量進行疫苗接種。缺失外膜融合蛋白OMP19基因的靶向突變體在小鼠模型中保護期較短，但疫苗評價顯示和S19 和RB51 的保護水平相當。甲酰基轉(zhuǎn)移酶（wbk C）基因（參與脂多糖生物合成的關鍵基因），缺失后形成了粗糙型突變體，與光滑的S19菌株相比，衰減更大，對小鼠的保護性免疫力更低。糖基轉(zhuǎn)移酶wad C基因的缺失產(chǎn)生的突變體，不能有效逃避宿主免疫的檢測，免疫小鼠后可產(chǎn)生類似于S19 菌株的保護水平。和S19 相比，布魯氏菌wzm和wzt基因的破壞導致免疫功能下降[4]。

2.4 活載體疫苗

布病活載體疫苗主要是將布魯氏菌保護性免疫抗原整合到另一種載體病毒或細菌基因組中，如小腸結(jié)腸炎耶爾森菌編碼細菌鐵蛋白（BFR）或P39誘導Th1 型免疫應答。人蒼白桿菌和乳酸乳球菌表達SOD 在小鼠模型免疫中產(chǎn)生保護力。沙門氏菌表達31kDa、BCSP31、SOD、OMP3b、OMP 19、L7/L12、BLS 和prp A 對小鼠、豚鼠、山羊可產(chǎn)生堅強的保護力且安全性高。重組牛痘病毒表達L7/L12、OMP18在小鼠模型中保護力不顯著。Semliki 森林病毒（SFV）編碼IF3 和Sod C 接種小鼠后保護力不如RB51。流感病毒表達L7/L12 和OMP16 作為載體開發(fā)的疫苗，與S19 相比，安全性較高，可長期刺激體液和細胞免疫，尤其是在懷孕的小母牛身上防止感染；另外，通過添加OMP19 和SOD 蛋白來改進這種疫苗配方，以蒙脫石凝膠為佐劑，對綿羊和山羊有良好的保護作用。表達p39 和BLS 的腺病毒作為載體在小鼠模型中可引起體液和細胞免疫。RB51 過表達SOD、wboA、L7/L12 作為疫苗研發(fā)，和親本菌株RB51 相比、保護力顯著提高；RB51 表達異源抗原大腸桿菌β-半乳糖苷酶和牛分枝桿菌65 ku 熱休克蛋白，小鼠免疫后可誘導產(chǎn)生IgG2a 和IFN-γ[4]。