曲悅，馬丹，劉鳳岐

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院內科危重癥病房，哈爾濱 150001)

心力衰竭(heart failure，HF)是多種原因導致的心臟結構和(或)功能的異常改變，使心室收縮和(或)舒張功能發(fā)生障礙引起的一組復雜臨床綜合征。HF的復雜病理生理變化涉及鈣離子(Ca2+)的改變、基因表達的改變和信號轉導途徑的干擾等。而心肌細胞中鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)的慢性激活可進一步加重心肌損傷，這種激活在病理性心臟重構和HF的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。CaMKⅡ是一種分布廣泛的多功能絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它調節(jié)許多生物學過程，包括Ca2+穩(wěn)態(tài)、膜興奮性、細胞周期進程、蛋白質分泌、細胞骨架組織、學習、記憶和基因表達等[1-2]。在心臟中，CaMKⅡ還與興奮收縮偶聯(lián)、基因轉錄及細胞凋亡有關[2]。通過對CaMKⅡ的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)在動物模型和心臟病患者中，CaMKⅡ的表達水平和活性在不同的心肌應激狀態(tài)和不同的心臟疾病中均有所升高[3]，表明CaMKⅡ在HF、心律失常等心臟疾病中起重要作用，用具有適當選擇性的抑制劑靶向抑制心臟中CaMKⅡ的活性可能為治療HF和心律失常的一種新方法，為開發(fā)新型藥物提供了新思路?，F(xiàn)就CaMKⅡ及其抑制劑在HF中的研究進展予以綜述。

1 CaMKⅡ的生物學特點

CaMKⅡ屬多基因家族，有4個不同的基因分別編碼α、β、γ和δ亞基[4]；心臟內的CaMKⅡ以δ亞型為主，有CaMKⅡδB和CaMKⅡδC兩種不同的剪接體，其中CaMKⅡδB主要參與基因的表達調控，而CaMKⅡδC主要參與Ca2+依賴的信號轉導途徑[5-6]。CaMKⅡ參與調控某些基因的表達和細胞分化凋亡，是推動細胞周期各時相順利進行、調控細胞生長增殖的重要分子；此外，CaMKⅡ還是心肌細胞Ca2+穩(wěn)態(tài)調節(jié)的關鍵蛋白之一，主要通過肌質網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum，SR)上的蘭尼堿受體(ryanodine receptor，RyR)和受磷蛋白(phospholamban，PLB)來調節(jié)鈣信號，并在生理條件下維持心臟正常電生理活動和收縮功能[7]。

CaMKⅡ全酶由8～12個單體組成，各亞基借結合域連接形成齒輪狀結構；每個CaMKⅡ亞基包含3個不同的單元域，即N端催化域、含自我抑制位點和鈣/鈣調蛋白(Ca2+/calmodulin，Ca2+/CaM)結合位點的中間調節(jié)域以及C端的結合域[8-10]。在基礎狀態(tài)下，CaMKⅡ的催化域與調節(jié)域的假底物區(qū)結合，阻止底物和鎂離子(Mg2+)/ATP與催化域結合，使CaMKⅡ處于自身抑制狀態(tài)而無活化；收縮期時細胞內Ca2+濃度增加，大量Ca2+與CaM結合形成Ca2+/CaM復合物，結合到CaMKⅡ的調節(jié)域上，使CaMKⅡ構象發(fā)生改變，調節(jié)域對催化域的自動抑制作用解除，催化域從假底物區(qū)釋放，發(fā)揮生理作用，激活CaMKⅡ全酶，并依次磷酸化細胞中的靶蛋白，包括RyR、PLB、SR鈣ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA)和L型鈣通道等，從而發(fā)揮生物學活性[1,8-10]。隨著Ca2+/CaM解離，CaMKⅡ失活，這是最先發(fā)現(xiàn)的經(jīng)典激活方式，稱為Ca2+/CaM依賴性CaMKⅡ激活；此外，CaMKⅡ的活性也可以通過翻譯后修飾來調節(jié)，稱為非Ca2+/CaM依賴性CaMKⅡ激活，包括磷酸化、氧化、S-亞硝基化[11]，糖基化[12]，α-輔肌動蛋白[13]激活和尚未完全解析的環(huán)腺苷酸活化交換蛋白/一氧化氮合酶途徑[14]。

2 CaMKⅡ在HF后心律失常中的作用

除泵衰竭外，HF患者的另一個重要死因是心律失常(心源性猝死)，且房性和室性心律失常均可加速HF的進展[15]。神經(jīng)體液、代謝、電生理特性等的動態(tài)變化和密切相互作用使HF患者易患心律失常[16]。因此，研究CaMKⅡ與HF后心律失常之間的關系具有重要的臨床意義。

CaMKⅡ對RyR的過度磷酸化可導致SR的自發(fā)性Ca2+釋放事件(Ca2+-泄漏)增加[17-18]。生理條件下，SERCA不僅可以將Ca2+轉運回SR，還可以通過PLB的CaMKⅡ依賴性磷酸化來增強SERCA的功能；然而在病理條件下，由于SR過量的Ca2+-泄漏，舒張期細胞質中[Ca2+]濃度增加，激活了鈉鈣離子交換體(sodium-calcium exchange，NCX)，從而導致延遲去極化[18]。同時，CaMKⅡ還可以使作為鈉電流(INa)基礎的鈉通道Nav1.5磷酸化，從而增加晚期鈉電流(INaL)[19]，這可以增加細胞質[Na+]濃度，限制Ca2+通過NCX流出，引起繼發(fā)于Na+過載的Ca2+過載。Mason和Sossalla[20]也指出，這種增加的[Ca2+]可以誘導SR Ca2+-泄漏，激活NCX，導致延遲去極化。延遲去極化是心房和室性心律失常的已知觸發(fā)因素[21]。此外，HF中上調的CaMKⅡ也是長QT-3型和兒茶酚胺能多形性室性心動過速這兩種遺傳相關心律失常綜合征的主要分子缺陷[22]。

上調的CaMKⅡ與受干擾的Na+和Ca2+通量之間的致心律失常協(xié)同作用在衰竭的室性和房性心肌細胞中均已被假設，且心肌細胞電生理、Ca2+-和Na+-處理以及信號轉導的計算模型已開始定量證實這一觀點[23-24]。CaMKⅡ活性增加會使INaL升高[19]，而升高的INaL可延長動作電位持續(xù)時間并增強早期去極化的傾向，這是一種眾所周知的心律失常觸發(fā)因素。而更長的動作電位和更短的心臟舒張會導致Na+和Ca2+超負荷，這會增加自發(fā)性SR Ca2+-泄漏和延遲去極化后的可能性；這種Ca2+負載也促進了CaMKⅡ活化，加強了INaL和RyR過度活化，進一步延長了動作電位，增加了Na+和SR Ca2+負荷和泄漏，最終產(chǎn)生病理性正反饋回路，促進機械性心臟功能障礙(收縮和舒張)和心律失常[22]。因此，可以通過抑制CaMKⅡ活性阻斷CaMKⅡ-Na+-Ca2+正反饋環(huán)，從而達到治療和預防HF后心律失常的目的。

3 CaMKⅡ在HF中的作用

CaMKⅡ已經(jīng)被證明在多種心臟疾病中扮演重要角色，尤其是HF[3]。CaMKⅡ的過度活躍和慢性激活是病理性心臟重構的確定因素，且在HF期間可以直接影響心臟收縮功能障礙及心律失常的發(fā)生和發(fā)展[25-27]。Zhang等[25]通過給小鼠行主動脈縮窄術制造HF模型，并用小鼠左心室標本行進一步研究，結果表明，CaMKⅡδC的表達、磷酸化和信使RNA水平均增加，即CaMKⅡδC活性在HF中增高且始于轉錄階段；同時，研究者還制造了CaMKⅡδC的轉基因小鼠(TG小鼠)，一段時間后這些TG小鼠的CaMKⅡ活性增加了1.7～3倍，左心室短軸縮短率降低了65%，大多數(shù)小鼠表現(xiàn)出肺淤血、胸腔積液、嚴重水腫等HF的癥狀，并最終出現(xiàn)了心臟擴張性肥大和心室功能障礙，小鼠壽命縮短；此外，從TG小鼠心臟分離出的心肌細胞體積增大、收縮力降低，且CaMKⅡ位點的PLB和RyR磷酸化增加。這些結果證明了CaMKⅡδC在心臟中的過度表達可誘導心臟肥大和擴張型心肌病的發(fā)生。Maier等[26]進一步觀察了TG小鼠和野生型同窩小鼠(WT小鼠)心肌細胞中Ca2+調節(jié)的改變，結果發(fā)現(xiàn)：①與WT小鼠相比，TG小鼠的抽搐時間縮短，舒張性[Ca2+]i、[Ca2+]i瞬變振幅和SR Ca2+含量均降低，這與SERCA2表達減少、SR Ca2+-泄漏增加及NCX表達增加一致；②在TG小鼠中抽搐/咖啡因[Ca2+]i(一個SR Ca2+釋放分數(shù)的指數(shù))顯著增加，因此雖然SR Ca2+的含量降低，但抽搐期間釋放的SR Ca2+比例增加；③與WT小鼠相比，TG小鼠的SR Ca2+含量較低，但其舒張期Ca2+火花頻率(SR Ca2+-泄漏的量度)和抽搐分數(shù)釋放增加(火花持續(xù)時間延長)，表明TG小鼠的RyR發(fā)生功能改變且舒張期SR Ca2+-泄漏增加；④咖啡因誘導[Ca2+]i瞬變降低得更快，表明TG小鼠相較WT小鼠增強了NCX功能，這也與增加的NCX蛋白表達相一致，即CaMKⅡ過度表達后引起激發(fā)-收縮偶聯(lián)的急性調節(jié)，使NCX表達增加、SERCA2表達減少、SR Ca2+含量降低以及SR Ca2+-泄漏增加，造成TG小鼠心肌細胞收縮功能降低，最終導致HF。

4 CaMKⅡ抑制劑

已有研究表明，抑制CaMKⅡ可以預防病理性心肌重構和結構性心臟病，CaMKⅡ受到抑制后相關蛋白的表達水平和功能均會發(fā)生改變[28]。Liu等[29]進行了豬心房顫動-HF模型實驗，每組動物隨機接受編碼CaMKⅡ抑制肽的腺病毒或0.9%氯化鈉注射液的心房基因轉移，研究直接評估了CaMKⅡ在心房結構重構中的作用；實驗數(shù)據(jù)顯示，CaMKⅡ的水平和活性在心房顫動-HF早期逐漸升高，且介導了心房顫動時心房收縮功能和結構重構相關的信號通路，同時抑制CaMKⅡ可維持心房收縮功能，減輕心房肥厚、纖維化和凋亡，但不影響炎癥和肌溶解。這證明抑制CaMKⅡ可減少HF患者的心房重構，并可預防心房顫動的發(fā)生。CaMKⅡ的抑制還可以防止過度β腎上腺素受體刺激和心肌梗死后的適應性不良重構，可顯著減輕心肌梗死小鼠心肌肥厚以及心肌纖維化的程度，改善心肌細胞鈣穩(wěn)態(tài)，縮短心臟細胞動作電位[28]。此外，抑制CaMKⅡ還可改善衰竭心肌細胞SR Ca2+等引起的心臟觸發(fā)活動，減少HF后心律失常的發(fā)生[30-31]。

4.1變構抑制劑 迄今為止使用最廣泛的CaMKⅡ抑制劑為KN93，它是CaMKⅡ活性的變構抑制劑。研究表明，KN93直接與Ca2+/CaM結合會破壞Ca2+/CaM與CaMKⅡ相互作用的能力，從而有效抑制CaMKⅡ的活化[32]。然而，一旦CaMKⅡ激活并自磷酸化，KN93則無法抑制該激酶。He等[33]給主動脈縮窄術后的HF小鼠每天腹腔注射KN93或KN92(KN93無活性類似物)(共1周)慢性抑制CaMKⅡ，并使用蛋白質印跡法評估小鼠心室中的總CaMKⅡ和磷酸化CaMKⅡ水平，結果發(fā)現(xiàn)，HF組小鼠心室中的總CaMKⅡ和磷酸化CaMKⅡ水平均升高，且磷酸化CaMKⅡ占總CaMKⅡ的比例增加超過3倍(P<0.05)，而HF+KN93組小鼠心室中CaMKⅡ的磷酸化水平降低了48%；他們進一步比較了超聲心動圖、壓力-體積循環(huán)分析的各項數(shù)值變化，結果表明，慢性抑制CaMKⅡ的活性能使左心室射血分數(shù)、收縮末期壓力容積關系、壓力上升-舒張末期容積峰值速率和前負荷補充搏功均增加，而對峰值壓力下降率、弛豫時間常數(shù)和舒張末期壓力-體積關系無顯著影響；同時，慢性抑制CaMKⅡ的活性也可顯著增加異丙腎上腺素作用后HF小鼠的左心室射血分數(shù)、收縮末期壓力容積關系和前負荷補充搏功值等的數(shù)值。該實驗結果證明了慢性抑制CaMKⅡ活性既能顯著改善HF小鼠的心功能和HF小鼠對異丙腎上腺素的反應性，又不損害其心臟的舒張功能。截至目前，大多數(shù)CaMKⅡ抑制劑的數(shù)據(jù)均來源于體外細胞實驗，He等[33]進行的是第一項實際檢測CaMKⅡ抑制劑治療對整體實驗動物HF心臟影響的實驗，這對將CaMKⅡ抑制劑應用于HF的臨床具有重要的指導意義。

4.2小分子抑制劑 AS105是Allosteros Therapeutics公司通過對嘧啶類CaMKⅡδ抑制劑進行優(yōu)化后推出的高親和力小分子ATP競爭性CaMKⅡ抑制劑[34]。Neef等[35]使用來自人類供體的心房肌細胞和CaMKⅡδC過度表達的HF小鼠的心室肌細胞探索了AS105的治療潛力，結果發(fā)現(xiàn)，AS105減少了人類供體心房肌細胞的SR Ca2+-泄漏和小鼠心室肌細胞的SR Ca2+-泄漏，且在人的心房肌細胞中，AS105顯著降低了致心律失常的自發(fā)性SR Ca2+釋放事件的可能性；在HF小鼠的心室肌細胞中，AS105增強了SR積累Ca2+的能力，表現(xiàn)為小鼠細胞中Ca2+-瞬時振幅的靜息后電位增強，SR Ca2+-含量增加，因此這些心肌細胞在基礎刺激期間的收縮能力得到改善且不會對激發(fā)-收縮偶聯(lián)產(chǎn)生負面影響。該研究表明了AS105對CaMKⅡ的抑制是通過ATP競爭發(fā)生，與通常使用的KN93不同，AS105同樣可以很好地抑制未磷酸化和自磷酸化的CaMKⅡ，這種抑制多種形式CaMKⅡ的潛力使AS105有望在臨床治療中廣泛應用。

GS-680是高選擇性、ATP競爭性CaMKⅡ抑制劑。Lebek 等[36]測試了GS-680的抗心律失常和變力作用，結果表明，GS-680對CaMKⅡδC有良好的選擇性，可顯著降低離體的人心房肌細胞的早期和延遲的去極化作用，并可通過減少SR Ca2+-泄漏來抑制過早的心房收縮，在人右心房肌小梁中起抗心律失常作用；同時，GS-680還減弱了心室肌小梁的負力-頻率關系，并增加了終末期HF患者心室肌細胞的鈣瞬態(tài)振幅；此外，在實驗測試濃度下，GS-680將占據(jù)基本上所有可用的CaMKⅡ ATP結合口袋，預計GS-680會抑制所有形式的活化CaMKⅡ。以上結果表明，GS-680可抑制人體心房的心律失?；顒樱⒏纳艸F的心室收縮力，且GS-680化合物有高選擇性和良好的生物利用度，具有成為臨床用藥的巨大潛力。

RA306是一種新型、高選擇性、強效的ATP競爭性CaMKⅡ抑制劑，是Beauverger等[37]重新搭建吡啶并嘧啶系列ATP競爭性CaMKⅡ抑制劑后啟動內部化學優(yōu)化程序得到的化合物，他們將RA306用于攜帶α-肌動蛋白基因突變(這種基因突變會導致人類擴張型心肌病)的患病小鼠，并口服給藥，結果顯示，RA306組心臟蘇氨酸-17位點上PLB的磷酸化均受到抑制，且CaMKⅡ活性降低，而超聲心動圖結果顯示，與對照組相比，RA306組小鼠的心臟功能(射血分數(shù)和心排血量)均顯著改善；此外，RA306的化學優(yōu)化目標包括：改善CaMKⅡδ在納摩爾范圍內的效價，通過提高激酶選擇性避免脫靶的不良反應，實現(xiàn)低腦滲透(<10倍心臟暴露)以避免中樞神經(jīng)系統(tǒng)不良反應，提高口服生物利用度并持續(xù)抑制心肌中的CaMKⅡ(>12 h)等。以上實驗結果均支持RA306這種新型口服CaMKII抑制劑的臨床可行性，有益于HF的治療。

4.3其他抑制劑 有試驗使用新型抗糖尿病藥物恩格列凈(鈉依賴性葡萄糖轉運蛋白2的選擇性抑制劑)治療有心血管疾病的糖尿病患者，結果顯示心血管死亡的發(fā)生率降低了38%(n=7 020)；同時，對潛在的機制進行了討論，發(fā)現(xiàn)這種有益效果不是由于缺血性終點(腦卒中或心肌梗死)的減少，而是由于HF住院風險降低所致[38]。此外，恩格列凈通過調節(jié)缺血危險因素(血壓、低密度脂蛋白膽固醇、糖化血紅蛋白)，也能發(fā)揮有益于心血管的作用。通過對上述試驗進行分析發(fā)現(xiàn)，血細胞比容和血紅蛋白的變化是對心血管死亡風險影響最大的變量，而不是糖化血紅蛋白的變化，表明血糖控制并不是主要的心臟保護機制[39-41]。Mustroph等[42]測試了恩格列凈治療后人和小鼠心室肌細胞中CaMKⅡ活性和Ca2+的變化，他們將主動脈縮窄術后的HF野生小鼠和人類衰竭的心室肌細胞暴露于恩格列凈中，24 h后小鼠心室肌細胞CaMKⅡ活性以及CaMKⅡ依賴性RyR磷酸化水平均降低，在人類衰竭的心室肌細胞中也具有相似的結果；且HF野生小鼠和人類衰竭的心室肌細胞中，恩格列凈降低了Ca2+火花頻率，增加了SR Ca2+負荷和Ca2+瞬時振幅，即減少了Ca2+-泄漏，改善了心肌收縮力。雖然恩格列凈降低CaMKⅡ活性的具體機制目前尚不清楚，但恩格列凈可以用于治療HF等CaMKⅡ活性增加的疾病，這一發(fā)現(xiàn)或可為HF合并糖尿病的治療提供新方向。

Rem2是一種活性調節(jié)基因，主要在腦中表達，同時腦中也存在所有4種CaMKⅡ同工酶。Rem2是單體G蛋白的Ras超家族的RGK亞家族(Rem2、Rad、Rem和Gem/Kir)的成員，相對于其他Ras家族成員，Rem2含有延伸的N端和C端[43]。Rem2可直接與CaMKⅡ相互作用并有效抑制完整全酶的活性，它允許CaMKⅡ自磷酸化，但阻止CaMKⅡ對其他靶點的磷酸化作用，這是一種前所未知的Rem2功能[44]。雖然Rem2是體外CaMKⅡ的底物[45]，但Royer等[44]證實了Rem2與CaMKⅡ可以在體內結合，并檢測了CaMKⅡ-Rem2相互作用的能力，發(fā)現(xiàn)兩者的互相作用較激酶和底物之間更穩(wěn)定。該研究結果表明，Rem2的抑制作用涉及與CaMKⅡ中樞結構域和底物識別結構域的相互作用。此外，Royer等[44]還發(fā)現(xiàn)，Rem2 N端(Arg-79和Arg-80)中兩個關鍵氨基酸殘基被取代后其抑制CaMKⅡ的能力完全消失。這些研究結果將有助于進一步研究Rem2抑制細胞中CaMKⅡ的機制，進一步推動內源性CaMKⅡ抑制劑的研究。

5 小 結

盡管AS105等小分子抑制劑克服了使用KN93的許多局限性，為推進CaMKⅡ抑制劑的研究提供了幫助(包括脫靶效應、低效價以及僅阻止非磷酸化CaMKⅡ等)，但AS105等小分子抑制劑應用于臨床尚需時間。在臨床應用(尤其是長期應用)CaMKⅡ抑制劑時，除了細胞滲透的問題外，如何減輕CaMKⅡ抑制劑對腦中CaMKⅡα、β亞型的作用至關重要，這可以防止對記憶和神經(jīng)元可塑性的有害影響。因此，還需要進一步探索方便臨床應用的抑制劑、載體技術和傳遞技術，使高效、安全、長期地抑制CaMKⅡ活性成為可能。