吳藝影 應(yīng)玲紅 盛林霞 陳舒萍

【摘要】為了研究小麥中嘔吐毒素不同檢測方法的差異性與相關(guān)性，尋找小麥入庫作業(yè)時快速檢測法可靠性范圍，對45份小麥樣品進(jìn)行膠體金試紙條、ELISA、HPLC的檢測。結(jié)果顯示：試紙條法（1000μg/kg）結(jié)果呈陰性為合格樣品，呈陽性需HPLC復(fù)檢；ELISA結(jié)果小于1000μg/kg時為合格樣品，結(jié)果為1000～1300μg/kg時需HPLC復(fù)檢，結(jié)果大于1300μg/kg為不合格樣品。

【關(guān)鍵詞】膠體金試紙條；ELISA；HPLC；小麥；嘔吐毒素

嘔吐毒素（vomitoxin），又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON），由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生，屬單端孢霉烯族化合物。近年來隨著氣候變化，嘔吐毒素污染糧食呈上升趨勢，尤其是小麥被污染后產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降，毒素難以去除。人和動物食用被污染的小麥及其制品后會對健康造成威脅，因此高效、準(zhǔn)確地檢測出嘔吐毒素含量具有重要意義。

作為儲備糧庫，主要使用了膠體金試紙條法、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和高效液相色譜法（HPLC）等方法檢測嘔吐毒素。膠體金試紙條法簡便快速，可用肉眼進(jìn)行定性分析，檢測成本低。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）對樣品純度要求不高，特異性強。以上兩種方法均屬于快速檢測法，不能準(zhǔn)確定量，易受到溫度等條件的影響，存在較大的誤差。高效液相色譜法（HPLC）定量準(zhǔn)確，對操作人員要求高且樣品處理比較復(fù)雜，儀器昂貴、檢測成本高、花費時間長、耗費溶劑較多，不適合大批量樣品的快速檢測。

根據(jù)GB 2761-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》要求，小麥中嘔吐毒素限量為≤1000μg/kg，糧食入庫作業(yè)時間緊、數(shù)量大，三種方法各有優(yōu)勢，如何區(qū)分使用是重點。本實驗通過對快速檢測法和HPLC法檢測小麥中嘔吐毒素的結(jié)果進(jìn)行比較，探索不同方法之間的差異性與相關(guān)性尋找快速檢測法可靠性范圍，合理使用快速檢測法和HPLC法，降低實驗成本，提高工作效率。

1材料與方法

1.1材料與試劑

試驗樣品：2017年產(chǎn)浙江小麥20份、2015年產(chǎn)山東小麥25份樣品。對照樣品：嘔吐毒素含量為（1137±20%）μg/kg。

嘔吐毒素免疫親和柱，嘔吐毒素ELISA檢測試劑盒，嘔吐毒素快速檢測試紙條（500～2000μg/kg）；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%；甲醇、乙腈，均為色譜級；聚乙二醇（相對分子質(zhì)量8000）；玻璃纖維濾紙，直徑llcm，孔徑1.5μm。

1.2儀器與設(shè)備

e2695高效液相色譜儀（配2489紫外檢測器）：美國Waters公司；HF4500酶標(biāo)儀：北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；HSE-24B固相萃取裝置：天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；MTN-2800W氮吹濃縮裝置：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；JFSD-100粉碎機：上海嘉定糧油儀器有限公司；HY-2調(diào)速多用振蕩器：常州國華電器有限公司。

1.3實驗方法

共進(jìn)行了5次實驗：每次實驗檢測9份試驗樣品、1份對照樣品，進(jìn)行1次加標(biāo)回收實驗。

1.3.1膠體金試紙條法

采用1000μg/kg的檢測限。稱取5.0g均質(zhì)樣本于具塞三角瓶中，加入20mL蒸餾水，充分震蕩5min，靜置過濾。移取50μL濾液加入樣品稀釋液2000μL，混勻后待檢。取出已恢復(fù)至室溫的微孔試劑和試紙條，用移液器取200μL待檢液于微孔試劑中，混勻，室溫孵育4min。將試紙條浸入微孔溶液中，室溫反應(yīng)5min，讀取結(jié)果。

1.3.2 ELISA法

稱取5.0g粉碎后的小麥樣品，加入25ml蒸餾水，200r/min振蕩10min，靜置3min后用定量濾紙過濾，取1ml濾液以蒸餾水1：4稀釋，手動搖勻后取50μL進(jìn)行分析。取出已恢復(fù)至室溫的微孔板和液體試劑，按照說明書的要求操作點樣。

檢測參數(shù)：設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm/630nm處檢測，讀取濃度。

1.3.3 HPLC法

采用GB 5009.111-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y定》第二法免疫親和層析凈化高效液相色譜法。

為避免樣品不均勻性導(dǎo)致的誤差，ELISA法和HPLC法采用同一份濾液。將濾液經(jīng)玻璃纖維濾紙過濾，移取2.5ml濾液過免疫親和柱，收集洗脫液，在50～60℃條件下氮吹近干，加入1mL流動相復(fù)溶，復(fù)溶液用0.22μm微孔濾器過濾后轉(zhuǎn)移至樣品瓶，準(zhǔn)備進(jìn)樣。

色譜柱：C18柱（柱長150mm）；流動相：甲醇+水（20+80）；流速；0.8mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：50μL；檢測波長：218nm。

1.3.4加標(biāo)回收實驗

為驗證前處理損失大小、檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，進(jìn)行了加標(biāo)回收實驗，標(biāo)準(zhǔn)品添加量為1000μg/kg。

2實驗結(jié)果

2.1對照樣品檢測和加標(biāo)回收實驗合國標(biāo)中回收率要求，實驗結(jié)果可靠。HPLC法和ELISA法最大偏差遠(yuǎn)低于國標(biāo)（HPLC法重現(xiàn)性≤23%，ELISA法重現(xiàn)性≤25%），兩種檢測方法均重現(xiàn)性良好。

2.2 ELISA-HPLC結(jié)果相關(guān)性

由圖1可知，兩種方法檢測結(jié)果的一致性較高，線性相關(guān)系數(shù)R=0.984 5。ELISA試劑盒法具有較高的準(zhǔn)確性，可以保證檢測結(jié)果的可靠性。

2.3臨界值樣品檢測結(jié)果

以HPLC檢測結(jié)果為劃分依據(jù)，對含量在臨界點附近的樣品匯總。其中，試紙條法檢測結(jié)果陰性以“一”表示，陽性以“+”表示。

由表2～表4可知，樣品DON含量<800μg/kg時，試紙條檢測結(jié)果呈陰性時，EHSA結(jié)果<1000μg/kg；樣品DON含量為800～900μg/kg時，試紙條結(jié)果呈陽性，ELISA結(jié)果在1000μg/kg上下浮動，存在誤差。樣品DON含量為900～1100μg/kg時，試紙條結(jié)果均呈陽性，ELISA在1000μg/kg上下浮動。樣品DON含量為1100～1300μg/kg時，試紙條結(jié)果均呈陽性，ELISA結(jié)果均>1000μg/kg。

3結(jié)論

試紙條法具有快速檢測、單個樣品檢測成本低等優(yōu)點，樣品數(shù)量少時可優(yōu)先采用此方法，以1000μg/kg為檢出限，若檢測結(jié)果呈陰性，結(jié)果可靠，判定合格。當(dāng)樣品數(shù)量大，可采用ELISA法，若檢測結(jié)果<1000μg/kg，判定合格；若ELISA檢測結(jié)果為1000～1300μg/kg，或試紙條法呈陽性，應(yīng)采用HPLC檢測法進(jìn)一步檢測DON含量。當(dāng)ELISA檢測結(jié)果>1300μg/kg時，可判定樣品DON含量超標(biāo)。