劉姝，李東奇，葉帆，張晶

(昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院骨科，昆明 650118)

骨腫瘤是一種發(fā)生于骨骼或附屬組織的腫瘤，分為良性和惡性兩種類型，惡性骨腫瘤發(fā)展迅速、預(yù)后較差、病死率高。惡性骨腫瘤分為原發(fā)性骨腫瘤和繼發(fā)性骨腫瘤，原發(fā)性骨腫瘤是指局部組織長出的惡性骨腫瘤，常見于多發(fā)性骨髓瘤(mutiple myeloma，MM)、骨肉瘤、骨巨細胞瘤。近年來，越來越多的學(xué)者將研究重心轉(zhuǎn)向靶向治療，隨著靶向治療的興起，原發(fā)性骨腫瘤的治療有了突破性進展，但也隨之出現(xiàn)了新的問題，如靶向藥物治療后發(fā)生耐藥[1]。靶向治療的重點在于找到發(fā)揮關(guān)鍵作用的細胞及分子靶點。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展往往是多種細胞、多個信號分子相互作用的結(jié)果。目前急需找到一種治療靶點來預(yù)測靶向藥物的治療效果，所以針對p62靶點進行設(shè)計的治療策略逐漸增多。p62是細胞內(nèi)的一種多功能接頭蛋白，包含多個功能結(jié)構(gòu)域，與不同蛋白結(jié)合后可發(fā)揮不同作用，在細胞各種正常生理活動中有重要功能，研究顯示下調(diào)p62蛋白表達能夠抑制腫瘤增殖或轉(zhuǎn)移[2-3]。目前已研發(fā)出p62的DNA疫苗(近年正在俄國進行Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗)，在動物模型中能明顯抑制多種腫瘤增殖及侵襲，且p62疫苗也可用于治療炎癥造成的骨質(zhì)疏松[4-6]。p62蛋白與原發(fā)性骨腫瘤的關(guān)系密切，但具體作用機制不明確?，F(xiàn)對p62蛋白及其在原發(fā)性骨腫瘤中作用機制的研究進展進行綜述，旨在為原發(fā)性骨腫瘤的治療提供新思路。

1 p62 蛋白

1.1p62基因結(jié)構(gòu)及其蛋白功能 人類p62基因，也被稱為SQSTM1，位于第5號染色體上的基因，包含8個外顯子，可編碼包含440個氨基酸殘基的p62蛋白[7]。這些氨基酸序列包括Phox 和Bem1p結(jié)構(gòu)域、鋅指結(jié)構(gòu)域、p38結(jié)合結(jié)構(gòu)域、腫瘤壞死因子相關(guān)受體6結(jié)合結(jié)構(gòu)域、核定位信號和核輸出信號、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3相互作用結(jié)構(gòu)域、Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相互作用區(qū)域、泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域等帶有結(jié)構(gòu)性模體的結(jié)構(gòu)域。最初p62蛋白被發(fā)現(xiàn)是一種淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶[8]，現(xiàn)可作為非經(jīng)典蛋白激酶C的結(jié)合伴侶[9]。p62蛋白分子結(jié)構(gòu)中有多個功能結(jié)構(gòu)域，可通過與其他蛋白質(zhì)的相互作用來調(diào)控不同的信號通路，包括核因子E2相關(guān)因子(nuclear factor erythroid 2 related factor,Nrf)2、核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)和自噬等，參與細胞癌變過程[10-12]。

1.2p62蛋白與腫瘤的發(fā)生發(fā)展 近年來，許多研究顯示p62蛋白與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展主要表現(xiàn)在增殖、遷移及侵襲，p62蛋白可以影響多種腫瘤的增殖、遷移和侵襲來調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13-16]。腫瘤p62蛋白功能結(jié)構(gòu)域泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域與微管相關(guān)蛋白1輕鏈3相互作用結(jié)構(gòu)域突變體調(diào)節(jié)自噬通量并減弱胱天蛋白酶8的激活，在卵巢癌細胞中,自噬降解參與p62蛋白介導(dǎo)的胱天蛋白酶8激活[13]。p62蛋白在食管癌組織中高表達，p62蛋白在miR-487a敲除后顯著上調(diào)，p62蛋白過表達顯著改變了小鼠的增殖能力[14]。Iwadate等[15]通過對194例原位子宮內(nèi)膜癌患者進行免疫組織化學(xué)及統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，高表達的p62蛋白參與了子宮內(nèi)膜癌細胞的侵襲，細胞質(zhì)p62蛋白的高表達有助于提高子宮內(nèi)膜癌細胞對氧化應(yīng)激的侵襲性和耐受性。小核仁RNA宿主基因16作為一種致癌長鏈非編碼RNA，通過調(diào)節(jié)p62蛋白表達，進而激活下游磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白和NF-κB信號通路，促進肝癌細胞增殖、遷移和侵襲[16]。p62蛋白主要位于細胞質(zhì)，在腫瘤組織中表達水平較高，部分惡性腫瘤細胞質(zhì)中p62蛋白的積累預(yù)示著預(yù)后較差[17]。目前，對于p62蛋白調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制尚無統(tǒng)一說法，普遍認為p62是一種多功能蛋白，可通過自噬、Nrf2、NF-κB等多種信號通路調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[18]。首先，受體蛋白p62與選擇性自噬密切相關(guān)，p62蛋白的積累對腫瘤的發(fā)生至關(guān)重要，在肝癌中p62是一種異常積累的致癌蛋白，過表達可誘導(dǎo)肝癌并增加小鼠的腫瘤體積[2,19]。此外，自噬基因的敲除已被作為自噬的生理模型，缺乏必需自噬相關(guān)基因5和7的小鼠也會發(fā)生肝損傷、炎癥和不能進展為癌的良性肝腫瘤[20]。其次，Saito等[21]研究表明，p62蛋白的Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1結(jié)構(gòu)域結(jié)合Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1后阻礙Nrf2的激活，并增加肝癌對抗癌藥物的敏感性，而且NF-κB負調(diào)節(jié)激活與癌癥相關(guān)[22-23]。已有研究證實，NF-κB可通過影響腫瘤的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)腫瘤的惡性行為，介導(dǎo)促腫瘤生成相關(guān)基因的表達參與抗凋亡及細胞周期的調(diào)節(jié)[24-25]。綜上，p62蛋白與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，但具體機制仍不明確，可能是因為p62蛋白具有多個功能結(jié)構(gòu)域，與不同信號分子相互作用所致。

1.3p62蛋白與骨代謝 骨新陳代謝的維持依賴于骨的吸收與骨形成之間的動態(tài)平衡，而這種平衡由成骨細胞和破骨細胞共同維持，其中破骨細胞在生理性和病理性骨吸收中發(fā)揮重要作用，有研究表明p62蛋白可通過平衡破骨與成骨細胞生成和限制炎癥減輕骨代謝紊亂[6,26]。大多數(shù)原發(fā)性骨腫瘤都表現(xiàn)出溶骨性，長期以來，p62蛋白被認為是破骨細胞形成和活化的重要調(diào)節(jié)劑，適配器蛋白質(zhì)p62蛋白參與NF-κB受體活化因子配體促進破骨細胞的形成、自噬或NF-κB通路激活[27]。p62基因突變被認為是Paget骨病(Paget disease of bone，PDB)的主要原因，PDB是由溶骨性病變和過度活性破骨細胞表征的骨骼疾病[28-29]。PDB突變主要發(fā)生于泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域，常見突變位點為p62p394L，唑來膦酸在p62p394L的PDB小鼠模型中可預(yù)防PDB并加速骨丟失[30]。p62基因缺陷在體外加速破骨細胞形成，并導(dǎo)致小鼠PDB骨表型[31]。

2 p62蛋白與原發(fā)性骨腫瘤的關(guān)系

2.1p62蛋白與MM MM是一種以單克隆蛋白產(chǎn)生和溶解性骨病為特征的漿細胞惡性腫瘤。研究證實p62蛋白在MM進展中起重要作用[32]。骨髓微環(huán)境中的MM細胞可以增加破骨細胞的分化，造成骨損傷[33]。有文獻報道通過XRK3F2(一種p62鋅指結(jié)構(gòu)域抑制劑)阻斷p62鋅指結(jié)構(gòu)域依賴信號可以逆轉(zhuǎn)MM誘導(dǎo)的Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2抑制的表觀遺傳學(xué)機制，促進成骨分化[34]。鋅指結(jié)構(gòu)域與受體相互作用蛋白結(jié)合后，能夠傳感下游通過經(jīng)典蛋白激酶C激活NF-κB[35]。目前普遍認為p62蛋白可通過調(diào)節(jié)NF-κB通路導(dǎo)致MM，研究表明蛋白酶體抑制劑硼替佐米可通過NF-κB治療靶點發(fā)揮作用[36]。有學(xué)者認為，阻止硼替佐米誘發(fā)的NF-κB激活可阻斷氯喹誘發(fā)自噬，減少核轉(zhuǎn)錄因子抑制蛋白退化和增強硼替佐米誘發(fā)淋巴瘤細胞的死亡[37]。NF-κB主要用于維持MM細胞生存，核轉(zhuǎn)錄因子抑制蛋白激酶復(fù)合物2抑制劑苯胺嘧啶衍生物AS602868能抑制NF-κB激活，誘導(dǎo)人MM細胞系的凋亡和阻斷細胞周期進展以及抑制原發(fā)性MM細胞的存活，核轉(zhuǎn)錄因子抑制蛋白激酶復(fù)合物2抑制劑苯胺嘧啶衍生物AS602868單獨使用或與傳統(tǒng)藥物聯(lián)合使用，對MM患者有一定治療價值[38]。也有報道顯示，在MM新型LP-1細胞株的耐卡非佐米衍生物中p62泛素結(jié)合物受體水平升高與卡非佐米耐藥有關(guān)，包括生存前自噬和Nrf2通路激活，闡明了MM細胞中蛋白穩(wěn)定網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，并為開發(fā)p62-Nrf2抑制劑作為克服晚期MM亞組患者蛋白酶體抑制劑耐藥性的手段提供了臨床前理論依據(jù)[39]。也有研究表明，Beclin-1和p62之間表達平衡對于MM細胞的存活非常關(guān)鍵，可以初步評估細胞對凋亡的敏感性，并且在體外自噬可以作為一種促進MM細胞存活的機制，平衡藥物誘導(dǎo)的細胞死亡[40]。蛋白酶體抑制劑卡非佐米的耐藥性與生存前自噬水平升高有關(guān)，而人鋅指轉(zhuǎn)錄因子Krüppel樣因子4(Krüppel-like factor 4，KLF4)被認為是促進因素，在獲得性卡非佐米耐藥的MM細胞中，KLF4蛋白的表達水平和核定位均升高，染色質(zhì)免疫沉淀表明內(nèi)源性KLF4與p62基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，該啟動子區(qū)域編碼連接蛋白酶體和自噬蛋白降解途徑的泛素結(jié)合適配器蛋白隔離體p62[41]。然而，干擾p62信使RNA的表達導(dǎo)致自噬體無法捕獲MM細胞中的泛素化載體，將生存前自噬轉(zhuǎn)化細胞凋亡[42]。p62蛋白或自噬基因γ氨基丁酸A受體結(jié)合蛋白1的下調(diào)降低了蛋白酶體抑制后的細胞存活率，p62蛋白的誘導(dǎo)需要Nrf1，同時誘導(dǎo)蛋白酶體基因，暴露于蛋白酶體抑制劑20 h后，細胞通過Nrf1獨立機制激活自噬和大多數(shù)自噬基因[32]。研究表明，p62蛋白豐度的降低可導(dǎo)致細胞內(nèi)ATP顯著減少、毒性顯著、凋亡和集落形成，沉默p62蛋白的MM細胞系在2周內(nèi)徹底死亡，相反，作為對照的2B淋巴瘤中p62蛋白的表達相對減少，導(dǎo)致相應(yīng)細胞系很少或幾乎沒有死亡，細胞死亡前p62沉默的MM細胞系顯著增加了對硼替佐米誘導(dǎo)的泛素化蛋白和毒性的敏感性，而且p62的減少沒有影響?yīng)毺氐目构撬枇鏊幬锇⒚顾?，說明p62蛋白在MM細胞系存活中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并對蛋白酶體抑制劑產(chǎn)生特異性保護[43]。p62蛋白對于MM細胞系至關(guān)重要，是一種新的特異的骨髓瘤靶點，可能通過NF-κB信號通路或Nrf2或自噬通路發(fā)揮作用。

2.2p62蛋白與骨肉瘤 骨肉瘤是最常見的惡性骨腫瘤，好發(fā)于兒童和青少年，肺轉(zhuǎn)移最常見。目前關(guān)于p62蛋白在骨肉瘤中表達程度以及通路仍存在爭議。有學(xué)者采用免疫組織化學(xué)方法檢測70例骨肉瘤石蠟樣本，結(jié)果顯示p62蛋白在77.1%(54/70)的樣本中存在過表達，并且表達水平與腫瘤大小、轉(zhuǎn)移、臨床分期、預(yù)后不良顯著相關(guān)[44]。另一項研究顯示，p62蛋白的表達水平可能與骨肉瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、預(yù)后密切相關(guān)，與原發(fā)性腫瘤組織相比，復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性組織中p62蛋白表達降低[45]。兩項研究中p62蛋白表達程度不同的原因可能是：前一項研究發(fā)現(xiàn)，在人類骨肉瘤細胞中，p62信使RNA和蛋白水平均上調(diào)，表明該蛋白調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平。后一項研究發(fā)現(xiàn)，在化療過程中自噬活動會增強，p62可能作為一種自噬相關(guān)蛋白，而自噬系統(tǒng)不斷降解p62?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2和MMP-9已被多項研究證實，可在骨肉瘤中通過降解細胞外基質(zhì)和基膜的成分促進骨肉瘤細胞遷移和侵襲[46-48]。Yu等[49]研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素通過抑制骨肉瘤細胞中磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/NF-κB信號通路下調(diào)MMP-2和MMP-9表達，負向調(diào)節(jié)骨肉瘤的侵襲及增殖，由此推測p62蛋白可能通過NF-κB信號通路在骨肉瘤中發(fā)揮作用。而雷公藤紅素也可以通過自噬調(diào)節(jié)骨肉瘤細胞凋亡[50]。近年來，越來越多的骨肉瘤新治療策略聚焦于調(diào)節(jié)失調(diào)的自噬[51-52]。巴西蘇木素通過誘導(dǎo)自噬促進骨肉瘤細胞死亡，華蟾素通過活性氧類/c-Jun氨基端激酶/p38促分裂原活化的蛋白激酶信號通路誘導(dǎo)人骨肉瘤U2OS細胞自噬介導(dǎo)細胞死亡，三氧化二砷也可通過活性氧類轉(zhuǎn)錄因子EB信號通路誘導(dǎo)骨肉瘤細胞自噬性死亡[53-55]。氯喹可通過調(diào)節(jié)p62蛋白的表達阻斷順鉑耐藥骨肉瘤細胞的自噬過程[56]。自噬可以抑制阿霉素誘導(dǎo)的骨肉瘤細胞凋亡，在骨肉瘤U2OS和Saos-2細胞系中，自噬抑制可能是增加抗癌藥物有效性的一種新策略[57]。綜上，p62蛋白可能通過NF-κB信號通路或自噬來調(diào)節(jié)骨肉瘤發(fā)病。

2.3p62蛋白與骨巨細胞瘤 骨巨細胞瘤是一種交界性且具有局部侵襲性的骨腫瘤，特征為溶骨性病變，常見于股骨遠端和脛骨近端，骨巨細胞瘤單獨手術(shù)后復(fù)發(fā)率高達16.7%～39%，其中1%～3.2%可發(fā)生肉瘤樣變或肺轉(zhuǎn)移[58-61]。骨巨細胞瘤是溶骨性腫瘤，關(guān)鍵發(fā)病機制是破骨細胞活化[62]。長期以來，人們一直認為p62蛋白是破骨細胞形成和激活的重要調(diào)節(jié)劑。銜接蛋白p62通過自噬或NF-κB途徑參與NF-κB受體活化因子配體誘導(dǎo)的破骨細胞的生成和的激活[27]。因此，p62蛋白可能通過激活自噬或NF-κB通路調(diào)控骨巨細胞瘤發(fā)病。

3 小 結(jié)

目前原發(fā)性骨腫瘤的治療仍然依賴于手術(shù)、化療和靶向治療，隨著化療及靶向治療藥物的耐藥性及不良反應(yīng)的出現(xiàn)，對于晚期腫瘤及復(fù)發(fā)患者的治療仍然存在瓶頸。p62是一種多功能接頭蛋白，與不同的重要信號分子結(jié)合發(fā)揮不同的作用，在腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，還可通過p62-Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1-Nrf2通路、NF-κB通路、自噬通路中一種或多種通路發(fā)揮作用，但具體機制仍不明確，生物學(xué)作用及意義仍需進一步研究。目前p62的靶向治療已成為腫瘤治療的研究熱點，在多中心Ⅰ/Ⅱa臨床試驗中，已報道p62疫苗單次或聯(lián)合化療可使晚期實體腫瘤患者在8～32周內(nèi)獲得44%(12/27)的疾病穩(wěn)定狀態(tài)[63]。因此，p62蛋白有望成為原發(fā)性骨腫瘤發(fā)病的預(yù)測指標(biāo)，為原發(fā)性骨腫瘤治療提供新的思路，但仍需更多臨床試驗證實。