羅金，孫發(fā)

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，貴陽 550004； 2.貴州省人民醫(yī)院泌尿外科，貴陽 550002)

近年來塑料制品中增塑劑超標(biāo)事件時(shí)有發(fā)生，增塑劑可顯著提高塑料的延展性、強(qiáng)度及穩(wěn)定性，被廣泛添加到化妝品、產(chǎn)品外包裝、醫(yī)藥器械、餐飲器具和建筑裝修材料中[1]。鄰苯二甲酸二-2-乙基己酯[di(2-ethylhexyl) phthalate，DEHP]作為一種常見的增塑劑具有親脂特性，容易從產(chǎn)品中析出并持久地存在于大氣、土壤、水乃至食物中[2-4]。環(huán)境中DEHP可通過多種途徑進(jìn)入生物體內(nèi)，穿透胎盤屏障或直接進(jìn)入母乳，發(fā)揮抗雄激素作用，對(duì)雄性生殖系統(tǒng)造成損傷。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，孕鼠在接受DEHP暴露后出現(xiàn)孕期縮短，其仔鼠出現(xiàn)生殖發(fā)育滯后和延遲[5]。在人睪丸體外試驗(yàn)中，DEHP及其次級(jí)代謝產(chǎn)物鄰苯二甲酸單乙基己基酯也同樣被證實(shí)可對(duì)睪酮產(chǎn)生一定的抑制效應(yīng)[6]。此外，DEHP還可通過蓄積于體內(nèi)脂肪含量較高的組織器官內(nèi)對(duì)生殖系統(tǒng)造成持續(xù)損傷。H?yer等[7]的研究指出，DEHP可損傷生殖細(xì)胞，間接影響垂體性腺軸的反饋，降低睪酮的生成和分泌以及精液質(zhì)量。青春期前后雄性大鼠的生殖結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常，睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖能力和血清內(nèi)睪酮含量降低，最終導(dǎo)致幼鼠雌性樣變和睪丸發(fā)育不全綜合征[8]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，孕期和哺乳期暴露可致雄性仔鼠的附屬生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育異常(前列腺、提肛肌以及球狀海綿體重量降低)[9]。現(xiàn)就DEHP引起生殖損傷機(jī)制的研究進(jìn)展予以綜述。

1 對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的損傷機(jī)制

從青春期開始，睪丸間質(zhì)細(xì)胞受垂體前葉嗜堿粒細(xì)胞分泌的間質(zhì)細(xì)胞刺激素——黃體生成素的影響可合成分泌雄性激素，促進(jìn)精子的發(fā)生和雄性生殖器官的發(fā)育，維持第二性征和性功能。睪酮合成需要膽固醇為原料，而間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的膽固醇跨線粒體膜轉(zhuǎn)運(yùn)是影響睪酮生成的關(guān)鍵步驟。類固醇激素合成快速調(diào)節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory protein，StAR)在調(diào)節(jié)膽固醇從線粒體外膜轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)膜的過程中起重要作用，當(dāng)膽固醇進(jìn)入線粒體后，則由催化膽固醇同時(shí)兼有轉(zhuǎn)運(yùn)作用的細(xì)胞色素P450將其轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮，再經(jīng)17-羥化酶加工成睪酮前體——雄烯二酮[8]。研究發(fā)現(xiàn)，DEHP可直接導(dǎo)致間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)凋亡細(xì)胞Bax和胱天蛋白酶3的表達(dá)增加，從而直接影響睪酮的合成與分泌；另外，DEHP可造成小鼠間質(zhì)細(xì)胞凋亡，形態(tài)學(xué)上發(fā)生變化，凋亡細(xì)胞比例以及凋亡指數(shù)均升高[10]。其次，Lin等[11]對(duì)大鼠宮內(nèi)暴露的研究發(fā)現(xiàn)，DEHP可致間質(zhì)細(xì)胞中參與轉(zhuǎn)運(yùn)的StAR蛋白以及睪酮合成基因的表達(dá)降低，處于胚胎期的睪丸間質(zhì)細(xì)胞雖然可出現(xiàn)聚集，但參與StAR蛋白以及催化膽固醇和類固醇合成的單加氧酶(HSD17b12、CYP17a1、HSD17b3)的表達(dá)顯著降低，間接導(dǎo)致睪丸內(nèi)睪酮水平顯著降低，由此認(rèn)為高水平DEHP暴露可致睪酮水平降低。但Zhang等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，低劑量DEHP暴露大鼠的血清睪酮水平反而呈升高趨勢，通過低劑量DEHP暴露，大鼠血清內(nèi)睪酮和黃體生成素的含量均升高，同時(shí)還觀察到CYP17a1等相關(guān)酶類的活性顯著增高。此外，長期低劑量DEHP暴露還可能誘發(fā)間質(zhì)細(xì)胞腫瘤的發(fā)生[13]。說明DEHP對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的影響復(fù)雜多樣，可能與暴露時(shí)間、暴露物濃度以及劑量相關(guān)，還有待進(jìn)一步深入的研究。

睪酮由間質(zhì)細(xì)胞生成，而睪丸間質(zhì)細(xì)胞膜上的G蛋白偶聯(lián)受體——黃體生成素受體與垂體前葉分泌的黃體生成素高度親和，使得睪丸間質(zhì)細(xì)胞類固醇類激素受下丘腦-垂體-睪丸軸(hypothalamus-pituitary-testicular axis，HPTA)負(fù)反饋調(diào)控，導(dǎo)致HPTA平衡被打破[14-15]。有研究證實(shí)，DEHP可引起間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)StAR、細(xì)胞色素P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶反饋抑制下丘腦功能，降低垂體的敏感性，致使整個(gè)性腺軸分泌紊亂[16-17]。DEHP及其次級(jí)代謝產(chǎn)物鄰苯二甲酸單乙基己基酯在睪丸水平影響睪酮的生成，睪酮的降低將減少對(duì)HPTA的負(fù)反饋?zhàn)饔?，從而引起黃體生成素釋放增加。但國外文獻(xiàn)顯示，DEHP的這種損傷途徑并未在人體得到證實(shí)，即睪酮水平降低并未導(dǎo)致黃體生成素增加[7]。這種不一致的結(jié)論說明DEHP可能只是影響人體類固醇激素生成的一種較弱的內(nèi)分泌干擾物質(zhì)，其機(jī)制可能是DEHP激活了雄激素受體，致使垂體負(fù)反饋增加，從而降低黃體生成素的分泌。因此，僅通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)難以解釋DEHP對(duì)HPTA造成的影響，還需進(jìn)一步研究DEHP對(duì)人體HPTA造成干擾的具體作用機(jī)制。

另外，有報(bào)道認(rèn)為，DEHP還能抑制仔鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)胰島素因子3(insulin-like factor 3，INSL-3)的表達(dá)，從而造成生殖損傷[9]。INSL-3是由睪丸間質(zhì)細(xì)胞生成和分泌的一種小肽類激素，在維持睪丸正常功能和誘導(dǎo)睪丸下降方面具有重要作用。INSL-3表達(dá)異?？蓪?dǎo)致生殖發(fā)育異常，增加罹患睪丸下降不全和隱睪等疾病的風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)，還能夠造成轉(zhuǎn)化生長因子-β、類固醇合成相關(guān)酶(CYP19a1、CYP11a1)以及參與氧化應(yīng)激的血紅素加氧酶1的表達(dá)障礙，通過抑制細(xì)胞分化、阻礙膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)、增加氧化應(yīng)激等多種途徑影響睪酮的合成分泌，增加睪丸發(fā)育不全綜合征和尿道下裂等疾病的發(fā)生率[9,18]。然而，DEHP對(duì)INSL-3的抑制機(jī)制目前尚不明確，H?yer等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，INSL-3表達(dá)異常并未影響睪酮的合成分泌。但具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)行充分的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，為后期轉(zhuǎn)化提供理論基礎(chǔ)。

2 對(duì)睪丸支持細(xì)胞的損傷機(jī)制

睪丸支持細(xì)胞對(duì)于睪丸生精過程起著不可替代的作用，通過形成血睪屏障(blood testis barrier，BTB)為生精細(xì)胞提供分化、發(fā)育的微環(huán)境，同時(shí)可避免其發(fā)生自身免疫反應(yīng)[19-20]。另外，支持細(xì)胞還可提供精子發(fā)育所需的促性腺激素，且支持細(xì)胞還能生成雄激素結(jié)合蛋白，而雄激素結(jié)合蛋白可使雄激素恒定釋放，避免睪酮分泌的晝夜波動(dòng)性對(duì)精子的生成和成熟造成不利的影響[20-21]。此外，支持細(xì)胞還具備吞噬功能，防止有害物質(zhì)干擾精子的生成，對(duì)維持曲細(xì)精管管腔內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要意義。

BTB又稱支持細(xì)胞生精上皮屏障，是相鄰的支持細(xì)胞通過緊密、間隙和貼壁的連接方式形成的一種特殊膜結(jié)構(gòu)，為精原細(xì)胞提供營養(yǎng)支持并參與精子發(fā)生，可避免抗精子抗體和自身免疫反應(yīng)造成的不良反應(yīng)[21]。BTB對(duì)精子的保護(hù)作用取決于支持細(xì)胞的形態(tài)和功能[22]。研究發(fā)現(xiàn)，支持細(xì)胞是DEHP致睪丸生殖損傷的靶細(xì)胞，通過抑制支持細(xì)胞增殖，破壞其結(jié)構(gòu)，影響支持/生精細(xì)胞間能量傳遞，導(dǎo)致生精細(xì)胞排列紊亂，進(jìn)而影響B(tài)TB的完整性，最終導(dǎo)致精子的發(fā)生發(fā)育障礙[23]。DEHP暴露后可通過抑制細(xì)胞周期蛋白D1的轉(zhuǎn)錄影響支持細(xì)胞增殖；同時(shí)可降低與連接有關(guān)的神經(jīng)鈣黏素、緊密連接蛋白(Claudin-11、Occludin、Zo-1)、縫隙連接蛋白43(Connexin-43)等的表達(dá)，起到抑制支持細(xì)胞相互連接的效果，從而破壞BTB的完整性，影響生精過程[23-25]。另有研究發(fā)現(xiàn)，DEHP還可通過激活細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激途徑，生成過量活性氧類(reactive oxygen species，ROS)，從而激活促分裂原活化的蛋白激酶信號(hào)通路，破壞BTB[26-27]。經(jīng)DEHP暴露后，支持細(xì)胞內(nèi)ROS顯著升高，抗氧化應(yīng)激蛋白核因子E2相關(guān)因子2的表達(dá)也顯著升高，而主要參與連接的Occludin蛋白、Connexin-43蛋白的表達(dá)顯著降低[27]。由此可見，DEHP通過影響細(xì)胞增殖和氧化應(yīng)激的方式導(dǎo)致連接蛋白無法形成BTB以維持正常的生精過程。

DEHP對(duì)支持細(xì)胞的損傷是多途徑、多方面的，除了破壞BTB完整性外，DEHP還能通過損傷支持細(xì)胞線粒體影響生精過程。線粒體可影響ATP的生成，ATP為有絲分裂和減數(shù)分裂以及染色體活性提供能量，而DEHP可使細(xì)胞內(nèi)ATP的生成量減少25%[28-29]。一方面，DEHP通過氧化應(yīng)激途徑以及過量的ROS影響三羧酸循環(huán)和電子傳遞鏈來減少ATP的生成[30]；Lu等[31]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DEHP處理小鼠線粒體內(nèi)ROS水平升高，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體損傷；卵母細(xì)胞中的ATP水平降低，導(dǎo)致能量代謝障礙，改變了精子流動(dòng)性和卵母細(xì)胞受精機(jī)制[32]。另一方面，DEHP還可影響煙酰胺腺嘌呤二核苷酸水平，造成線粒體功能障礙。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸在糖酵解、糖異生、三羧酸循環(huán)以及呼吸鏈中發(fā)揮著不可替代的作用，有調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老和維持機(jī)體正常運(yùn)轉(zhuǎn)功能[30]。然而，DEHP可降低煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，使凋亡基因(Bax)等活化，誘發(fā)線粒體DNA位點(diǎn)突變[33-34]。Fu等[33]研究發(fā)現(xiàn)，DEHP可引起線粒體膜電位崩潰，使細(xì)胞內(nèi)凋亡/自噬失衡，并誘導(dǎo)釋放細(xì)胞色素C，造成嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng)。同樣，李雪蕓[34]通過檢測DEHP干預(yù)后睪丸中p53蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)大量凋亡的支持細(xì)胞，并證實(shí)DEHP可增加Bax表達(dá)，同時(shí)抑制Bcl-2的表達(dá)，誘導(dǎo)支持細(xì)胞凋亡，使支持細(xì)胞無法為生精細(xì)胞提供足夠的物質(zhì)和代謝支持，從而影響生精過程，不利于生精細(xì)胞的分化、發(fā)育。此外，DEHP還可通過抑制雄激素結(jié)合蛋白的表達(dá)，影響睪酮的有效水平，干擾精子的發(fā)生與成熟[35]。由此可見，DEHP通過多途徑損傷支持細(xì)胞，干擾相關(guān)基因的表達(dá)，最終造成生殖損傷。

3 對(duì)生精細(xì)胞的損傷機(jī)制

生精細(xì)胞包括精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子。生精實(shí)質(zhì)上是一個(gè)連續(xù)的分化發(fā)育過程，稱為精子發(fā)生。而DEHP通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對(duì)生精細(xì)胞造成損傷，表現(xiàn)為生精細(xì)胞數(shù)量減少、精子活力下降以及畸形率升高等方面[36]。

氧化應(yīng)激效應(yīng)作為對(duì)生精細(xì)胞損傷的核心機(jī)制，可對(duì)精子的DNA造成損傷。而DEHP作為一種過氧化物酶體增殖劑，通過改變硫氧還原蛋白氧化還原酶、谷胱甘肽過氧化物酶的表達(dá)水平以及過氧化物酶體增殖物激活受體途徑打破氧化平衡，引起生精細(xì)胞氧化損傷[36-37]。一方面產(chǎn)生大量ROS直接攻擊精子線粒體DNA，由于精子線粒體自我修復(fù)能力較弱且缺乏相關(guān)蛋白的保護(hù)，當(dāng)受到ROS攻擊時(shí)，很容易造成線粒體DNA的變異、斷裂[18]。另一方面則是ROS對(duì)精核DNA進(jìn)行損傷，DEHP誘導(dǎo)產(chǎn)生過多的ROS會(huì)導(dǎo)致精子膜內(nèi)的脂肪酸過氧化反應(yīng)，而睪丸內(nèi)又缺乏清除ROS的相關(guān)酶，導(dǎo)致精子膜的流動(dòng)性下降，使內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變，造成精核DNA變異、斷裂，從而影響精子的功能以及與卵母細(xì)胞的受精過程，導(dǎo)致不育[31,37-38]。研究表明，氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡，在睪丸組織中生精是一復(fù)雜的細(xì)胞分化過程，有賴于細(xì)胞的凋亡和增殖的平衡；而凋亡率的改變可能導(dǎo)致精子發(fā)生的中斷，實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，處于快速分裂期的生精細(xì)胞DNA受到DEHP抑制，線粒體凋亡途徑被激發(fā)，破壞呼吸鏈，進(jìn)而影響線粒體的正常功能[39]。孕期使用DEHP干預(yù)后，在出生的雄性幼鼠睪丸組織中觀察到，Bax基因的表達(dá)水平顯著升高，而Bcl-2基因的表達(dá)受到抑制[18]。國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，DEHP誘導(dǎo)產(chǎn)生過量ROS對(duì)生精細(xì)胞線粒體DNA氧化應(yīng)激損傷可能還具有隔代遺傳效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，第3代小鼠精原細(xì)胞的功能較前兩代的損傷更加嚴(yán)重，導(dǎo)致精曲小管形態(tài)異常，生精細(xì)胞脫落，畸形精子增多，精子活力降低[40]。而伴隨著畸形率和凋亡率上升，精母細(xì)胞也開始出現(xiàn)異常增大和多核化改變[41]。

4 小 結(jié)

DEHP作為一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物可對(duì)嚙齒類動(dòng)物的雄性生殖系統(tǒng)造成不同程度的損傷，但目前已知的毒理學(xué)效應(yīng)和生殖損傷機(jī)制是否同樣適用于人類還需進(jìn)一步研究證實(shí)。人類在享受工業(yè)革命成果的同時(shí)，也無時(shí)無刻地面臨著DEHP暴露。目前DEHP對(duì)人體的研究仍存在一定的局限性。在今后的研究中，一方面應(yīng)在擴(kuò)大樣本采集量，區(qū)分人群分布環(huán)境、生活方式所造成的暴露誤差的同時(shí)，重視流行病學(xué)調(diào)查，從而提高數(shù)據(jù)的嚴(yán)謹(jǐn)性；另一方面，對(duì)DEHP的相關(guān)毒理機(jī)制進(jìn)行全方位、深層次的研究，為預(yù)防和減少人類生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病提供理論依據(jù)。