郭蕊，王冰清，王悅，章慶國(guó)

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院整形外科醫(yī)院整形四科，北京 100144)

脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)由Zuk等[1]于2001年首次通過免疫熒光技術(shù)和流式細(xì)胞技術(shù)從脂肪組織中分離并提取出來，是一類能夠自我更新、具有多向分化潛能的成體間充質(zhì)干細(xì)胞。300 mL脂肪組織中可獲得(2～3)×108個(gè)ADSCs，較骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞多100～1 000倍[2]。人體脂肪組織具有含量高、來源廣、取材容易、干細(xì)胞含量高、易于分離純化、切取后對(duì)供區(qū)損傷小、能自體移植且倫理問題少等優(yōu)點(diǎn)。ADSCs具有增殖速度快、多項(xiàng)分化潛能、免疫調(diào)節(jié)作用、新生血管生成和修復(fù)機(jī)制等特點(diǎn)，非常適合臨床應(yīng)用。再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，特別是ADSCs、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞等的發(fā)現(xiàn)，為將自體干細(xì)胞移植作為再生療法的應(yīng)用創(chuàng)造了更多機(jī)會(huì)[3]。除減少皺紋形成和補(bǔ)充軟組織容量外，ADSCs及其治療可能是抵抗衰老的又一研究方向。自2008起，ADSCs不僅在體外顯示出生物細(xì)胞的再生潛力，在臨床病例中也可顯著改善皮膚質(zhì)量[4]。衰老是人體自然衰變的過程，皮膚老化是其外部表現(xiàn)，分為自然老化與光老化，可表現(xiàn)為皮膚失去彈性、皺紋形成、皮脂腺汗腺分泌減少、膠原合成減少、皮膚中活性氧自由基沉積等[5]，這一過程主要由內(nèi)在因素(基因、激素)和外在因素(紫外線、吸煙)造成[6]。而隨著生活水平的提高，人們對(duì)美的追求也隨之提高。其中，面部抗衰老分為預(yù)防性延緩衰老和治療性改善衰老，后者稱為“年輕化”。目前，隨著再生醫(yī)學(xué)在臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的加速，許多再生醫(yī)學(xué)技術(shù)，如ADSCs、富血小板血漿和自體成纖維細(xì)胞等在面部年輕化的治療方面取得了良好療效，包括改善黑眼圈、頰袋及輔助重瞼術(shù)[7]。現(xiàn)就ADSCs在面部年輕化中的研究進(jìn)展予以綜述。

1 ADSCs的生理特性

ADSCs具有異質(zhì)性，其形態(tài)類似于成纖維細(xì)胞，由一個(gè)大內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞核組成。目前雖尚未能鑒定出其具有的特殊標(biāo)記，但其表達(dá)的抗原與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞類似，如CD10、CD13、CD29、CD34、CD44、CD54、CD71、CD49B、CD90、CD105、CD117和STRO-1。同時(shí)，ADSCs在脂肪組織中的位置也難以確定。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)ADSCs位于血管周圍，但不表達(dá)造血標(biāo)志物，如CD14、CD16、CD31、CD45、CD56、CD61、CD62E、CD104、CD106、CD144，以及內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物(CD31、CD144和血管假性血友病因子)[8-10]。此外，ADSCs也是免疫原性降低的特許細(xì)胞，即無人類白細(xì)胞DR抗原的表達(dá)[11]。

在適當(dāng)條件下，ADSCs也可分化為軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及上皮細(xì)胞等。特別是某些生長(zhǎng)因子可作用于ADSCs，使其刺激周圍細(xì)胞，分化為特定細(xì)胞[12-14]。研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs對(duì)皮膚表皮干細(xì)胞的激活是必需的[15]，且外源性給予ADSCs也可動(dòng)員其他干細(xì)胞，如毛囊隆起區(qū)域的表皮干細(xì)胞，此激活作用是基于各種生長(zhǎng)因子的分泌，如表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-β、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor，TGF)-β、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α和多種細(xì)胞因子[白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6、IL-8、IL-11、IL-12和TGF-α][9,12，14]。同時(shí)，上述生長(zhǎng)因子也可控制ADSCs周邊細(xì)胞的生存、凋亡，促進(jìn)血管生成，增生遷移成纖維細(xì)胞，合成膠原蛋白，從而有效保護(hù)真皮內(nèi)成纖維細(xì)胞，減少紫外線及化學(xué)因素等引起的氧自由基[16-17]。

2 ADSCs在面部年輕化中的作用機(jī)制

面部年輕化是面部美學(xué)中迅速發(fā)展的一個(gè)領(lǐng)域，主要目的是糾正衰老容顏所呈現(xiàn)的組織松弛、移位。除通過手術(shù)或非手術(shù)等方法補(bǔ)充面部丟失的體積，撫平皺紋，改善色素沉著和毛孔粗大等外，人們更希望能從根本上修復(fù)和替換有病變和缺陷的細(xì)胞或組織，而ADSCs可能在其中發(fā)揮重要作用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，研究發(fā)現(xiàn)將ADSCs注射于無毛小鼠背部皮下后，皮膚組織中的CD31、周細(xì)胞神經(jīng)元-膠質(zhì)抗原2含量增加，表明血管生成較前增加，證實(shí)ADSCs具有抗衰老作用。同時(shí)還觀察到，小鼠背部皮膚的真皮層厚度增加，成纖維細(xì)胞的數(shù)量以及Ⅰ型膠原蛋白的合成增多[18-19]。Xie等[20]發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)VEGF的ADSCs不僅可促進(jìn)與ADSCs自身相關(guān)的衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶、p21和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)1表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)紫外線照射后損傷創(chuàng)面的愈合及上調(diào)成纖維細(xì)胞和創(chuàng)面中Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)，還可抑制由紫外線損傷造成的成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯，防止紫外線照射引起皮膚光老化。

目前，在ADSCs促進(jìn)衰老皮膚血管新生方面存在兩大不同學(xué)說：①ADSCs通過分泌一些細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子等)促進(jìn)血管新生；②可直接分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮作用，但具體機(jī)制尚未闡明[21]。

為了逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激，ADSCs能減少與凋亡相關(guān)成纖維細(xì)胞的凋亡，而抗氧化劑可抑制氧化反應(yīng)，減少黑色素形成，發(fā)揮美白效應(yīng)[22]。研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs可分泌TGF-β，TGF-β能抑制黑色素瘤細(xì)胞產(chǎn)生黑色素酶，降低酪氨酸酶活性，從而減少黑色素生成，且IL-6在抑制黑色素細(xì)胞中起關(guān)鍵作用，從而驗(yàn)證了ADSCs具有美白效應(yīng)[23-24]。

已知過量的紫外線輻射可損傷皮膚角質(zhì)層，降低皮膚原本的屏障功能，造成其脫水干燥。同時(shí)紫外線也能穿透皮膚，改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)，深入真皮層，通過增加真皮細(xì)胞內(nèi)MMP-2和MMP-13的表達(dá)，使細(xì)胞外基質(zhì)降解，引起組織損傷和膠原蛋白變性，形成皺紋[25]。研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs可抑制紫外線誘導(dǎo)的MMP-2、MMP-13過表達(dá)和多種炎癥因子的釋放，并增加Ⅰ型膠原蛋白的生成[26]。同時(shí)，ADSCs也可通過調(diào)節(jié)TGF-β2的表達(dá)，在細(xì)胞和結(jié)構(gòu)水平上恢復(fù)皮膚屏障功能，增強(qiáng)毛囊干細(xì)胞的活性，預(yù)防并改善光老化造成的皺紋[26]。

3 ADSCs在面部年輕化中的應(yīng)用

3.1ADSCs單純注射 目前，已有學(xué)者將ADSCs應(yīng)用于面部年輕化中，通過抽取脂肪組織，優(yōu)良制造標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)ADSCs后，將在體外培養(yǎng)的ADSCs以1×106/mL的細(xì)胞濃度注入患者皺紋處的真皮淺層內(nèi)，如頸紋、鼻唇溝、魚尾紋和眉間紋，結(jié)果發(fā)現(xiàn)皺紋較前明顯減輕[27]。同時(shí)組織學(xué)發(fā)現(xiàn)，接受ADSCs注射患者的皮膚真皮層厚度、膠原纖維及毛細(xì)血管增加[28]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，Jeong等[29]將BALB/c裸鼠暴露于紫外線-B輻射下誘導(dǎo)光老化皺紋，然后將從人體組織中分離并培養(yǎng)的ADSCs和成纖維細(xì)胞(對(duì)照組)注射于皺紋內(nèi)，均觀察到皺紋明顯減少。同時(shí)他們發(fā)現(xiàn)，ADSCs可刺激表達(dá)更多的膠原蛋白并減少M(fèi)MP，雖然成纖維細(xì)胞較ADSCs可刺激更多的膠原蛋白表達(dá)，但同時(shí)也增加了MMP。以上結(jié)果表明，ADSCs移植不僅可改善面部輪廓，同時(shí)因其含有多種活性成分，并具有多種分化潛能，故能根據(jù)組織需要自身分化并激活成纖維細(xì)胞等，刺激膠原蛋白合成，改善皮膚光澤度，修復(fù)受損肌膚達(dá)到抗皺效果。

3.2ADSCs輔助脂肪移植 近年來，脂肪填充技術(shù)已廣泛應(yīng)用于面部填充和面部年輕化。目前認(rèn)為，面部除皺術(shù)和脂肪填充幾乎密不可分。除皺在于解決面部下垂，脂肪填充則關(guān)注于容積的減少。臨床上在未使用ADSCs聯(lián)合脂肪移植前，各學(xué)者主要通過單純移植自體脂肪填充軟組織。自體脂肪移植面部年輕化是將身體其他部位的脂肪組織，如大腿、臀部或腹部等，通過負(fù)壓吸引技術(shù)獲得脂肪顆粒，然后經(jīng)過漂洗、過濾或離心等處理后再填充至皺紋或溝壑處。因其沒有排斥反應(yīng)，移植后組織質(zhì)地柔軟且存活后可以長(zhǎng)期存在，所以廣受歡迎。但移植后組織的血管重建在移植48 h后，在此期間，由于成熟脂肪細(xì)胞極易受局部組織創(chuàng)傷和缺血缺氧等影響，導(dǎo)致存活率較低，手術(shù)失敗——這也解釋了移植后有20%～70%的可能出現(xiàn)脂肪組織體積減小[30-31]。目前，對(duì)于脂肪移植及ADSCs在整形外科中的應(yīng)用，提出最多的為復(fù)合移植，即自體細(xì)胞輔助脂肪移植技術(shù)。該技術(shù)通過將ADSCs與脂肪細(xì)胞混合后注射移植。此操作可使移植后的脂肪細(xì)胞存活率平均提高35%[32]。Harris等[33]證實(shí)，在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周后的ADSCs具有內(nèi)皮表型的功能，可刺激新生血管生成，顯著減少早期組織壞死，從而更好地保留移植物體積。在新移植的脂肪組織中，Eto等[34]描述了三個(gè)區(qū)域：中心壞死區(qū)、中間再生區(qū)和外部存活區(qū)。移植后的第1天，中心壞死區(qū)域內(nèi)成熟脂肪細(xì)胞因缺血而退化壞死，巨噬細(xì)胞和多核中性粒細(xì)胞聚集并吞噬細(xì)胞碎片。而在中間和外部區(qū)域內(nèi)的ADSCs則維持其活力，通過增殖分化，替換壞死區(qū)內(nèi)的脂肪細(xì)胞并開始血運(yùn)重建。血管生成從移植物周邊開始，隨后新形成的血管使整個(gè)移植物血管化[35]。ADSCs不僅可以顯著改善組織血運(yùn)重建、生存率和手術(shù)效果，還能減少脂肪移植后纖維化、囊腫形成和鈣化，同時(shí)對(duì)膚色也有改善作用[36]。

移植后的ADSCs較普通脂肪組織耐受缺氧能力更強(qiáng)，Mylotte等[37]發(fā)現(xiàn)，ADSCs在缺氧情況下可聚集在血管周圍，釋放胰島素樣生長(zhǎng)因子1、VEGF等多種細(xì)胞因子；既促進(jìn)了血管在脂肪組織內(nèi)的再生，也可提高脂肪組織的缺氧耐受力，減少凋亡[38-40]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)體外培養(yǎng)相比，低氧培養(yǎng)可提高ADSCs的增殖能力、多能性和分化能力，且低氧主要通過低氧誘導(dǎo)因子-1α、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和VEGF的相互作用促進(jìn)ADSCs的增殖，并促進(jìn)其變?yōu)橛字蔂顟B(tài)的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞[41]。然而有證據(jù)表明，ADSCs的相關(guān)治療作用由其衍生的細(xì)胞外囊泡介導(dǎo)，且缺氧條件可顯著增加細(xì)胞外囊泡誘導(dǎo)血管內(nèi)皮形成的能力[42]。

Yoshimura等[43]于2010年首次將從吸脂抽吸物中獲得并提取的富含ADSCs的血管基質(zhì)成分，添入待移植的顆粒脂肪組織內(nèi)，從而使脂肪移植獲得穩(wěn)定的治療效果。Park等[44]將含有純化ADSCs的脂肪細(xì)胞移植于面部除皺患者，2個(gè)月后可見皮膚紋理及真皮層厚度具有明顯改變。田雅光等[7]對(duì)單純接受面部小切口除皺術(shù)和手術(shù)聯(lián)合ADSCs行面部年輕化治療的患者進(jìn)行隨訪，隨訪3～15個(gè)月后發(fā)現(xiàn)，兩種術(shù)式的除皺效果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但聯(lián)合ADSCs治療能更明顯改善皮膚毛孔和斑點(diǎn)。

3.3ADSCs聯(lián)合透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)注射 在軟組織填充方面，已知HA是一種天然高分子多糖，作為細(xì)胞基質(zhì)成分，其不具有抗原性、致敏性等，是目前應(yīng)用最廣的軟組織填充劑。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與單純注射ADSCs及HA相比，ADSCs聯(lián)合HA注射于裸鼠背部皮下可產(chǎn)生新生軟組織；且Masson三色染色發(fā)現(xiàn)，注射ADSCs聯(lián)合HA較單純注射ADSCs新生膠原蛋白排列規(guī)律，故推斷ADSCs在體內(nèi)的分泌分化與局部HA有關(guān)[45]。臨床應(yīng)用方面，高倩倩等[46]將ADSCs聯(lián)合HA通過水光針注射方式，注入皮膚真皮層內(nèi)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單純注射HA相比，ADSCs聯(lián)合HA注射治療3個(gè)月后，患者面部皮膚在斑點(diǎn)、皺紋、皮膚紋理、紫外線色斑等方面的改善更明顯，表明ADSCs聯(lián)合HA注射能更好地改善皮膚老化。同時(shí)，由于此方式僅局限于真皮層，對(duì)機(jī)體的正常組織結(jié)構(gòu)創(chuàng)傷小，并發(fā)癥少，故被更多人接受。

4 ADSCs應(yīng)用于臨床存在的問題

ADSCs已被證實(shí)具有抑制細(xì)胞衰老、修復(fù)損傷、促進(jìn)再生等多種抗衰老的生物學(xué)性能，且其取材容易、組織損傷小、體內(nèi)含量多，同時(shí)可在離體環(huán)境下穩(wěn)定增殖。因此，ADSCs已成為面部年輕化領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，但仍存在一些問題亟待解決。

目前，在ADSCs使用劑量方面尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。但有研究發(fā)現(xiàn)，高劑量注射效果優(yōu)于低劑量效果[17-18]。Kim等[18]發(fā)現(xiàn)，5×105個(gè)細(xì)胞的注射效果優(yōu)于1×105個(gè)細(xì)胞。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與注射1×105個(gè)ADSCs治療光老化皮膚相比，1×104和1×105個(gè)細(xì)胞不僅可增加真皮層厚度，還可增加膠原蛋白含量，并可觀察到表皮皺紋改變[17]。同時(shí)，在提取方法上，目前尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。但應(yīng)注意提取方法會(huì)影響ADSCs的質(zhì)和量[47]。另有研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs在體外培養(yǎng)可能出現(xiàn)染色體畸變，促進(jìn)惡變細(xì)胞生長(zhǎng)[3]。由于ADSCs是祖細(xì)胞，所以既往有腫瘤病史可能是應(yīng)用ADSCs的禁忌證。已有研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs與小鼠前列腺癌細(xì)胞聯(lián)合注射促進(jìn)了腫瘤進(jìn)展[48]。而另一項(xiàng)關(guān)于乳腺癌模型的研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs能加快活性腫瘤細(xì)胞(非靜止期腫瘤細(xì)胞)的增殖，表明只有在沒有活動(dòng)性疾病的證據(jù)時(shí)才應(yīng)進(jìn)行ADSCs治療[49]。因此，若將多能干細(xì)胞植入已知有致癌風(fēng)險(xiǎn)的部位，可能會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。此外，進(jìn)入人體內(nèi)的ADSCs，能否繼續(xù)發(fā)揮旁分泌功能，抵抗衰老，其如何按需調(diào)控其分泌的細(xì)胞因子的種類和濃度，仍需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

然而，ADCSc應(yīng)用于臨床的并發(fā)癥尚不清楚，可能存在一些類似于脂肪移植的并發(fā)癥，如液化壞死、紅腫、刺痛、體積丟失等[50]。有文獻(xiàn)報(bào)道，補(bǔ)充ADSCs的脂肪移植物可導(dǎo)致長(zhǎng)達(dá)4周的皮下出血和腫脹[51]。

5 小 結(jié)

隨著生活物質(zhì)水平的提高，人們對(duì)面部抗衰老的需求日益增加，且各類面部年輕化手術(shù)具有創(chuàng)傷極小、手術(shù)時(shí)間短、恢復(fù)快、療效顯著的特點(diǎn)。而探索ADSCs于面部抗衰老中的臨床應(yīng)用，可在極大提高患者認(rèn)可度的同時(shí)，降低醫(yī)師操作的復(fù)雜性。此外，ADSCs可以從脂肪組織中提取，其含量豐富并具有多向分化能力，因此在軟組織的修復(fù)和再生方面具有巨大應(yīng)用前景。目前雖然歐洲、亞洲等已發(fā)表了成功使用ADSCs及其衍生產(chǎn)品治療面部衰老的病例報(bào)道，但仍有必要在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床環(huán)境中進(jìn)一步研究ADSCs，以確保其以安全有效的方式進(jìn)行治療。與多種傳統(tǒng)治療方案相比，對(duì)ADSCs移植后結(jié)果的可預(yù)測(cè)性、移植物存活率、操作簡(jiǎn)便性、成本和美觀效果等指標(biāo)的長(zhǎng)期研究也有必要，以增加ADSCs的推薦等級(jí)。未來相信隨著ADSCs的提取和使用技術(shù)的逐漸成熟，其在面部年輕化領(lǐng)域?qū)⒕哂懈玫膽?yīng)用前景。