陳倩文，劉璐，龍美玲，謝菲嵐，簡明威，劉錦濤

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣東 湛江 524000； 2.廣東醫(yī)科大學(xué)深圳寶安臨床醫(yī)學(xué)院 深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 深圳 518100； 3.深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院內(nèi)鏡室，廣東 深圳 518100)

胃癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率位居世界第二，僅次于肺癌[1]。據(jù)我國2015年惡性腫瘤發(fā)病、病死數(shù)據(jù)顯示，胃癌發(fā)病率在男性和女性中分列第二位和第三位，而病死率均列第二位，我國胃癌新發(fā)病例和病死病例約占全球的42.6%和45.0%[2]。胃癌患者確診時大多已處于腫瘤晚期，導(dǎo)致胃癌術(shù)后預(yù)后較差，而常規(guī)的TNM分期通常難以準確評估胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及生存期等預(yù)后情況，因此尋找有效的預(yù)后評估方案一直是胃癌研究的熱點和難點。腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor-infiltrating lymphocytes，TIL)是目前關(guān)注的重點，TIL是宿主對腫瘤細胞免疫應(yīng)答的表現(xiàn)，是機體識別和清除腫瘤細胞的基礎(chǔ)，TIL的組成、數(shù)量、分布及功能狀態(tài)決定了機體對腫瘤細胞的免疫反應(yīng)。TIL的存在狀態(tài)與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)，TIL作為各種人類惡性腫瘤的預(yù)后參數(shù)，在非小細胞肺癌[3]、食管鱗狀細胞癌[4]和乳腺癌[5]中均取得了一定的研究進展。對于胃癌，TIL可能是一種潛在的生物標志物?，F(xiàn)就不同亞型TIL的密度、分布、功能狀態(tài)與胃癌臨床病理因素及預(yù)后關(guān)系的研究進展予以綜述。

1 胃癌TIL的組成及作用機制

TIL是一群存在于腫瘤及其間質(zhì)內(nèi)、以淋巴細胞為主的異質(zhì)性免疫細胞，包括T細胞、B細胞、樹突狀細胞(dendritic cell，DC)以及自然殺傷細胞(natural killer cell，NK細胞)等。1986年，Rosenberg等[6]首次從新鮮腫瘤組織中分離出TIL，此后的研究相繼發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中廣泛存在TIL，且TIL可以滲入基質(zhì)和腫瘤中心。根據(jù)是否存在免疫細胞浸潤，腫瘤可分為炎癥性腫瘤和非炎癥性腫瘤[7]。炎癥性腫瘤是指腫瘤細胞被不同的浸潤性炎癥細胞(T細胞、B細胞、髓系白細胞、NK細胞和DC等)包圍，這些免疫細胞在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用也不盡相同。T細胞是細胞免疫中的主要效應(yīng)細胞，按功能其可分為4類，即細胞毒性T細胞(cytotoxic T cell，Tc細胞)、輔助性T細胞(helper T cell，Th細胞)、調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg細胞)和記憶T細胞[8]。TIL中的T細胞以CD4+、CD8+為主，包括CD8+Tc細胞、CD4+Th細胞、叉頭框蛋白P3(forkhead box P3，F(xiàn)oxP3)+Treg細胞、CD45RO記憶T細胞等亞型[9]。

CD4+T淋巴細胞包括Th1、Th2、Th17、Th22及Treg細胞等亞群，而不同亞群對腫瘤演化的影響差異極大，故CD4+T細胞的作用因其異質(zhì)性而變得相對復(fù)雜。其中，Th1細胞和Th2細胞是Th細胞的兩種主要類型，Th1細胞可以激活CD8+Tc細胞，而Th2細胞可以激活體液免疫；在誘導(dǎo)抗腫瘤免疫中，Th1細胞較Th2細胞激活更有效，因此高比值的Th1/Th2被認為是胃癌的有利預(yù)后因素[10]。Th17細胞和Th22細胞能產(chǎn)生多種炎癥因子，可促進胃癌的發(fā)展[11]。Xu等[12]發(fā)現(xiàn)，CD4+T細胞能通過磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子信號通路上調(diào)胃癌間充質(zhì)干細胞中程序性細胞死亡配體1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)的表達，促進胃癌細胞的遷移。CD8+T淋巴細胞是抑制/殺傷T細胞，主要負責特異性清除腫瘤細胞，是人體免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤的主要細胞。Lee等[13]通過薈萃分析發(fā)現(xiàn)，高密度CD8+T淋巴細胞與胃癌的良好預(yù)后相關(guān)，可作為胃癌患者良好預(yù)后的預(yù)測指標。Thompson等[14]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌瘤內(nèi)和基質(zhì)中CD8+T細胞密度的增加與無進展生存期和總生存期呈正相關(guān)。然而，Zhuang等[15]使用流式細胞學(xué)研究103例胃癌患者血液和腫瘤樣本中Tc17細胞的數(shù)量和表型發(fā)現(xiàn)，分泌白細胞介素-7的CD8+T細胞有促進胃癌進展的作用，提示腫瘤浸潤Tc17細胞(分泌白細胞介素-7的Tc細胞)與胃癌患者的預(yù)后不良相關(guān)。Treg細胞能抑制效應(yīng)T淋巴細胞的功能，F(xiàn)oxP3表達陽性是其主要特征，F(xiàn)oxP3+Treg細胞陽性率越高，胃癌進展越快，患者存活率越低[16-17]。有研究表明，F(xiàn)oxp3+T細胞與CD4+T細胞以及FoxP3+T細胞與CD8+T細胞之間的數(shù)量平衡對抑制腫瘤轉(zhuǎn)移起重要作用，高比值的Foxp3+/CD4+和Foxp3+/CD8+提示預(yù)后不良[17-18]。CD45RO是最常用的記憶T細胞標志物，CD45RO+T細胞在許多人類癌癥中發(fā)揮重要作用。Hu和Wang[19]通過薈萃分析評估腫瘤浸潤性CD45RO+T細胞對人類實體瘤預(yù)后的影響，發(fā)現(xiàn)CD45RO+T細胞浸潤與實體瘤中無進展生存期和總生存期呈正相關(guān)；高密度腫瘤內(nèi)CD45RO+T細胞與實體瘤的TNM分期呈負相關(guān)。

TIL的抗腫瘤免疫效應(yīng)主要為細胞免疫效應(yīng)，腫瘤-免疫循環(huán)理論認為，免疫系統(tǒng)識別和清除腫瘤細胞必須經(jīng)歷三個階段：①在瘤內(nèi)，死亡的腫瘤細胞釋放出特異性抗原DC識別和捕獲；②成熟的DC遷移到腫瘤引流淋巴結(jié)，將加工后的抗原呈遞給幼稚T細胞，刺激其增殖、分化為 Tc、Th和Treg細胞等；③激活的效應(yīng)T細胞浸潤到瘤內(nèi)，特異性識別和殺死癌細胞，并進一步釋放腫瘤特異性抗原，使其進入下一個腫瘤-免疫循環(huán)[20-21]。但在絕大多數(shù)癌癥患者中，免疫系統(tǒng)不能有效地發(fā)揮作用：可能由于免疫系統(tǒng)未能識別到腫瘤抗原，將腫瘤抗原視為自身，即表現(xiàn)為免疫耐受；效應(yīng)T細胞無法浸潤到腫瘤病灶，或腫瘤微環(huán)境中的抑制因子(或免疫抑制性細胞)抑制效應(yīng)細胞的功能[22]。此外，免疫系統(tǒng)在清除腫瘤細胞的同時也會對腫瘤細胞的特性進行“重塑”，使其惡性程度更高和抵抗免疫攻擊能力更強，即“免疫編輯”[23]。因此，免疫系統(tǒng)在腫瘤細胞發(fā)生、發(fā)展過程中具有“雙刃劍”的作用。TIL位于瘤內(nèi)或間質(zhì)，因TIL為腫瘤免疫作用的主要參與者，且TIL亞群種類繁多，不同亞群在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用差異極大，所以對腫瘤預(yù)后的影響也不盡相同。

2 TIL在胃癌中的功能狀態(tài)研究

浸潤到腫瘤組織的T細胞功能常處于失調(diào)狀態(tài)，活性較低，因此無法控制腫瘤生長。有證據(jù)表明，細胞的無能、衰竭和衰老是導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中T細胞功能失調(diào)的主要原因[24-25]。目前，常用抑制性受體CD57、T細胞免疫球蛋白及黏蛋白結(jié)構(gòu)域分子3(T-cell immunoglobulin mucin domain-3，Tim-3)或程序性細胞死亡受體1(programmed cell death receptor 1，PD-1)的表達水平來表征T細胞的免疫耐受狀態(tài)，進而研究其與腫瘤之間的關(guān)系。

2.1CD57 CD57是存在于CD4+T細胞、分化晚期的CD8+T細胞及NK細胞等細胞膜上的糖蛋白[26]。CD57常用于鑒定增殖能力降低和功能特性改變的終末分化的衰老細胞。TIL作為免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在腫瘤微環(huán)境中CD57陽性淋巴細胞的功能引起了人們的廣泛關(guān)注，這些淋巴細胞在許多人類癌癥中發(fā)揮重要作用。CD57+淋巴細胞通常會在實體瘤中增加，可以說CD57的表達是免疫功能缺陷和復(fù)制衰老的特征[26-27]。以往研究提示，CD57分子的表達主要與NK細胞的分化發(fā)育有關(guān)，CD57+細胞可能就是高度成熟和終末分化的NK細胞[28]。Kared等[29]研究發(fā)現(xiàn)，血液和組織中的CD57+T細胞比例與慢性感染或各種癌癥及人類衰老的臨床預(yù)后相關(guān)，表明調(diào)控衰老CD57+T細胞的數(shù)量可能成為預(yù)防人類免疫衰老或各種慢性疾病的新方法。陳耀平等[30]研究表明，侵及胃壁全層的胃癌患者CD8+CD57+T細胞的百分率高于未侵及胃壁全層者，表明外周血中CD8+CD57+T細胞百分率增加可能促進腫瘤的局部浸潤。這與Akagi和Baba[31]的研究結(jié)果一致，該研究通過流式細胞術(shù)和細胞內(nèi)細胞因子分析測定胃癌患者外周血中CD57+T細胞的比例，發(fā)現(xiàn)CD57高比例的患者術(shù)后存活時間顯著短于CD57低比例者。另外，Hu和Wang[26]通過薈萃分析發(fā)現(xiàn)，CD57+終末分化的淋巴細胞浸潤與實體瘤患者的預(yù)后相關(guān)，且與胃癌3年和5年生存率均顯著相關(guān)；此外，CD57+淋巴細胞密度增加與實體瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期呈負相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明，CD57+淋巴細胞是人類實體腫瘤中抗腫瘤免疫力的重要參與者之一，可延緩腫瘤進展，提示CD57可能是預(yù)后的有用生物標志物。

CD57+淋巴細胞增加可提高患者生存率，可能與以下因素有關(guān)：CD57+T細胞和NK細胞等淋巴細胞中CD57的表達與顆粒酶A、顆粒酶B和穿孔素等細胞溶解酶的表達增加相關(guān)；當表達CD57抗原的CD4+T細胞、CD8+T細胞和NK細胞被刺激時，可以產(chǎn)生更多的γ干擾素，抑制腫瘤的生長；CD57+NK細胞可通過γ干擾素的分泌上調(diào)腫瘤細胞中主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類和Ⅱ類分子，使細胞毒性T淋巴細胞識別腫瘤特異性抗原，從而發(fā)揮抗腫瘤作用；CD57+NK細胞可以通過NK細胞和DC之間的相互作用增強T淋巴細胞的反應(yīng)，從而誘導(dǎo)DC的成熟和激活[26,32]。因此推測，CD57+淋巴細胞能夠增強腫瘤微環(huán)境中的抗腫瘤免疫反應(yīng)，并對抗腫瘤的生長和擴散，提高患者的生存率。目前，關(guān)于CD57與胃癌預(yù)后關(guān)系的研究中，CD57主要用于識別TNM分期Ⅲ～Ⅳ期胃癌患者的NK細胞，而CD57與T細胞的相關(guān)研究較少。

2.2Tim-3 Tim-3主要表達于Th1細胞表面，Tim-3與其配體半乳糖凝集素-9結(jié)合，通過Tim-3/半乳糖凝集素-9途徑產(chǎn)生抑制信號，誘導(dǎo)Th1細胞死亡，負調(diào)節(jié)Th1細胞免疫應(yīng)答[33]。此外，在CD8+T細胞、Th17細胞、Treg細胞、DC以及NK細胞等淋巴細胞亞群中也發(fā)現(xiàn)了Tim-3的表達[34]。有研究表明，Tim-3是一種免疫負調(diào)控分子，在分化和成熟的Th1細胞表面表達，在浸潤各種腫瘤組織的T細胞表面Tim-3的數(shù)量和密度均增加[35-36]。另有研究表明，Tim-3在多種腫瘤組織中的表達除了與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)外[34,37]，還與T細胞耗竭有關(guān)[33]。目前已知Tim-3與T細胞功能的抑制有關(guān)[24,34]，但有關(guān)胃癌患者T細胞表面Tim-3表達的研究以及與Tim-3胃癌發(fā)展關(guān)系的研究相對較少。因此，研究Tim-3在胃癌患者癌旁和癌組織中T細胞表面的表達及其對T細胞功能的影響，可揭示胃癌患者免疫抑制的機制，從而干擾T細胞的免疫抑制狀態(tài)，這可能是胃癌治療的新方向。

Yu等[38]建立了胃癌的裸鼠模型，并將Tim-3刺激的T細胞注射到小鼠中，以評估腫瘤的生長，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與外周血相比，癌旁組織和癌組織中T細胞表面的Tim-3表達水平均顯著升高；與癌旁組織相比，癌組織中T細胞表面的Tim-3表達水平也顯著升高，表明T細胞表面Tim-3的表達水平與胃癌T分期呈正相關(guān)。Tim-3可能通過抑制T細胞分泌腫瘤壞死因子-α和γ干擾素使T細胞功能降低，進而促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。另外，Cheng等[39]通過流式細胞術(shù)評估胃癌標本和胃炎組織中Tim-3的表達水平發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中Tim-3的表達水平顯著高于胃炎組織；且CD8+T細胞中Tim-3的表達與胃癌患者的性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、組織學(xué)類型均無關(guān)，僅與TNM分期有關(guān)。由此可見，Tim-3可引起T細胞功能障礙或活性降低，負調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，與胃癌預(yù)后呈負相關(guān)，其在細胞上的表達水平是胃癌患者的獨立預(yù)后因素。

2.3PD-1 PD-1屬于CD28蛋白家族，可在T細胞、B細胞、NK細胞和DC等多種免疫細胞表面表達，在腫瘤免疫逃逸過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其機制主要為：效應(yīng)T淋巴細胞通過T細胞受體與腫瘤細胞中主要組織相容性復(fù)合體間的相互作用識別腫瘤細胞；在激活免疫應(yīng)答后，腫瘤能夠在腫瘤細胞表面表達PD-L1，隨后PD-L1與PD-1結(jié)合，關(guān)閉免疫反應(yīng)使腫瘤細胞逃脫死亡[20]。

目前已知PD-1與T細胞功能的抑制有關(guān)[24,40-41]。有學(xué)者研究了胃癌患者T細胞表面PD-1分子的表達和功能，發(fā)現(xiàn)胃癌患者外周血和癌組織中T細胞表面PD-1的平均表達水平顯著升高，表達PD-1的T細胞分泌干擾素的能力顯著降低[24,40]。另有研究證明，PD-1或PD-L1在胃癌患者的腫瘤細胞中高表達[42-44]。Deng等[45]在小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)，當PD-L1在慢性發(fā)炎的組織和腫瘤中表達時，對T細胞具有負調(diào)節(jié)作用的PD-L1的治療性阻斷可以增強T細胞效應(yīng)子的功能。另外，放療和抗PD-L1藥物協(xié)同治療可減少腫瘤浸潤性髓樣來源的抑制細胞的局部積累，從而抑制T細胞并改變腫瘤免疫微環(huán)境。有學(xué)者通過免疫組織化學(xué)方法研究了PD-1和PD-L1在胃癌患者的表達水平，發(fā)現(xiàn)53.8%的胃癌患者PD-1表達陽性(主要限于TIL)，30.1%的胃癌患者PD-L1表達陽性[46]。盡管PD-1和PD-L1在胃癌中的表達與預(yù)后密切相關(guān)，但結(jié)果仍不一致[47]。Zhang等[48]通過薈萃分析評估了PD-L1在胃癌中的預(yù)后價值，通過對1 901例患者的研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1的表達與腫瘤大小及淋巴結(jié)狀態(tài)相關(guān)，但與性別、年齡、癌癥位置、分化、浸潤深度及腫瘤分期無關(guān)；同時他們還指出，腫瘤內(nèi)的PD-L1大多與胃癌患者的無進展生存期密切相關(guān)，這為PD-L1靶向治療胃癌患者提供了有利證據(jù)，并推測PD-1或PD-L1的特異性抑制劑可能是影響多種胃癌的潛在治療候選物。目前已經(jīng)開發(fā)了幾種針對抑制PD-1或PD-L1途徑的治療性抗體，如一種針對PD-1的人源化免疫球蛋白G4單克隆抗體，可用于PD-L1陽性的復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性胃或食管胃腺癌患者，目前正在進行臨床試驗。

3 TIL的分布與胃癌的關(guān)系

在TIL與胃癌關(guān)系的研究中，不同淋巴細胞亞群的數(shù)量、功能與預(yù)后之間的關(guān)系是目前最主要的關(guān)注點。TIL可以滲入基質(zhì)和腫瘤細胞，因此可分為腫瘤內(nèi)TIL和基質(zhì)TIL。腫瘤內(nèi)TIL在癌巢上皮組織內(nèi)直接與腫瘤細胞接觸，且細胞之間無間質(zhì)組織；基質(zhì)TIL分布于腫瘤細胞間的間質(zhì)內(nèi)，不與腫瘤細胞接觸；腫瘤內(nèi)TIL的絕對數(shù)量較少、存在的區(qū)域范圍小、分布的異質(zhì)性明顯，且不易通過蘇木精-伊紅染色觀察；而基質(zhì)TIL數(shù)量相對較多，易于觀察評價，且癌巢密度、形態(tài)等變化對基質(zhì)TIL影響較小[49]。以往對胃癌中TIL的研究已經(jīng)評估了基質(zhì)和腫瘤內(nèi)淋巴細胞，其中標準蘇木精-伊紅染色切片的視覺評估是最常用的測量TIL的方法[50-51]?；谑褂锰K木精-伊紅染色的載玻片對TIL的組織病理學(xué)分析，Kang等[52]提出，基質(zhì)TIL可定義為包含浸潤性單核炎癥細胞的腫瘤基質(zhì)區(qū)域，而腫瘤內(nèi)TIL可定義為腫瘤細胞內(nèi)的上皮內(nèi)淋巴細胞或單核細胞。這表明，基質(zhì)TIL可用于預(yù)測無復(fù)發(fā)生存期和無進展生存期。另一項研究發(fā)現(xiàn)，增加腫瘤內(nèi)TIL與改善癌癥特異性生存顯著相關(guān)[53]。事實上，基質(zhì)TIL在乳腺癌中被認為是一個優(yōu)越、可重復(fù)的參數(shù)[51]。盡管如此，目前對于TIL分布與胃癌預(yù)后的關(guān)系尚無共識，且研究胃癌患者TIL分布的方法還需要標準化。

4 小 結(jié)

胃癌內(nèi)的Treg細胞、Th17細胞、Th22細胞、CD57、Tim-3以及PD-1通常與不良預(yù)后相關(guān)，而高比值的Th1/Th2、CD8、CD45RO+T細胞通常與良好預(yù)后相關(guān)。TIL在胃癌的預(yù)后方面發(fā)揮重要作用，是胃癌患者潛在的生物標志物和良好預(yù)后的準確預(yù)測因子。另外，腫瘤組織及其周圍組織的免疫反應(yīng)與患者預(yù)后密切相關(guān)。相信隨著更精確的免疫浸潤分析方法的發(fā)展，不同的淋巴細胞亞群的代表意義將越來越清楚。特別是對于富含TIL的腫瘤來說，TIL可以作為治療腫瘤的重要生物標志物，這有助于未來靶向免疫細胞的常規(guī)療法和新療法的研究。因此，了解TIL對胃癌的作用機制，預(yù)示著個性化治療的新機遇。