尹航，王夢(mèng)杰，劉祺，孔淑琦，劉文文，楊娜娜，趙英會(huì)

(1.山東第一醫(yī)科大學(xué)a.臨床醫(yī)學(xué)院，b.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271000； 2.濰坊醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東 濰坊261000)

內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體，它可以增殖、分化形成內(nèi)皮細(xì)胞。在動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)中，EPCs能夠修復(fù)損傷的血管內(nèi)皮，減緩As的發(fā)生。近年來(lái)，EPCs與As的研究已成為As治療研究中的熱點(diǎn)。微RNA(microRNA，miRNA)是一類小分子非編碼RNA，具有調(diào)控生物生長(zhǎng)發(fā)育和治療疾病的功能。研究證實(shí)，miRNA與血管發(fā)生密切相關(guān)[1]，在As的治療、診斷和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，關(guān)于miRNA在冠狀動(dòng)脈事件發(fā)生過(guò)程中作用的研究較多，但對(duì)于miRNA在EPCs中的作用研究卻較少。研究表明，有些miRNA具有調(diào)控EPCs的功能[2]。現(xiàn)就miRNA在EPCs中作用的研究進(jìn)展予以綜述，以探討如何利用miRNA增強(qiáng)EPCs修復(fù)血管內(nèi)皮、改善As的作用。

1 miRNA相關(guān)介紹

1.1miRNA的作用及作用機(jī)制 1993年，人類首次在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)能夠控制細(xì)胞表達(dá)的miRNA，命名為lin-4[3]。目前，在超過(guò)200種物種中鑒定出超過(guò)25 000種miRNA (http：//www.mirbase.org)，miRNA是最近研究較多的內(nèi)源性非編碼小RNA，多存在于真核生物中。miRNA的生物學(xué)作用及作用方式較復(fù)雜，編碼miRNA的基因存在于細(xì)胞核中，被RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成長(zhǎng)度數(shù)千個(gè)堿基的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物。在細(xì)胞核內(nèi)，初級(jí)轉(zhuǎn)錄物在蛋白質(zhì)復(fù)合體(400 000～500 000)的作用下經(jīng)過(guò)了第一次加工，該蛋白質(zhì)復(fù)合體由Drosha(RNase Ⅲ蛋白)和Pasha(雙鏈RNA結(jié)合蛋白)兩個(gè)蛋白質(zhì)組成，初級(jí)轉(zhuǎn)錄物在Drosha的作用下被加工成具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的miRNA前體；miRNA前體在RanGTP/Exportin-5轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的協(xié)助下從核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中；在細(xì)胞質(zhì)中，RNase Ⅲ酶家族的Dicer酶識(shí)別miRNA前體并通過(guò)對(duì)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的剪切和修飾，使miRNA前體形成約20個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)的miRNA產(chǎn)物，這種miRNA與Argonaute家族蛋白形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，最終miRNA被降解，miRNA在轉(zhuǎn)錄后通過(guò)下調(diào)靶基因來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)，該機(jī)制則取決于miRNA與靶基因信使RNA的互補(bǔ)程度，若兩者能形成完全互補(bǔ)的RNA雙鏈，則miRNA將雙鏈中的信使RNA降解，沉默基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)；若兩者形成非完全互補(bǔ)的雜交雙鏈，則會(huì)特異性地抑制基因表達(dá)。

miRNA在結(jié)構(gòu)和功能上具有一些鮮明的特點(diǎn)：①長(zhǎng)度一般在20～25個(gè)堿基；②普遍存在于不同生物個(gè)體中，包括線蟲、果蠅、植物和人類等；③在不同的生物中，miRNA的序列具有一定的保守性，但尚未發(fā)現(xiàn)動(dòng)物與植物之間有完全相同的miRNA序列；④有明顯的表達(dá)階段特異性和組織特異性；⑤基因組中的miRNA基因以多種形式存在，包括單拷貝、多拷貝或基因簇等；⑥一種miRNA可以靶向多種信使RNA(可超過(guò)200種)，且一種信使RNA也可由多種miRNA靶向。有研究顯示，miRNA可以調(diào)節(jié)30%以上的蛋白質(zhì)的編碼基因，表明其參與了細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、衰老、凋亡、自噬、遷移、侵襲等多種過(guò)程，證實(shí)了其對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)[4]。

1.2miRNA與As 正常內(nèi)皮細(xì)胞具有調(diào)節(jié)血管緊張度、抗凝、抗血小板等作用，還具有分泌纖溶蛋白、防止細(xì)胞向血管壁黏附聚集和抗炎癥反應(yīng)的作用，故內(nèi)皮細(xì)胞損傷會(huì)引起并加劇As。在As發(fā)生過(guò)程中，首先表現(xiàn)出慢性炎癥對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，在趨化因子和黏附分子的共同作用下，單核細(xì)胞及T細(xì)胞等炎癥細(xì)胞遷移至動(dòng)脈內(nèi)膜下分化為巨噬細(xì)胞，促進(jìn)循環(huán)中單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附，在血管壁中遷移、吞噬脂質(zhì)，進(jìn)而衍化為巨噬泡沫細(xì)胞甚至粥樣病變。

多個(gè)miRNA參與調(diào)控動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞慢性炎癥反應(yīng)，影響As斑塊的發(fā)生發(fā)展。Wu等[5]研究顯示，miR-155通過(guò)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的負(fù)反饋調(diào)節(jié)發(fā)揮抗As作用，其機(jī)制主要是通過(guò)抑制腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)單核細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞黏附。miR-125a-5p通過(guò)下調(diào)氧化固醇結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白-9的表達(dá)，減少巨噬細(xì)胞對(duì)氧化型低密度脂蛋白的攝取；并且抑制白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等相關(guān)炎癥因子的基因表達(dá)[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老并阻滯細(xì)胞周期、參與血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥調(diào)節(jié)的作用[9-12]。由此可見(jiàn)，miRNA與As的緊密聯(lián)系，利用miRNA治療As具有廣闊的應(yīng)用前景。

2 EPCs的相關(guān)介紹

2.1EPCs的特征 EPCs是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體，是一種多能干細(xì)胞，由Asahara等[13]于1997年利用免疫分選的方法從人外周血中分離出來(lái)。目前，人類已可以從臍血、骨髓、外周血和胚胎肝臟中分離培養(yǎng)出EPCs，其中骨髓中分離出的最多。未分化的EPCs呈圓形，形態(tài)上很難與其他細(xì)胞區(qū)分，現(xiàn)主要依靠細(xì)胞表面標(biāo)志來(lái)區(qū)別。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，同時(shí)具有CD34+、CD133+和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2等表面抗原標(biāo)志物的細(xì)胞稱為EPCs[14-16]。

2.2EPCS與As的研究進(jìn)展 血管成形術(shù)或轉(zhuǎn)流手術(shù)后的內(nèi)皮損傷和脫失是形成As的重要病理基礎(chǔ)。加快損傷內(nèi)皮的修復(fù)，及時(shí)恢復(fù)穩(wěn)定的內(nèi)皮功能，能夠有效預(yù)防血栓形成。由于內(nèi)皮細(xì)胞是成熟的終末細(xì)胞，分化程度高且增殖能力低，當(dāng)血管內(nèi)皮損傷時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)能力有限，且一些較重的血管內(nèi)皮損傷不可逆轉(zhuǎn)；而EPCs可以通過(guò)分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的血管新生[17]。Griese等[18]對(duì)球囊誘導(dǎo)兔頸動(dòng)脈內(nèi)皮損傷剝脫實(shí)驗(yàn)的研究發(fā)現(xiàn)，移植4 d時(shí)，自體移植EPCs組頸動(dòng)脈內(nèi)皮損傷處基本已完全復(fù)內(nèi)皮化，而無(wú)EPCs移植對(duì)照組幾乎無(wú)復(fù)內(nèi)皮發(fā)生；4周后，自體移植EPCs組新生內(nèi)膜的形成較無(wú)EPCs移植對(duì)照組顯著增多。因此，EPCs可用于As的預(yù)防和治療。

3 miRNA調(diào)控EPCs功能的機(jī)制

3.1miRNA調(diào)控EPCs增殖 研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧狀態(tài)和發(fā)生As時(shí)，EPCs中miR-21的表達(dá)均增加，EPCs的增殖能力均下降[19]。EPCs中miR-21的敲低改善了缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)停滯。熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定法顯示，miR-21通過(guò)直接靶向WWP1的3′非翻譯區(qū)下調(diào)含WW結(jié)構(gòu)域蛋白1(TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)因子)的表達(dá)，而EPCs中miR-21過(guò)表達(dá)或WW結(jié)構(gòu)域蛋白1敲低顯著激活了TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)途徑并抑制細(xì)胞增殖，表明miR-21可通過(guò)下調(diào)WW結(jié)構(gòu)域蛋白1激活TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)抑制EPCs增殖。

miR-221/222的生理作用與內(nèi)皮細(xì)胞的增殖也密切相關(guān)。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)測(cè)量穩(wěn)定冠狀動(dòng)脈疾病(coronary artery disease，CAD)患者和非CAD患者。將CAD患者隨機(jī)分為阿托伐他汀組(口服阿托伐他汀10 mg/d)和普伐他汀組(口服普伐他汀10 mg/d)，治療12個(gè)月后，檢測(cè)兩組外周血EPCs中miR-221/222的水平顯示，CAD組miR-221/222水平顯著高于非CAD組(P<0.01)[20]。miR-221/222水平與CAD組EPCs數(shù)量呈弱負(fù)相關(guān)，推測(cè)miR-221/222可能抑制EPCs的增殖。

miR-10b和miR-196b能夠促進(jìn)腫瘤EPCs的增殖[21-23]。研究發(fā)現(xiàn)，骨髓內(nèi)的EPCs可以參與小鼠和人腫瘤血管生成依賴性生長(zhǎng)的過(guò)程[24]。EPCs通過(guò)促血管生成生長(zhǎng)因子的旁分泌以及直接參與新生血管調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮的生成。miRNA是細(xì)胞過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)控因子，包括血管生成過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA處理酶Dicer的基因消融，特別是減少了骨髓中循環(huán)EPCs的數(shù)量，導(dǎo)致血管生成抑制和腫瘤生長(zhǎng)受損[24]。此外，miRNA的全基因組深度測(cè)序揭示了腫瘤EPCs的固有miRNA，包括miR-10b和miR-196b，被認(rèn)為是HOX信號(hào)和成體干細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)控因子。值得注意的是，miR-10b和miR-196b對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的刺激均有反應(yīng)，并在人類高級(jí)別乳腺腫瘤血管系統(tǒng)中表達(dá)增高。靶向miR-10b和miR-196b導(dǎo)致小鼠血管生成介導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)出現(xiàn)明顯缺陷[24]。因此，靶向上述miRNA可能是抑制腫瘤血管生成的新策略。

在糖尿病患者中，抑制miR-126基因表達(dá)會(huì)抑制EPCs增殖；而miRNA表達(dá)恢復(fù)后，EPCs的增殖也得到促進(jìn)[25]。研究表明，miR-31a-5p是EPCs動(dòng)員和內(nèi)皮化的重要調(diào)節(jié)因子，可能對(duì)動(dòng)脈瘤修復(fù)有積極作用[26]。利用成年雄性Sprague-Dawley大鼠經(jīng)顯微外科制作螺旋栓塞動(dòng)脈瘤模型，經(jīng)尾靜脈注射miR-31a-5p agomir或陰性對(duì)照agomir，劑量為10 mg/(kg·周)，持續(xù)4周，采用蘇木精-伊紅染色、電鏡掃描和流式細(xì)胞術(shù)觀察miR-31a-5p agomir對(duì)內(nèi)皮化和EPCs數(shù)量的影響發(fā)現(xiàn)，miR-31a-5p對(duì)EPCs活性和功能的影響則通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒Kit-8、傷口愈合實(shí)驗(yàn)和試管形成實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定；檢測(cè)miR-31a-5p促進(jìn)EPCs誘導(dǎo)的動(dòng)脈瘤血管內(nèi)皮化的能力，與陰性對(duì)照組相比，miR-31a-5p agomir能改善內(nèi)皮化，增加外周血循環(huán)EPCs的數(shù)量。

3.2miRNA調(diào)控EPCs分化 miR-107可以調(diào)控EPCs的分化。從大鼠骨髓中分離EPCs，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)量缺氧和常氧時(shí)EPCs中miR-107的表達(dá)，使用慢病毒載體表達(dá)短發(fā)夾RNA和miR-107抑制劑靶向缺氧誘導(dǎo)因子-1β(hypoxia-inducible factor-1β，HIF-1β)和miR-107以改變HIF-1β和miR-107表達(dá)；在低氧條件下，EPCs中miR-107的表達(dá)增加，miR-107的上調(diào)部分抑制了缺氧誘導(dǎo)的EPCs分化，而miR-107的下調(diào)促進(jìn)了EPCs分化，HIF-1β是相應(yīng)靶基因，表明缺氧時(shí)miR-107上調(diào)并通過(guò)靶向HIF-1β阻止EPCs分化[27]。

流動(dòng)剪切應(yīng)力在EPCs分化調(diào)節(jié)中起重要作用，確定新型靶Forkhead盒j2(Foxj2)和miR-34a對(duì)剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的EPCs分化的影響。使用平行板流動(dòng)室系統(tǒng)將人臍帶血衍生的EPCs暴露于15 dyn/cm2的層流剪切應(yīng)力中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示，伴隨EPCs的內(nèi)皮分化，剪切應(yīng)力顯著增加了miR-34a的表達(dá)；而Foxj2是由多種算法預(yù)測(cè)的miR-34a的推定靶標(biāo)，在此過(guò)程中受到抑制[28]。采用雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定以及miR-34a模擬物和抑制劑治療證實(shí) miR-34a和Foxj2之間相互作用的研究揭示了miR-34a和Foxj2表達(dá)的逆相關(guān)性，同時(shí)涉及EPCs的內(nèi)皮分化[28]。miR-34a通過(guò)上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物和下調(diào)平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物促進(jìn)EPCs分化。此外，F(xiàn)oxj2過(guò)表達(dá)減弱了EPCs的內(nèi)皮分化，而Foxj2小干擾RNA具有相反的作用，這些數(shù)據(jù)表明了剪切應(yīng)力誘導(dǎo)miR-34a表達(dá)的獨(dú)特機(jī)制，miR-34a靶向Foxj2并促進(jìn)EPCs的內(nèi)皮分化[27]。既往研究顯示，糖尿病患者的內(nèi)皮功能障礙導(dǎo)致血管疾病，且EPCs對(duì)血管內(nèi)皮的功能性保存是必不可少的[29]。

以往Satb2被認(rèn)為是EPCs中miR-31的功能相關(guān)靶標(biāo)。有研究顯示，糖尿病患者EPCs中miR-31的表達(dá)顯著升高，且這種升高可在高葡萄糖條件下抑制細(xì)胞的增殖，此外，miR-31靶向Satb2還具有抗細(xì)胞凋亡和維持EPCs功能的作用[30]。敲低Satb2對(duì)健康和糖尿病患者EPCs的增殖和遷移均有抑制作用，呈現(xiàn)與miR-31過(guò)表達(dá)相同的趨勢(shì)，而Satb2過(guò)表達(dá)則顯示出相反的效果。在糖尿病受試者EPCs中發(fā)現(xiàn)，葡萄糖水平升高上調(diào)miR-31表達(dá)，導(dǎo)致了EPCs的功能障礙和死亡。總之，miR-31可能是糖尿病內(nèi)皮功能障礙的基礎(chǔ)，miR-31上調(diào)可能靶向Satb2，從而調(diào)節(jié)EPCs的分化[30-31]。

3.3miRNA調(diào)控EPCs遷移 在早期EPCs中，觀察到miR-150高表達(dá)與CXC趨化因子受體4低表達(dá)相關(guān)[28]。腺苷是一種具有心臟保護(hù)作用的核苷，可降低miR-150的表達(dá)、增加CXC趨化因子受體4的表達(dá)，增強(qiáng)EPCs的遷移[32]。這說(shuō)明在缺血期間，miR-150下調(diào)骨髓來(lái)源的單核細(xì)胞中的CXC趨化因子受體4，EPCs的遷移能力減弱；當(dāng)miR-150被抑制時(shí)，EPCs的遷移能力增強(qiáng)[33]。Sun等[34]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)transwell實(shí)驗(yàn)和管形成實(shí)驗(yàn)研究miR-126的EPCs衍生外泌體(miR-126-Exo)對(duì)EPCs遷移和管內(nèi)結(jié)合能力的作用發(fā)現(xiàn)，miR-126-Exo可以增強(qiáng)EPCs的遷移和管內(nèi)結(jié)合能力。此外，EPCs還可高表達(dá)促血管生成的miRNA，如miR-31[35]，為miRNA調(diào)控EPCs的遷移奠定基礎(chǔ)。

3.4miRNA調(diào)控EPCs凋亡和衰老 EPCs衰老的潛在機(jī)制尚不清楚，但越來(lái)越多的證據(jù)支持miRNA在調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老中的作用。Kato等[36]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a可能參與了吸煙者EPCs的凋亡和衰老。Zhu等[37]研究亦證實(shí)，miR-10A*和miR-21通過(guò)抑制Hmga2表達(dá)調(diào)節(jié)EPCs的衰老。對(duì)糖尿病患者的研究發(fā)現(xiàn)，miR-126可以抑制EPCs的凋亡[25]。糖尿病會(huì)嚴(yán)重影響循環(huán)EPCs的數(shù)量和功能，并可降低EPCs的修復(fù)能力，這是糖尿病血管病變發(fā)展的關(guān)鍵和始動(dòng)因素。在此研究中，EPCs來(lái)自2型糖尿病患者和非糖尿病對(duì)照組，從EPCs中提取總RNA，經(jīng)基因芯片篩選和TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR篩選出miR-126，將表達(dá)miR-126和miR-126抑制劑的慢病毒載體轉(zhuǎn)染至EPCs，檢測(cè)EPCs的凋亡敏感性，并進(jìn)行Western Blotting和miRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析；同時(shí)為了研究其作用機(jī)制，制備了表達(dá)Spred-1的慢病毒載體和靶向Spred-1的小干擾RNA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者EPCs中miR-126異常下調(diào)，而抗miR-126會(huì)增強(qiáng)EPCs的凋亡[25]。糖尿病EPCs中miR-126表達(dá)的恢復(fù)抑制了EPCs的凋亡能力，EPCs中miR-126過(guò)表達(dá)顯著下調(diào)Spred-1，而糖尿病EPCs中Spred-1表達(dá)下調(diào)抑制了EPCs的凋亡[25]，證明糖尿病患者EPCs中miR-126下調(diào)，且具有抑制EPCs凋亡的作用?？梢?jiàn)，應(yīng)用miRNA調(diào)控EPCs的凋亡和衰老具有很高的研究?jī)r(jià)值。

4 小 結(jié)

As是老年性常見(jiàn)疾病，嚴(yán)重影響人類健康。調(diào)控EPCs延緩或修復(fù)As血管內(nèi)皮是目前研究的熱點(diǎn)。miRNA作為新發(fā)現(xiàn)的生物小分子，參與了多階段的生命過(guò)程，具有調(diào)控EPCs增殖、分化、遷移、凋亡和衰老的能力，體現(xiàn)了應(yīng)用miRNA促進(jìn)EPCs內(nèi)皮化以治療As的可行性。miRNA具有靶向多種蛋白質(zhì)編碼基因的能力，具有調(diào)節(jié)復(fù)雜生物過(guò)程(如血管生成)的潛力，但其多效性可能導(dǎo)致不良事件的發(fā)生，如何避免不良事件發(fā)生也是下一步研究的關(guān)鍵問(wèn)題。目前，許多研究者聚焦miRNA調(diào)節(jié)EPCs的研究，未來(lái)應(yīng)用miRNA調(diào)節(jié)EPCs治療As可能成為一種重要的方式。