樊明明，呂玉金，吳玉臣

（河南牧業(yè)經(jīng)濟學院，河南鄭州450046）

雞球蟲病是一種原蟲病，由艾美耳科艾美耳屬的球蟲寄生在雞的腸道上皮細胞內(nèi)引起，是養(yǎng)雞業(yè)中十分常見且危害極嚴重的疾病之一。全球每年因球蟲病帶來的損失高達15～20億美元[1]。其中，美國每年的經(jīng)濟損失為6.4億美元[2]。而我國每年因此造成的經(jīng)濟損失達25億元人民幣[18]。在研制及球蟲疫苗之前，應首先熟悉雞球蟲不同階段抗原的免疫原性，才能將球蟲的保護性抗原編碼基因片段克隆到表達載體，進而研制出免疫效果顯著的新型疫苗。

1 雞球蟲抗原的研究

1.1 無性生殖階段抗原

1.1.1 微線蛋白

研究發(fā)現(xiàn)，微線蛋白約有20種，目前有5種被報道，RT-PCR分析顯示，在孢子化6h后EtMIC-3、4、5出現(xiàn)，而在孢子化12h后EtMIC-1、2才能被檢出。EtMIC-1是一種糖蛋白G相關(guān)蛋白，分子量10～11萬，在巨型艾美耳球蟲中發(fā)現(xiàn)了一種和Et-MICI-1相似的蛋白，與其有高度序列同源性。Et-MIC-2為分子量50ku的微線蛋白，研究表明[3]，其主要參與溶膜入侵過程。EtMIC-3主要對子孢子入侵培養(yǎng)細胞有抑制作用。EtMIC-4的分子量為21.8萬，其免疫原性有待進一步研究。目前關(guān)于EtMIC-5免疫原性相關(guān)報道還未見到，據(jù)推測其編碼蛋白約100ku大小。此外，Tomley克隆了EtMICI(Et100)，其與禽類各種球蟲的同源性都很高，且有與灰色血栓形成蛋白、備解素等相似的基因序列，說明其既與入侵有關(guān)，還可能和裂殖子的運動及逸出相關(guān)。

1.1.2 折光體蛋白

球蟲在子孢子階段和第一代裂殖體階段均含有折光體，SO7是被報道較早的一種折光體蛋白，其分子質(zhì)量為26ku。CheY.SO7是一種重組抗原，其分子質(zhì)量為36ku。研究發(fā)現(xiàn)，其在構(gòu)型上表現(xiàn)為天然抗原的B細胞表位存在缺失或部分缺失，這也直接導致了其免疫原性主要來自細胞免疫。此外，重組抗原CheY.SO7能夠誘發(fā)抗多種球蟲感染的交叉保護反應[4～5]，這一結(jié)果通過用兔抗CheY.SO7血清免疫7種主要雞球蟲的孢子化卵囊得到了充分的證實，因為它們都含有相應的免疫優(yōu)勢多肽。

1.1.3 熱休克蛋白

熱休克蛋白存在于細胞質(zhì)內(nèi)或線粒體內(nèi)，能夠參與蛋白質(zhì)的生物合成、折疊和分泌，同時還可以與新生成的尚未折疊的前體蛋白相粘附，促進相應蛋白質(zhì)在基質(zhì)中的移動和折疊。Hsp的分子量為7萬，是E.maxima子孢子階段的抗原，免疫原性良好，能夠顯著刺激E.maxima感染雞T淋巴細胞的增殖，是宿主抗體和T淋巴細胞的靶目標。EaHsp也是E.acervulina的熱休克蛋白之一，與Hsp70具有一定的同源性。

1.1.4 表面抗原

有子孢子表面抗原和裂殖子表面抗原。子孢子表面抗原目前已知的有Wisher等鑒定的125I標記的表面抗原和35S-蛋氨酸標記和未標記的細胞漿和內(nèi)膜成分，主要抗原成分有32～45個，分子質(zhì)量9～33ku不等，其中15%的抗原具有免疫原性。TA4是E.tenella子孢子的表面糖蛋白，其生成過程起始于亂囊開始孢子化的16～20h，可能與蟲體侵入宿主細胞有關(guān)。xMzp5-7是E.tenella是一種表面蛋白，分子量為33ku，主要作用是能夠激活球蟲感染期的免疫應答反應，不僅可以誘導宿主產(chǎn)生抗體，還可以被宿主自然感染后恢復期的血清識別，3-1E是E.acervulina的表面抗原，由170個氨基酸組成，在子孢子與裂殖子生殖階段都存在，長度1086 bp，有一個閱讀框；重組的3-1E蛋白也可以介導細胞免疫，促進脾細胞增殖以及誘導IFN-γλ的生成。

1.2 有性生殖階段抗原

有性生殖階段抗原包括未孢子化卵囊抗原、配子體和合子。GAM56、GAM82和GAM230是分子質(zhì)量分別為56ku、82ku和230ku的E.maxima配子體特異性蛋白。它們能夠抑制E.maxima的發(fā)育，也可以誘導宿主產(chǎn)生免疫反應。其中GAM56和GAM82還參與卵囊壁的形成，但是只在大配子表達。

1.3 新發(fā)現(xiàn)抗原

1.3.1 乳酸脫氫酶

乳酸脫氫酶（LDH）是E.acervulina蛋白，分子質(zhì)量為37ku，也可同時在E.tenella和E.maxima表達，但這3種艾美耳球蟲的LDH相似性只有66%～80%，表明其具有遺傳多樣性。LDH是只能在細胞內(nèi)合成的一種蛋白，該蛋白在球蟲的卵囊、子孢子、裂殖體、裂殖子時期都有相似的表達。

1.3.2 EmTFP250

EmTFP250是E.maxima無性繁殖階段的大分子蛋白，宿主免疫后，其后代會產(chǎn)生明顯的對球蟲保護作用。Wit combe等研究發(fā)現(xiàn)，EmTFP250和E.tenella的EMIC4有71%的同源性。并且至少有4種艾美耳球蟲中都含有EmTFP250基因，這提示了該抗原潛在的交叉免疫作用。Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，EmTFP250有很好的免疫原性。

2 球蟲疫苗及其免疫效果

2.1 球蟲活疫苗

球蟲活疫苗能夠替代抗球蟲藥物控制球蟲病[6]。它的作用機理主要是通過低水平的感染，使雞對再感染產(chǎn)生一定程度的抵抗力，進而產(chǎn)生保護性免疫力。

2.1.1 球蟲活疫苗的分類

目前已報道的球蟲活疫苗有強毒和弱毒卵囊苗[7]。目前報道使用的有Coccivac疫苗（美國）、nmucox疫苗（加拿大）以及離子載體類耐藥菌株的強毒疫苗；而Paracox疫苗（英國）和Livacox疫苗（捷克）則屬于弱毒苗。近年來，陸續(xù)有些學者嘗試選育耐藥的弱毒株[8]，在1995年，索勛等人首次提出球蟲晚熟系概念，以期為球蟲病免疫預防提供新蟲系，為研究球蟲生活史調(diào)節(jié)機制提供參考材料[9]。

2.1.2 球蟲活疫苗的免疫效果

2.1.2.1 強毒苗的免疫效果。Edgar是一種強毒苗，內(nèi)含8種雞球蟲的混合孢子化卵囊，主要通過飲水或拌料給4～10日齡雞接種，這種混合孢子化卵囊也就是世界上最早的商品化的球蟲疫苗。這種疫苗的接種方式為投服，投服時間上可以是每天、也可以是一次性，還可以按周投服但劑量上需要把握，不同的方式和劑量，所獲得的免疫力效果也有差別，且不易把握，這也是強毒苗的主要缺點。

2.1.2.2 弱毒苗的免疫效果。隨著發(fā)展，學者們開始研究致弱蟲苗即弱毒活苗。通常由野外分離的強毒株進行致弱后的弱毒蟲株研制而成，能保證良好的免疫原性，有降低了致病力，不會對腸道造成嚴重的損傷，但是制作過程較為繁瑣。德國，英國，荷蘭，意大利等地對早熟株免疫進行了田間試驗，效果比強毒株令人滿意；中熟株疫苗試驗[10]結(jié)果表明：其免疫效果受溫度、濕度的影響較大，6周齡的雞免疫時，保持溫度20℃～28℃，墊料濕度25%～30%時免疫效果良好，其球蟲病死亡率為0.01%～0.34%，總死亡率也低于2.5%，免疫后不使用抗球蟲藥，到24周齡時，雞的成活率達93%以上；晚熟株疫苗有較好的穩(wěn)定性；混合株球蟲疫苗滴服免疫效果更佳，基本上能夠達到100%的保護效果，對小雞的生長保護也也有一定的效果。

2.2 基因工程苗及其免疫效果

弱毒疫苗相對比較安全，但制作過程繁瑣不易，而強毒疫苗在使用時存在有一定的風險，劑量難控制，對使用技術(shù)要求較高。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，利用基因重組技術(shù)將抗原蛋白的基因插入動物基因組中，可以構(gòu)建基因工程疫苗，誘導機體產(chǎn)生免疫，從而獲得抗原蛋白，可以克服傳統(tǒng)疫苗制作繁瑣和毒力不穩(wěn)定等缺點。

以色列雅貝克公司從巨型艾美耳球蟲的配子體中分離而得的亞單位疫苗CoxAbic，含有3種主要抗原，分子質(zhì)量分別為230ku，82ku，56ku。其可以通過肌肉注射的方式，誘導機體產(chǎn)生抗體進入卵黃，進而孵化后對雛雞的感染產(chǎn)生被動保護[12]。這也進一步說明如果配子(母)細胞抗原作為母源免疫在雞球蟲病控制中有價值，那么用以載體構(gòu)建的裸DNA疫苗來免疫產(chǎn)蛋雞將有重大的意義。

部分試驗研究表明，以沙門桿菌作為表達載體的DNA疫苗能夠誘導局部和全身體液免疫和細胞免疫應答[5]。杜愛芳等人[13]通過把重組質(zhì)粒pcDNA3-5401轉(zhuǎn)入致弱沙門菌中表達制得DNA疫苗，攻毒保護性試驗結(jié)果表明，帶有pcDNA3-5401的沙門菌能夠誘導強烈的體液免疫和細胞免疫應答，進而抵抗柔嫩艾美耳球蟲強毒攻擊，但是，沙門菌的穩(wěn)定性和生物安全性還有待進一步研究。李安興等人[14]對B-I株SO7重組抗原進行免疫試驗時發(fā)現(xiàn)，小劑量(10g)免疫雞時基本不產(chǎn)生免疫保護力，大劑量(100μg)SO7重組抗原免疫雞時，能夠產(chǎn)生部分免疫作用；而采用混合免疫方法，即先用SO7重組抗原進行基礎免疫，再用球蟲活苗(強毒株和弱毒株)進行加強免疫，則會產(chǎn)生互補加強的功效，其保護效果與用球蟲活苗2次免疫的效果相同。這種方法降低了成本，減少球蟲活苗的用量，同時還可以減少免疫后雞的卵囊排出量，降低了環(huán)境的污染程度，減少了重復感染的風險。Kopko等[15]首次用DNA(pcDNA3.SO7)免疫接種雞，發(fā)現(xiàn)相比用活卵囊和重組蛋白抗原(CheY-SO7)免疫的雞而言，盲腸病變減輕和相對體重增加。丁熙成等[16]用pET載體經(jīng)原核表達的EtMIC-2，通過口服、肌注不同劑量工程活菌和菌體裂解蛋白的方式，免疫7、14日齡雞兩次，1 周后再用 E.tenella、E.acervuzina、E.maxima 攻毒，證明經(jīng)原核表達的的EtMIC-2基因表達產(chǎn)物對E.tenella的額保護作用最強，其它兩種也有保護作用，但程度稍弱，且口服方式比肌注方式效果明顯。秦睿玲[17]用柔嫩艾美耳球蟲子孢子kMzp5-7基因在大腸桿菌中的表達產(chǎn)物，分別給7日齡、14日齡和28日齡的海蘭小公雛通過口服工程活菌和肌肉注射菌體純化蛋白兩種方式連續(xù)3次免疫，結(jié)果也顯示口服方式的免疫效果優(yōu)于肌注免疫組。Lillehoj等[18]用3-1E cDNA與編碼雞細胞因子(IL-8或IL-15)的cDNA聯(lián)合免疫雞，發(fā)現(xiàn)對十二指腸內(nèi)皮的CD3+T細胞有明顯的增殖作用。

3 展望

綜上所述，隨著科技和相關(guān)生物學科的發(fā)展，關(guān)于雞球蟲各方面的研究都進入到細胞和分子層面，但是球蟲復雜的生活史依然給相關(guān)研究帶來了一定的困難，其抗原蛋白的種類、其免疫原性以及保護性免疫機制等，都亟須進一步的發(fā)展，通過這些基礎性的研究進一步摸清球蟲的分子生物學特性，篩選球蟲不同階段的關(guān)鍵保護性抗原以及球蟲對宿主免疫系統(tǒng)的影響和免疫應答機制等問題，為球蟲病的防治提供新的更加有效的途徑。