李書芬，胡辛欣，胡曉敏，江冰婭，劉曉巖，劉紅宇，余利巖，武臨專

論著

鏈霉菌CPCC 203577產(chǎn)生的napyradiomycins的分離與鑒定

李書芬，胡辛欣，胡曉敏，江冰婭，劉曉巖，劉紅宇，余利巖，武臨專

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所衛(wèi)健委抗生素生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

對(duì)一株具有抗菌活性的鏈霉菌CPCC 203577 產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行系統(tǒng)研究。

采用 ISP2 瓊脂平板發(fā)酵培養(yǎng)鏈霉菌CPCC 203577，乙酸乙酯提取發(fā)酵培養(yǎng)物，獲得粗提物；粗提物經(jīng)反相色譜柱、凝膠色譜柱、制備型 TLC 和半制備 HPLC 等分離純化獲得目標(biāo)化合物純品；MS 和 NMR 等確定化合物結(jié)構(gòu)；瓊脂稀釋法測(cè)定抗菌活性。

從鏈霉菌CPCC 203577 中分離鑒定了含萘醌并吡喃母核的 3 個(gè)已知化合物，3-chloro-6,8-dihydroxy-8-α- lapachone（1）、16-dechloro-16-hydroxynapyradiomycin C2（2）和 napyradiomycin A2（3）。化合物1具有較強(qiáng)的抗革蘭氏陽性細(xì)菌活性，最低抑菌濃度（MIC）值為 4 ~ 8 μg/ml；化合物2和3沒有抗菌活性。

鏈霉菌 CPCC 203577 具有豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成能力，產(chǎn)生napyradiomycins 類化合物。

鏈霉菌CPCC 203577； napyradiomycins； 抗菌活性

鏈霉菌是一類可產(chǎn)生結(jié)構(gòu)多樣、生物活性豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物的放線菌；臨床使用的鏈霉素和達(dá)托霉素（daptomycin）等抗菌藥物均來源于鏈霉菌。隨著細(xì)菌耐藥性的日趨嚴(yán)重，急需發(fā)現(xiàn)具有新結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制的抗生素。對(duì)鏈霉菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行系統(tǒng)挖掘，有望為新型抗生素的研發(fā)提供先導(dǎo)化合物。

Napyradiomycins 是鏈霉菌產(chǎn)生的一類具有顯著抗菌、抗細(xì)菌生物膜與腫瘤細(xì)胞毒活性的化合物[1-7]。Napyradiomycins 的分子中含有一個(gè)萘醌并吡喃母核，該母核可連接不同結(jié)構(gòu)修飾的萜鏈。

鏈霉菌 CPCC 203577 是分離自云南省景洪曼亭的一株土壤鏈霉菌，具有顯著的抗菌及抗腫瘤細(xì)胞活性。本文作者前期研究表明，該菌株產(chǎn)生衣草花青菌素等吩嗪類化合物，并且微生物化學(xué)分析提示菌株還產(chǎn)生其他結(jié)構(gòu)類型的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物。本文作者對(duì)該菌株產(chǎn)生的脂溶性次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行挖掘，發(fā)現(xiàn)并鑒定了 3 個(gè)含有萘醌并吡喃母核的 napyradiomycins 類化合物，具體報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 鏈霉菌CPCC 203577，中國藥學(xué)微生物菌種保藏中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：葡萄糖 2.8 g/L、酵母提取物 2.8 g/L、麥芽提取物 7.0 g/L、甘露醇6.0 g/L、豆粉 6.0 g/L、瓊脂粉 15.0 g/L，pH 自然。發(fā)酵培養(yǎng)基：ISP2（葡萄糖 4.0 g/L、酵母提取物4.0 g/L、麥芽提取物 10.0 g/L、瓊脂粉 15.0 g/L，pH 自然）。

1.1.3 儀器與試劑 酵母提取物和麥芽提取物均為英國 Oxoid 公司產(chǎn)品；微生物培養(yǎng)所需的其他原料均為國產(chǎn)試劑；乙酸乙酯、甲醇等有機(jī)試劑為國產(chǎn)分析純?cè)噭?；乙腈為美?Fisher 公司產(chǎn)品；液相用水為屈臣氏蒸餾水；ODS 預(yù)裝柱為瑞典 Biotage 公司產(chǎn)品；Sephadex LH-20 凝膠為美國 GE Healthcare 公司產(chǎn)品；HPLC 分析色譜柱 Diamonsil C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）與 HPLC 半制備色譜柱 Diamonsil C18（10.0 mm × 250 mm，5 μm）購自北京迪科馬科技有限公司；薄層色譜硅膠板購自煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司。

樣品濃縮使用 EYELAN-1100 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；化合物HPLC 分析和半制備使用安捷倫 1260 高效液相色譜儀；LC-MS 分析使用 Thermo Fisher Scientific 公司 LTQ XL 質(zhì)譜分析儀；化合物 NMR 測(cè)試使用 Bruker Aviiihd 公司核磁共振儀（600 MHz，TMS 為內(nèi)標(biāo)）。

1.2 方法

1.2.1 鏈霉菌 CPCC 203577 培養(yǎng)與發(fā)酵 將保藏的鏈霉菌 CPCC 203577 孢子懸液涂布于種子培養(yǎng)基平板，28 ℃靜置培養(yǎng) 8 ~ 10 d 后，用適量無菌水洗下平板上的孢子。孢子懸液均勻涂布于發(fā)酵培養(yǎng)基平板（ISP2），28℃靜置培養(yǎng) 20 d，獲得發(fā)酵培養(yǎng)物共 20 L。

1.2.2 化合物分離純化 鏈霉菌 CPCC 203577 發(fā)酵培養(yǎng)物用乙酸乙酯浸泡提取 3 次，合并提取液，減壓濃縮獲得發(fā)酵培養(yǎng)物的提取物。提取物經(jīng) ODS 反相柱層析、Sephadex LH-20 層析、硅膠板 TLC 與半制備反相 HPLC 后，分別得到化合物1~3。

1.2.3 抗菌活性測(cè)定 參照 CLSI 標(biāo)準(zhǔn)[8-9]，采用平皿二倍稀釋法進(jìn)行 MIC 測(cè)定實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)菌包括表皮葡萄球菌（ATCC 12228，甲氧西林敏感株）、表皮葡萄球菌（13-3，甲氧西林耐藥株）、金黃色葡萄球菌（ATCC 29213，甲氧西林敏感株）、金黃色葡萄球菌（16-30，甲氧西林耐藥株）、金黃色葡萄球菌（ATCC BAA-976，克林霉素耐藥株）、人葡萄球菌（ATCC 35982）、大腸埃希菌（ATCC 25922）、肺炎克雷伯桿菌（ATCC 700603）與鮑曼不動(dòng)桿菌（ATCC 19606）等。試驗(yàn)菌用 MH 肉湯增菌，化合物1 ~ 3用 MH 肉湯二倍稀釋成各個(gè)所需濃度，分別加適量到平皿中，MH 瓊脂培養(yǎng)基熔化后定量注入含待測(cè)化合物的平皿內(nèi)混勻?；衔?的樣品終濃度為 16、8、4、2 和 1 μg/ml 等，化合物2和3的樣品終濃度為 64、32、16、8、4、2 和 1 μg/ml 等。接種試驗(yàn)菌（接種量為104CFU/點(diǎn)）后置 35 ℃恒溫培養(yǎng) 18 h 后觀察結(jié)果，無菌生長的平皿中所含藥物最小的濃度即為最低抑菌濃度（MIC）。

2 結(jié)果

2.1 化合物 1 ~ 3 分離純化

采用圖 1 所示分離純化流程，得到了化合物1~ 3純品。其中，ODS 反相柱層析采用 120 g 預(yù)裝柱，甲醇-水梯度（50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、100:0，V/V）洗脫，流速 20 ml/min?；衔?和3的 HPLC 半制備分析條件為 62% 乙腈-水等度洗脫，流速 1.8 ml/min，保留時(shí)間分別為 43 min 與 71 min?；衔?的硅膠板制備 TLC 展層體系為二氯甲烷-甲醇（9:1），HPLC 半制備分析條件為 60% 乙腈-水等度洗脫，流速 1.8 ml/min，保留時(shí)間為 18 min。

圖 1 化合物1~3的分離純化流程

Figure 1 Purification flowchart of compounds 1 - 3

圖 2 化合物1~3的紫外吸收光譜

Figure 2 UV spectra of compounds 1 - 3

2.2 結(jié)構(gòu)解析

化合物1為橙色針狀結(jié)晶，電噴霧質(zhì)譜（ESIMS）確定其分子量為 308；結(jié)合其 NMR（600 MHz，DMSO-6）數(shù)據(jù)，確定其分子式為 C15H13ClO5?；衔? 的吸收光譜在 264、312 與 448 nm 有最大吸收（乙腈中，圖 2）。經(jīng)化合物微譜數(shù)據(jù)庫查詢和文獻(xiàn)檢索，發(fā)現(xiàn)化合物1的核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道的 3-chloro-6,8-dihydroxy- 8-α-lapachone 一致，因此確定化合物1為 3-chloro-6,8-dihydroxy-8-α-lapachone（圖 3）?；衔?的核磁數(shù)據(jù)見表 1。

圖 3 化合物1~3的結(jié)構(gòu)

Figure 3 Structures of compounds 1 - 3

表 1 化合物1 ~ 3的 NMR 數(shù)據(jù)

化合物2為黃色粉末，ESIMS 確定其分子量為 494；結(jié)合其 NMR（600 MHz，CDCl3）數(shù)據(jù)（表 1），確定其分子式為 C25H28Cl2O6。化合物2的紫外吸收光譜在 274 與 348 nm 有最大吸收（乙腈中，圖 2）。經(jīng)化合物微譜數(shù)據(jù)庫查詢和文獻(xiàn)檢索，發(fā)現(xiàn)化合物2的核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的16-dechloro-16-hydroxynapyradiomycin C2 一致，因此確定化合物2為16-dechloro-16- hydroxynapyradiomycin C2（圖 3）。

化合物3為黃色油狀，ESIMS 確定其分子量為 496，結(jié)合其 NMR（600 MHz，CDCl3）數(shù)據(jù)（表 1），確定其分子式為 C25H30Cl2O6?；衔?的紫外吸收光譜在 252、273 與 362 nm 有最大吸收（乙腈中，圖 2），與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的napyradiomycins 類化合物的紫外吸收光譜相似，并且其核磁數(shù)據(jù)與napyradiomycin A2 一致，因此確定化合物3為 napyradiomycin A2（圖 3）。

2.3 抗菌活性

以左氧氟沙星（levofloxacin）為陽性對(duì)照，對(duì)化合物1~3進(jìn)行了體外抗菌活性測(cè)定?；衔?對(duì)多數(shù)革蘭氏陽性細(xì)菌顯示較強(qiáng)活性，其中對(duì)表皮葡萄球菌的 MIC 值為 4 μg/ml，對(duì)金黃色葡萄球菌和人葡萄球菌的 MIC 值為 4 ~ 8 μg/ml；而化合物2和3沒有抗菌活性（MIC 值≥ 64 μg/ml）?；衔?~3對(duì)大腸埃希菌、肺炎克雷伯桿菌與鮑曼不動(dòng)桿菌等革蘭氏陰性細(xì)菌均沒有活性。

3 討論

Napyradiomycins 是一類由芳香聚酮和萜類組分組成的雜萜類化合物，1986 年首次從采自日本土樣中的放線菌G802-AF1 中分離得到[1-3]；隨后從鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)了在萘醌母核或萜類組分具有不同修飾的多個(gè) napyradiomycins 類化合物[10-16]。雖然文獻(xiàn)報(bào)道的napyradiomycins 類化合物達(dá) 40 多個(gè)，但從同一株鏈霉菌中同時(shí)發(fā)現(xiàn)化合物1~3系首次報(bào)道。

本文作者對(duì)化合物1~3的抗菌活性測(cè)定結(jié)果表明，1具有較強(qiáng)的抗革蘭氏陽性菌活性，而2和3沒有抗菌活性。文獻(xiàn)報(bào)道化合物1的 C-8 位-甲基化類似物()-3-chloro-6-hydroxy-8- methoxy-α-lapachone 沒有抗菌活性[11]，提示萘醌并吡喃母核發(fā)生取代修飾可能會(huì)導(dǎo)致抗菌活性丟失?；衔?與文獻(xiàn)報(bào)道的 napyradiomycin C2 均發(fā)生了單萜組分修飾（與萘醌并吡喃母核成環(huán)，以及C-16 位的羥基或氯取代），它們均沒有抗菌活性[17]。化合物3與具有顯著抗菌活性的 napyradiomycin A1 相比較，其單萜部分發(fā)生了 C-16 位的羥基修飾和 C-17 位雙鍵位置變化，導(dǎo)致化合物抗菌活性丟失。

鏈霉菌 CPCC 203577 除了產(chǎn)生吩嗪類和 napyradiomycins 類化合物之外，可能還產(chǎn)生其他結(jié)構(gòu)類型的次級(jí)代謝產(chǎn)物，值得繼續(xù)挖掘。

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Isolation and identification of napyradiomycins fromsp.CPCC 203577

LI Shu-fen, HU Xin-xin, HU Xiao-min, JIANG Bing-ya,LIU Xiao-yan, LIU Hong-yu, YU Li-yan, WU Lin-zhuan

To investigate the secondary metabolites fromspCPCC 203577.

spCPCC 203577 was cultured on agar plates and then extracted with EtOAc. The extracts were fractionated by ODS and Sephadex LH-20 column chromatography, followed by preparative TLC and/or semi-preparative HPLC, which yielded compounds 1 - 3. MS and NMR were used to elucidate the structures of 1 - 3. Agar dilution method was used to assay the antibacterial activities of 1 - 3.

Three napyradiomycins were characterized fromspCPCC 203577. Their structures were confirmed to be 3-chloro-6, 8-dihydroxy-8-α-lapachone (1), 16-dechloro-16-hydroxynapyradiomycin C2 (2) and napyradiomycin A2 (3), respectively. Compound 1 showedactivity against Gram-positive bacteria, while 2 - 3 were inactive against both Gram-positive and Gram-negative bacteria.

spCPCC 203577 produces napyradiomycins, a group of secondary metabolites with a pyranonaphthoquinone core.

spCPCC 203577; Napyradiomycins; Antibacterial activities

WU Lin-zhuan, Email:wulinzhuan@imb.pumc.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.01.004

Author Affiliation:NHC Key Laboratory of Biotechnology of Antibiotics, CAMS Key Laboratory of Synthetic Biology for Drug Innovation, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

國家微生物資源基礎(chǔ)平臺(tái)（NIMR-2018-3）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程（2016-I2M-3-012）

武臨專，Email：wulinzhuan@imb.pumc.edu.cn

2019-07-17