冉 楠, 馬明星, 龐志強(qiáng), 王澤雨, 劉 月, 鄭瑞鵬, 盧俊英, 張 超, 陳 光, 章 宏, 王 放

(1.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，吉林 長春 130021；2 .吉林寰基生物科技有限公司，吉林 長春 130021；3.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，吉林 長春 130021；4.吉林大學(xué)第一醫(yī)院血管外科，吉林 長春 130021)

血栓性疾病已經(jīng)成為全球死亡率最高的疾病[1]。近年來，我國血栓性疾病的發(fā)病率、致殘率、死亡率和復(fù)發(fā)率呈逐年增高的趨勢[2]。血栓性疾病受到多種因素的影響，其中遺傳性因素在其發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[3]。目前血栓性疾病的診斷主要依據(jù)影像學(xué)和凝血指標(biāo)的檢查，缺乏靈敏度及特異度[4]?；蛐酒夹g(shù)作為最具發(fā)展?jié)摿Φ纳锔咝录夹g(shù)體系，具有快速、高效、敏感、經(jīng)濟(jì)、平行化和自動(dòng)化等特點(diǎn)[5-6]。近年來，基因芯片技術(shù)被廣泛應(yīng)用到生命科學(xué)的眾多領(lǐng)域中，例如基因表達(dá)檢測[7-9]、核酸突變檢測、基因組多態(tài)性分析[10-14]、基因文庫作圖[15]和雜交測序[16]等。目前基因芯片在血栓性疾病檢測方面的應(yīng)用甚少。本研究擬通過探討血栓形成易感基因芯片的設(shè)計(jì)、研制及初步臨床驗(yàn)證，建立一種快速且高通量檢測血栓形成易感基因突變的方法,以期為易患血栓者提供一定的生活指導(dǎo)，為血栓性疾病的早期診斷、預(yù)防和個(gè)體化治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 血栓形成易感基因及其多態(tài)性位點(diǎn)的確定

根據(jù)GenBank上已發(fā)表的血栓形成易感基因序列，初步選擇了4種凝血-纖溶系統(tǒng)相關(guān)因子的7種單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)基因改變作為檢測目標(biāo): 纖維蛋白原β鏈-455G/A突變(rs1800790)、纖維蛋白原β鏈-148位C/T突變(rs1800787)、糖蛋白Ⅵ 13254位A/G突變(rs1613662)、凝血因子Ⅸ-580位A/G突變(rs6048)、凝血因子VLeidenG/A突變(rs6025)、凝血酶原20210位G/A突變(rs1799963)和亞甲基四氫葉酸還原酶677位C/T突變(rs1801133)[17-19]。

1.2 主要試劑和儀器

QIAGEN RT-PCR Kit和核酸純化試劑盒購自德國QIAGEN公司，Cy3熒光染料購自美國Amersham Pharmacia Biotech公司，十二烷基磺酸鈉(SDS)和氯化鈉檸檬酸鈉清洗緩沖液(SSC)購自北京索萊寶科技有限公司。生物芯片點(diǎn)樣儀(美國Genomic Solution 公司)，生物芯片掃描儀(美國Packard Bioscience公司，ABI 7300 型熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems 公司)，紫外交聯(lián)儀(美國Spectrolinker公司)，芯片雜交儀(美國General Electric公司)。

1.3 芯片探針和引物的合成

首先從GenBank或文獻(xiàn)中搜索選定目的基因的多態(tài)性位點(diǎn)，根據(jù)直接雜交檢測SNP的方法，通過ArrayDesginer軟件設(shè)計(jì)檢測探針，將檢測探針?biāo)兔绹R拉基因技術(shù)公司進(jìn)行合成，探針的5′末端氨基修飾。探針序列見表1。

表1 血栓形成易感基因芯片的探針序列Tab.1 Probe sequences of thrombotic susceptibility gene chip

根據(jù)GenBank搜索的序列結(jié)果對基因組DNA進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，針對每個(gè)基因的SNP檢測位點(diǎn)設(shè)計(jì)2～3對檢測引物，下游引物采用Cy3熒光標(biāo)記。引物合成后，以人類基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，找到能夠高效擴(kuò)增待測片段的引物組合。引物序列見表2。

表2 血栓形成易感基因芯片的引物序列Tab.2 Primer sequences of thrombotic susceptibility gene chip

1.4 血栓形成易感基因芯片制備

1.4.1 陽性參考品的構(gòu)建 從GenBank或文獻(xiàn)中搜索各檢測位點(diǎn)及其鄰近片段的基因序列，各檢測位點(diǎn)基因序列分別設(shè)計(jì)突變型和正常型，送美國塞萊拉基因技術(shù)公司進(jìn)行合成。

1.4.2 芯片片基的醛基化修飾 芯片片基的醛基化修飾按之前研究中的方式進(jìn)行[20]，將清洗過的玻片放入含10 mmol·L-1氨基丙基三乙氧基硅烷(3-amin opropyltrieth oxysilane，APES)的無水乙醇溶液浸泡30 min，經(jīng)過一系列處理后晾干，暗盒保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 設(shè)計(jì)方案 根據(jù)設(shè)計(jì)的探針建立6×12芯片探針布局，包括5個(gè)部分：HC為雜交對照點(diǎn)探針，NC為陰性參考點(diǎn)探針，BC為空白點(diǎn)，IC為提取對照點(diǎn)探針，rs編號(hào)為相應(yīng)待測基因。W表示該基因的正常基因型檢測探針，M代表該基因的突變基因型檢測探針，每個(gè)探針至少有3個(gè)重復(fù)位點(diǎn)。芯片探針布局見表3。

1.4.4 芯片的制備 將合成探針和點(diǎn)樣儀專用Glycerol Buffer按一定比例混合點(diǎn)樣于醛基化修飾玻片上，每個(gè)點(diǎn)的直徑為100～130 μm。通過紫外交聯(lián)后使探針固定于片基上。

1.4.5 芯片雜交、洗脫、掃描和結(jié)果判讀 取75 μL經(jīng)42℃預(yù)熱的雜交緩沖液和25 μL參考品擴(kuò)增-標(biāo)記PCR產(chǎn)物(PCR擴(kuò)增體系：參考品DNA 5 μL,PCR擴(kuò)增試劑混合物12.5 μL，PCR擴(kuò)增引物7.5 μL)充分混勻后滴加在芯片矩陣位置，42℃雜交60 min。按流程將芯片洗脫后自然晾干，置于激光掃描儀中使用532 nm波長激光掃描，獲得掃描數(shù)據(jù)及圖譜。結(jié)果判讀由血栓形成易感基因檢測芯片判讀系統(tǒng)進(jìn)行，熒光信號(hào)強(qiáng)度的范圍為0～350 AU。0 AU 表示未檢測到熒光信號(hào)，說明檢測的基因組DNA中不包含相應(yīng)位點(diǎn)的基因型。大于0 AU表示檢測到熒光信號(hào)，說明檢測的基因組DNA中包含相應(yīng)位點(diǎn)的基因型。

表3 芯片探針布局Tab.3 Chip probe layout

1.5 血栓形成易感基因芯片的效果評價(jià)

1.5.1 基因芯片特異度和靈敏度測定 采用靶序列經(jīng)過測序驗(yàn)證的選定位點(diǎn)突變的人類基因組DNA為模板，對芯片設(shè)計(jì)的血栓形成易感基因檢測探針特異性進(jìn)行評價(jià)。靈敏度測定用紫外吸收法測定標(biāo)準(zhǔn)基因組DNA濃度，然后將標(biāo)準(zhǔn)DNA進(jìn)行逐級(jí)稀釋，按照基因芯片檢測方法進(jìn)行檢測，記錄檢測信號(hào)最弱的濃度即可計(jì)算出芯片的檢測靈敏度(最低靶基因濃度)。

1.5.2 臨床樣本檢測試驗(yàn) 研究對象：2017年1月—2018年5月，于寰基生物芯片產(chǎn)業(yè)有限公司的吉林、河南和云南3個(gè)地區(qū)的醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所共收集有不明原因血栓性疾病家族史的血栓患者24例，男女比例約為1.67∶1，年齡36～45歲， 其中吉林省9例，河南省8例，云南省7例；同時(shí)在3個(gè)地區(qū)體檢中心共招募健康受試者150人，男女比例約為1.5∶1，年齡36～55歲，其中吉林省60人，河南省50人，云南省40人。血栓患者納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)臨床超聲等檢查確診為動(dòng)靜脈血栓者；有血栓性疾病家族史；無臨床可查證的導(dǎo)致血栓形成的誘因；自愿簽署知情同意書入組本研究。健康受試者納入標(biāo)準(zhǔn)：無慢性疾病，目前未患有系統(tǒng)性疾?。谎荷?、血常規(guī)、便常規(guī)+潛血、尿常規(guī)、心電圖、胸透、乙肝兩對半及腹部B 超等檢查指標(biāo)未發(fā)現(xiàn)具有臨床意義的異常；簽署知情同意書。血栓患者與健康受試者排除標(biāo)準(zhǔn)：惡性腫瘤患者；重要臟器(心、肝、腎和腦) 有原發(fā)性疾病者；妊娠期或哺乳期婦女；有精神病病史者；治療依從性差者。

為評價(jià)該芯片對血栓形成易感基因突變的檢出率，取上述有不明原因血栓性疾病家族史的血栓患者和健康受試者口腔上皮細(xì)胞標(biāo)本[21-22]，按照1.4.5中的操作步驟進(jìn)行基因芯片檢測。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。健康受試者和血栓患者血栓形成易感基因突變檢出率以百分率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基因芯片雜交結(jié)果

當(dāng)HC和IC 的3個(gè)重復(fù)位點(diǎn)2個(gè)以上有綠色熒光信號(hào)，且NC和BC的3個(gè)重復(fù)位點(diǎn)2個(gè)以上無綠色熒光信號(hào)時(shí)，芯片檢測結(jié)果為有效結(jié)果。根據(jù)表3中的芯片探針布局進(jìn)行基因位點(diǎn)檢測，3個(gè)重復(fù)位點(diǎn)中2個(gè)重復(fù)位點(diǎn)rs-W熒光值/rs-M熒光值比值≥2.0判定為正常基因型，2個(gè)以上重復(fù)位點(diǎn)rs-W熒光值/rs-M熒光值比值為0.5～1.5判定為雜合型，2個(gè)以上重復(fù)位點(diǎn)rs-W熒光值/rs-M熒光值比值≤0.5則判定為突變基因型。芯片雜交結(jié)果見圖1(封三)。

2.2 基因芯片特異度和靈敏度檢測結(jié)果

特異度檢測結(jié)果：特定位點(diǎn)突變的人類基因組DNA在基因芯片上與目標(biāo)探針出現(xiàn)特異性的雜交信號(hào)，雜交斑點(diǎn)清晰，與非目的探針幾乎無雜交信號(hào)(圖2，見封三)。靈敏度檢測結(jié)果：該基因芯片的靈敏度為50～100 mg·L-1。

2.3 臨床樣本檢測結(jié)果

在健康受試者150人中共發(fā)現(xiàn)血栓形成易感基因突變者8人，血栓形成易感基因芯片檢測的突變率為5.3%(8/150)(圖3，見封三)；在24例有不明原因血栓性疾病家族史的血栓患者中檢測到20例血栓形成易感基因突變者，血栓形成易感基因芯片檢測的突變率達(dá)83.3%(20/24)。2組受試者血栓形成易感基因突變率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.14，P<0.05)，有不明原因血栓性疾病家族史的血栓患者血栓形成易感基因突變檢出率明顯高于健康受試者。

3 討 論

血栓性疾病是復(fù)雜的遺傳-環(huán)境多因素疾病，疾病負(fù)擔(dān)呈逐年增長的趨勢[23]。遺傳因素在血栓性疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。血栓性疾病的診治重點(diǎn)在于早期診斷和靶向治療，而目前血栓風(fēng)險(xiǎn)預(yù)防從預(yù)警監(jiān)控到預(yù)防措施都存在明顯的缺陷，還習(xí)慣于通過血壓、血脂、血糖、肥胖、吸煙史、年齡和凝血參數(shù)等指標(biāo)預(yù)測血栓風(fēng)險(xiǎn)。一般來說上述指標(biāo)與血栓發(fā)生具有間接的關(guān)系，對實(shí)際預(yù)警血栓意義非常有限。單純依據(jù)這些指標(biāo)并不能準(zhǔn)確反映血栓或出血的風(fēng)險(xiǎn)，也正是由于目前血栓預(yù)防措施的嚴(yán)重缺陷才導(dǎo)致血栓性疾病危害嚴(yán)重[24]。

基因芯片技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，在疾病的早期診斷及個(gè)體化治療方面起著重要的作用,然而其在血栓性疾病方面的研究和應(yīng)用較少。程克斌[25]用基因芯片技術(shù)研究了肺栓塞患者及正常人基因表達(dá)譜的差異，并選擇其中11條相關(guān)基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示：基因芯片篩選基因表達(dá)異常是可靠的，但此研究僅適用于肺栓塞檢測。本研究以血栓形成易感基因?yàn)檠芯繉ο?，制備檢測速度快、靈敏度高和特異性強(qiáng)的基因芯片，用于血栓性疾病的早期診斷及風(fēng)險(xiǎn)評估，使高危人群獲益于臨床前預(yù)防，并為血栓性疾病提供靶向治療位點(diǎn)。

PCR檢測技術(shù)對體系痕量核酸分子進(jìn)行擴(kuò)增，靈敏度高，但存在不可避免的缺陷，如產(chǎn)物可能有非特異性擴(kuò)增等[26]。本研究中血栓形成易感基因芯片采用熒光標(biāo)記引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記，將PCR技術(shù)和分子雜交技術(shù)相結(jié)合，增加了血栓性疾病早期診斷的靈敏度和特異度。與常規(guī)PCR檢測技術(shù)比較，基因芯片具有高通量檢測、平行對照、避免假陰性、成本大幅度降低和快速方便等特點(diǎn)，對血栓性疾病的早期診斷、風(fēng)險(xiǎn)評估和疾病進(jìn)程預(yù)測具有重要意義。芯片制備過程中，用于探針固定的基片種類有很多種，醛基化修飾的載玻片不僅熒光本底低，而且可以與氨基修飾的探針進(jìn)行縮合反應(yīng)，不需要點(diǎn)樣后的其他處理，操作簡單，提高了雜交效率和檢測靈敏度。

用靶序列經(jīng)過測序驗(yàn)證的人類基因組DNA為模板對血栓形成易感基因芯片的特異性進(jìn)行檢測，在芯片上出現(xiàn)特異性雜交信號(hào)。該基因芯片的靈敏度檢測結(jié)果顯示: 標(biāo)準(zhǔn)基因組DNA濃度為50～100 mg·L-1，可以在芯片上顯示雜交信號(hào)，而PCR檢測的靈敏度為25 mg·L-1，基因芯片的靈敏度略低于PCR檢測靈敏度，但特異性明顯增加，假陰性率明顯降低。本研究應(yīng)用該基因芯片對來自吉林、河南和云南3個(gè)地區(qū)有不明原因血栓性疾病家族史的血栓患者和健康受試者進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：該基因芯片對不明原因血栓性疾病家族史的血栓患者血栓形成易感基因突變檢出率明顯高于健康受試者。由于血栓性疾病是一個(gè)由遺傳、環(huán)境和生活習(xí)慣等多因素影響的復(fù)雜疾病，因此易感基因檢測無法全面反映血栓形成風(fēng)險(xiǎn)的全部問題，但是可以對人們的日常生活給予指導(dǎo)，有一定早期診斷價(jià)值，可降低血栓發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

本研究設(shè)計(jì)的血栓形成易感基因芯片在對血栓性疾病患者的早期診斷、臨床前預(yù)防和個(gè)體化治療方存在明顯的優(yōu)越性，但不足之處在于該基因芯片的檢測位點(diǎn)未覆蓋所有血栓形成易感基因，需在后續(xù)的研究中進(jìn)一步完善。