徐 坤, 金鈺龍, 黃嫣嫣*, 趙 睿*

(1. 北京分子科學(xué)國(guó)家研究中心, 中國(guó)科學(xué)院活體分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國(guó)科學(xué)院分子科學(xué)科教融合 卓越創(chuàng)新中心, 中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所, 北京 100190; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

多肽(peptide)是生命體中重要的基礎(chǔ)物質(zhì)之一,在生命體的生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝和衰老等過程中都發(fā)揮著不可替代的作用[1]。隨著對(duì)多肽結(jié)構(gòu)與功能的深入研究,人工合成生物活性多肽已經(jīng)成為化學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域共同關(guān)注的熱點(diǎn)[2]。1963年,Merrifield[3]提出了固相多肽合成(solid phase peptide synthesis, SPPS)這一獨(dú)創(chuàng)性的概念,是多肽化學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)重大突破,并于1984年獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。雖然SPPS操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)效率高、副反應(yīng)干擾少,但是由于氨基酸及其衍生物的種類繁多、側(cè)鏈基團(tuán)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)差異大,仍然存在部分氨基酸偶聯(lián)時(shí)易消旋[4]、芳香胺偶聯(lián)困難[5]以及長(zhǎng)鏈肽偶聯(lián)效率較低[6]等問題。因此,發(fā)展高效的分離分析方法對(duì)于多肽合成過程的監(jiān)測(cè)、產(chǎn)物純化和結(jié)構(gòu)鑒定具有重要意義。

人心房鈉尿肽(human atrial natriuretic peptide, ANP)是一種含有28個(gè)氨基酸的多肽類激素,由心房心肌細(xì)胞產(chǎn)生、儲(chǔ)存和分泌,通過與位于細(xì)胞膜上的受體鳥苷酸環(huán)化酶相互作用,ANP主要發(fā)揮舒張血管、調(diào)節(jié)鈉水平和維持血容量平衡的作用[7-9]。除了心房外,ANP還分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng),也存在于血漿和腦脊液中[10]。已有研究表明,體內(nèi)ANP的含量和代謝發(fā)生異常,往往與心血管疾病、癌癥等密切相關(guān)[11,12]。利用化學(xué)方法合成ANP對(duì)于研究其生理功能、作用機(jī)制以及疾病的干預(yù)和治療具有重要意義。然而,由于ANP肽鏈較長(zhǎng),且含有二硫鍵橋連的環(huán)狀結(jié)構(gòu),使其高效化學(xué)合成具有一定困難。

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)結(jié)合了液相色譜的高效分離和質(zhì)譜強(qiáng)大的結(jié)構(gòu)鑒定能力,具有高分離度、高靈敏度以及可獲得豐富結(jié)構(gòu)信息等特點(diǎn),在合成反應(yīng)的進(jìn)程監(jiān)測(cè)中發(fā)揮了重要作用,極大地提高了對(duì)未知物的分離分析能力[13-21]。針對(duì)ANP重要的生理功能,本文開展了ANP化學(xué)合成及其過程的監(jiān)測(cè)與優(yōu)化,設(shè)計(jì)了固相多肽合成與液相氧化相結(jié)合的策略,建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)分析新方法,對(duì)固相合成產(chǎn)物進(jìn)行了分離分析,并對(duì)液相氧化方法進(jìn)行了篩選和優(yōu)化,最終分離純化得到了目標(biāo)多肽。該研究為長(zhǎng)鏈/環(huán)狀多肽的高效化學(xué)合成及其液相色譜-質(zhì)譜分離鑒定提供了方法借鑒。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

超高效液相色譜-紫外-電噴霧離子源-離子阱串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-UV-ESI-IT MS/MS)分析系統(tǒng)由Ultimate 3000 UHPLC、DAD-3000RS二極管陣列檢測(cè)器和LCQ Fleet離子阱質(zhì)譜儀組成(Thermo Fisher,美國(guó))。LC-20AD HPLC高效液相色譜系統(tǒng)配備二極管陣列檢測(cè)器(Shimadzu,日本)。半制備高效液相色譜系統(tǒng)包括LC-20AR色譜泵,SPD-20A二極管陣列檢測(cè)器,FRC-10A自動(dòng)收集器(Shimadzu,日本)。9.4T Solarix型傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀(FT-ICR-MS, Bruker,美國(guó)),配備基質(zhì)輔助激光解吸(MALDI)離子源。色譜柱包括Welch Ultimate UHPLC XB-C18(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)(上海月旭科技股份有限公司)、Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)(北京迪馬科技有限公司)和Diamonsil C18(250 mm×10 mm, 5 μm)(北京迪馬科技有限公司)。

2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU,純度為99%)購(gòu)自吉爾生化(上海)有限公司(中國(guó)); 1-羥基苯并三氮唑水合物(HOBt·H2O)、Fmoc-Arg(2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulphonyl, Pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tert-butyl, tBu)-OH、Fmoc-Asn(trityl, Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Met-OH和Fmoc-Tyr(tBu)-Wang樹脂均購(gòu)自Advanced ChemTech公司(美國(guó));乙腈(色譜純)購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司(美國(guó));三氟乙酸(TFA,純度為99.9%)、1,2-乙二硫醇(EDT,純度為90%)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司(美國(guó));三異丙基硅烷(TIS,純度為98%)、N-甲基嗎啡啉(NMM,純度為99.5%)購(gòu)自百靈威科技有限公司;N,N-二甲基甲酰胺(DMF,純度為99.9%)、二氯甲烷(純度為99.8%)、六氫吡啶(piperidine,純度為97.5%)、二甲基亞砜(DMSO,純度為99.5%)均購(gòu)自北京化工廠,溶劑DMF和二氯甲烷均加入分子篩(有效孔徑為0.4 nm)干燥除水;N,N′-二異丙基碳二亞胺(DIC,純度為98%)購(gòu)自阿拉丁公司。實(shí)驗(yàn)所用超純水由Milli Q純水儀產(chǎn)生(Millipore公司,美國(guó))。

1.2 ANP的化學(xué)合成

1.2.1ANP直鏈多肽的Fmoc固相合成

采用Fmoc固相合成策略對(duì)ANP直鏈進(jìn)行合成,其過程如下:將Fmoc-Tyr(tBu)-Wang樹脂裝入多肽合成管中,加入DMF溶脹樹脂。待樹脂充分溶脹后,抽濾除去DMF,并用新的DMF清洗3次,然后,加入20%(體積分?jǐn)?shù))的六氫吡啶/DMF溶液脫除Fmoc保護(hù)基,用DMF清洗樹脂3次。稱取側(cè)鏈保護(hù)的Fmoc-氨基酸及縮合劑,加入DMF使其溶解并活化,將活化后的氨基酸溶液與樹脂混合,進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。循環(huán)上述脫保護(hù)、清洗、偶聯(lián)、清洗等步驟,逐步延長(zhǎng)肽鏈,直至28個(gè)氨基酸連接完畢。

完成多肽鏈的延長(zhǎng)之后,脫除末端Fmoc保護(hù)基,清洗樹脂后,用二氯甲烷和甲醇進(jìn)行樹脂收縮。收縮完成后,將樹脂進(jìn)行真空干燥。取干燥后的樹脂,加入裂解液(TFA∶EDT∶TIS∶H2O的體積比為94∶2.5∶1∶2.5),在冰浴中緩慢攪拌15 min,室溫下繼續(xù)裂解3 h。反應(yīng)結(jié)束后將收集到的濾液在35 ℃下減壓旋蒸濃縮,隨后加入預(yù)冷過的乙醚,使多肽沉淀,將所獲得的多肽離心、洗滌、干燥,得到粗品ANP直鏈多肽。

ANP多肽的氨基酸序列為NH2-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-COOH(SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY),第7位和第23位的半胱氨酸通過二硫鍵成環(huán)。

1.2.2二硫鍵形成及其反應(yīng)監(jiān)測(cè)

采用兩種策略對(duì)巰基進(jìn)行氧化以形成二硫鍵:(1)碘氧化法:以乙腈-水(1∶4, v/v)為溶劑溶解多肽,以多肽與碘物質(zhì)的量之比為2∶1加入碘單質(zhì),多肽的濃度為0.5 mmol/L,室溫下進(jìn)行氧化。(2)DMSO氧化法:以pH=5.6的醋酸水溶液為溶劑溶解多肽,加入DMSO,使DMSO體積比為20%,多肽的濃度為0.5 mmol/L,室溫下進(jìn)行氧化。

利用UHPLC-UV-ESI-IT MS系統(tǒng)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程,所用色譜柱為Welch Ultimate UHPLC XB-C18(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm),流動(dòng)相A為含0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸的水溶液,流動(dòng)相B為含0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸的乙腈溶液,流速為0.2 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。洗脫梯度為0～10 min, 5%B～50%B。

1.3 ANP的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定

1.3.1ANP的分離純化

取部分ANP粗品溶于水中,采用Shimadzu LC-20AD HPLC系統(tǒng)對(duì)樣品進(jìn)行分析,色譜柱為Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm),流動(dòng)相A為含0.1%(體積分?jǐn)?shù))TFA的水溶液,流動(dòng)相B為含0.1%(體積分?jǐn)?shù))TFA的乙腈溶液,流速為1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。洗脫梯度為0～15 min, 20%B～35%B。

進(jìn)一步采用Shimadzu LC-20AR半制備高效液相色譜儀對(duì)所合成的多肽進(jìn)行純化。將待純化的ANP溶于起始流動(dòng)相(含0.1%(體積分?jǐn)?shù))TFA的20%(體積分?jǐn)?shù))乙腈水溶液),色譜柱為Diamonsil C18(250 mm×10.0 mm, 5 μm),流動(dòng)相A為含0.1%(體積分?jǐn)?shù))TFA的水溶液,流動(dòng)相B為含0.1%(體積分?jǐn)?shù))TFA的乙腈溶液,流速為3.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。純化梯度為0～15 min, 20%B～35%B。

1.3.2ANP的結(jié)構(gòu)鑒定

采用UHPLC-UV-ESI-IT MS/MS及MALDI-FT-ICR MS對(duì)合成的ANP多肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。色譜柱為Welch Ultimate UHPLC XB-C18(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm),流動(dòng)相A為含0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸的水溶液,流動(dòng)相B為含0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸的乙腈溶液,流速為0.2 mL/min,洗脫梯度為0～10 min, 5%B～50%B。質(zhì)譜離子源噴霧電壓為4.5 kV(正離子模式),毛細(xì)管溫度為300 ℃。通過MALDI-FT-ICR MS獲得ANP的準(zhǔn)確分子量,通過UHPLC-UV-ESI-IT MS/MS的一級(jí)質(zhì)譜信號(hào)以及二級(jí)質(zhì)譜的碎片離子信號(hào),確定ANP的結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與討論

2.1 ANP直鏈多肽的Fmoc固相合成

ANP作為一種多肽類激素,對(duì)血液中的鈉水平調(diào)節(jié)和穩(wěn)態(tài)平衡具有重要作用[22]。ANP含有28個(gè)氨基酸,其中第7和23位為兩個(gè)半胱氨酸(Cys),通過兩個(gè)半胱氨酸的側(cè)鏈巰基形成二硫鍵,使其具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)[23]。由于ANP在體內(nèi)含量很低,要進(jìn)行ANP結(jié)構(gòu)、功能等研究,就需要采用化學(xué)合成的方法進(jìn)行制備。固相多肽合成具有操作便利、反應(yīng)效率高、副反應(yīng)少等優(yōu)勢(shì),過量氨基酸與試劑的加入,可以使反應(yīng)更加完全,并且在反應(yīng)結(jié)束后,通過簡(jiǎn)單的過濾除去過量的反應(yīng)物,因此采用Fmoc固相多肽合成法進(jìn)行ANP多肽的制備。由于ANP的肽鏈相對(duì)較長(zhǎng),并且需要形成鏈內(nèi)二硫鍵,為了獲得更高的合成效率,擬采取固相方法合成ANP直鏈與液相氧化形成二硫鍵相結(jié)合的策略,進(jìn)行ANP的化學(xué)合成,合成流程如圖1所示。相比于固相氧化成環(huán),液相氧化具有位阻小、氧化效率高且易于監(jiān)測(cè)氧化進(jìn)程等優(yōu)勢(shì),因此首先對(duì)ANP直鏈28肽進(jìn)行固相合成,然后進(jìn)行液相成環(huán)反應(yīng),最終獲得ANP多肽。

圖 1 ANP合成流程圖Fig. 1 Scheme of human atrial natriuretic peptide (ANP) synthesisAA: amino acid; tBU: tert-butyl; Pbf: 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulphonyl; Trt: trityl.

在ANP直鏈合成過程中,為了提高氨基酸偶聯(lián)反應(yīng)的效率,選用HATU作為縮合劑,添加有機(jī)堿NMM以輔助活化羧基。HATU是一種胍正離子縮合劑,具有反應(yīng)活性高、偶聯(lián)速率快,適合于長(zhǎng)鏈肽中氨基酸的偶聯(lián)?？紤]到ANP序列中含有半胱氨酸,采用常規(guī)HATU法偶聯(lián)易發(fā)生消旋,故在進(jìn)行半胱氨酸偶聯(lián)過程中改用DIC作為縮合劑,以二氯甲烷-DMF(1∶1, v/v)作為溶劑,以抑制半胱氨酸消旋的發(fā)生[4,24]。此外,在肽鏈延長(zhǎng)后期,由于反應(yīng)位阻增大等因素,偶聯(lián)反應(yīng)較為困難,故引入了微波輔助合成,以提高偶聯(lián)反應(yīng)效率。

2.2 ANP直鏈多肽的分離分析

采用RP-HPLC方法對(duì)所制備的ANP直鏈多肽進(jìn)行了分離分析,分離條件如1.3.1節(jié)所述。色譜分離圖(見圖2a)顯示,ANP直鏈粗品中有兩個(gè)信號(hào)較強(qiáng)的主色譜峰。利用MALDI-FT-ICR MS對(duì)這兩個(gè)峰進(jìn)行了鑒定,結(jié)果顯示,峰2的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為3 081.4 797(見圖3b),與目標(biāo)物直鏈的精確分子質(zhì)量3 080.4 603相對(duì)應(yīng),因此峰2為目標(biāo)物ANP直鏈28肽。峰1的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為2 978.4 679(見圖3a),與目標(biāo)ANP直鏈28肽相差103 Da,通過檢索發(fā)現(xiàn)103 Da歸屬于半胱氨酸殘基,而丟失一個(gè)Cys的27肽的精確分子質(zhì)量為2 977.4 512,與峰1的質(zhì)譜測(cè)定值一致。因此可以斷定,峰1為丟失一個(gè)Cys的27肽。由于減少了1個(gè)氨基酸,其疏水性減小,親水性增加,導(dǎo)致保留時(shí)間減小,比目標(biāo)ANP直鏈28肽先出峰(見圖2a)。分析缺失的原因可能是隨著多肽鏈長(zhǎng)度的增加,位阻不斷增加,導(dǎo)致Cys偶聯(lián)不充分。

圖 2 (a)ANP直鏈粗品和(b)純化后ANP直鏈的 RP-HPLC圖Fig. 2 RP-HPLC chromatograms of (a) crude linear ANP and (b) purified linear ANP

圖 3 (a)副產(chǎn)物27肽和(b)ANP直鏈多肽的 MALDI-FT-ICR質(zhì)譜圖Fig. 3 MALDI-FT-ICR (ion cyclotron resonance) mass spectra of (a) by-product and (b) linear ANP

由于副產(chǎn)物結(jié)構(gòu)中含有半胱氨酸,其存在對(duì)后續(xù)液相氧化存在干擾,因此利用半制備高效液相色譜對(duì)ANP直鏈粗品進(jìn)行了分離純化,色譜條件如1.3.1節(jié)所述。RP-HPLC和高分辨質(zhì)譜分析結(jié)果表明,純化后的直鏈純度高、結(jié)構(gòu)正確(見圖2b和3b),經(jīng)過計(jì)算含有28個(gè)氨基酸的ANP直鏈多肽的產(chǎn)率為19.1%。

2.3 ANP直鏈多肽氧化成環(huán)反應(yīng)的監(jiān)測(cè)和優(yōu)化

在獲得ANP直鏈多肽純品后,利用液相合成的方法對(duì)其進(jìn)行氧化成環(huán),巰基氧化反應(yīng)的位點(diǎn)為第7位和第23位的半胱氨酸。目前形成二硫鍵的方法通常為加入氧化劑,常用的氧化試劑包括I2[25]、O2[26]、H2O2[27,28]和DMSO[29]等。其中,單質(zhì)碘氧化法具有反應(yīng)速度快的特點(diǎn),因此首先嘗試將其用于ANP直鏈多肽的氧化。反應(yīng)以乙腈-水(1∶4, v/v)作為溶劑,在室溫下進(jìn)行。由于I2氧化性強(qiáng),反應(yīng)速率快,因此在反應(yīng)10 min后,即利用HPLC對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行了分離分析(見圖4)。RP-HPLC分析結(jié)果顯示,反應(yīng)體系主要分離出3個(gè)色譜峰,利用ESI-IT MS和高分辨MALDI-FT-ICR MS對(duì)3種物質(zhì)進(jìn)行了鑒定,其中峰2為氧化成環(huán)的目標(biāo)ANP,其一級(jí)質(zhì)譜信號(hào)[M+5H]5+(m/z=617.3)、[M+4H]4+(m/z=771.3)和[M+3H]3+(m/z=1 027.9)與ANP理論多電荷峰[M+5H]5+(m/z=617.1)、[M+4H]4+(m/z=771.1)和[M+3H]3+(m/z=1 027.8)相對(duì)應(yīng)。高分辨質(zhì)譜測(cè)得準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z3 079.4 679,與ANP精確相對(duì)分子質(zhì)量3 078.4 447相一致。峰1和峰3的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+分別為m/z3 095.4 646和3 221.3 571,與目標(biāo)物不符,為反應(yīng)副產(chǎn)物。根據(jù)氧化產(chǎn)物目標(biāo)峰2的比例,雖然單質(zhì)碘氧化巰基的反應(yīng)速率快,幾分鐘內(nèi)即可完成,但是副產(chǎn)物較多,產(chǎn)率低,不是理想的氧化成環(huán)方法。

DMSO作為合成反應(yīng)中一種常用的氧化劑,其氧化條件溫和,可以通過調(diào)控DMSO體積分?jǐn)?shù)控制氧化速率[30]。利用DMSO氧化巰基的過程中,伯醇、羧酸、酯、氨基等官能團(tuán)均不受影響,因此在二硫鍵的形成中得到了廣泛的應(yīng)用[31]。以pH=5.6、DMSO體積分?jǐn)?shù)為20%的醋酸水溶液對(duì)ANP直鏈多肽進(jìn)行了氧化,為了優(yōu)化反應(yīng)條件,利用1.2.2節(jié)所建立的UHPLC-UV-ESI-IT MS方法對(duì)氧化反應(yīng)的進(jìn)程進(jìn)行了監(jiān)測(cè)(見圖5)。隨著氧化反應(yīng)的進(jìn)行,出現(xiàn)了一個(gè)新的色譜峰,表明有新物質(zhì)的生成。ESI-IT MS表征數(shù)據(jù)顯示,其多電荷峰([M+5H]5+(m/z=617.0)、[M+4H]4+(m/z=771.1)、[M+3H]3+(m/z=1 027.9))與成環(huán)后ANP的理論多電荷峰一致(見圖5c)。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),直鏈ANP所對(duì)應(yīng)的峰1強(qiáng)度逐漸下降,成環(huán)后ANP所對(duì)應(yīng)的峰2的強(qiáng)度明顯上升,表明氧化反應(yīng)順利進(jìn)行。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為8 h時(shí),直鏈在光譜檢測(cè)器上基本消失,表明反應(yīng)結(jié)束。在反應(yīng)過程中,除了反應(yīng)物和產(chǎn)物,未見明顯干擾物質(zhì),表明該反應(yīng)體系副產(chǎn)物較少,氧化結(jié)果令人滿意。

2.4 ANP的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定

圖 6 (a)純化前ANP粗品和(b)純化后ANP的RP-HPLC圖Fig. 6 RP-HPLC chromatograms of (a) the crude ANP and (b) the purified ANP

圖 7 ANP的(a) ESI-IT質(zhì)譜圖和(b和c)ESI-IT MS/MS碎片離子圖Fig. 7 (a) ESI-IT mass spectrum and (b and c) ESI-IT- MS/MS spectra of purified ANP

3 結(jié)論

本文采用固相合成與液相氧化相結(jié)合的策略對(duì)人心房鈉尿肽進(jìn)行了化學(xué)合成,建立了HPLC-MS/MS法對(duì)合成反應(yīng)進(jìn)行了監(jiān)測(cè)?；谄浞蛛x和鑒定數(shù)據(jù),選擇了條件溫和的DMSO氧化法對(duì)ANP直鏈多肽進(jìn)行了成環(huán)反應(yīng),最終得到了純度高、結(jié)構(gòu)正確的ANP產(chǎn)物。該研究為人心房鈉尿肽的高效制備及分離鑒定提供了方法借鑒。