趙 陽，周 林，賀 強(qiáng)

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院 肝膽胰脾外科，北京 100020

肝移植是治療各種終末期肝病的唯一有效外科手段。肝移植患者術(shù)后5 年生存率高達(dá)80%[1]，但遠(yuǎn)期預(yù)后并未因此得到顯著改善。術(shù)后急慢性排斥反應(yīng)導(dǎo)致的移植物失功嚴(yán)重影響患者的生存；免疫抑制劑的長期應(yīng)用，雖可顯著降低移植后排斥率，但可增加感染和腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，因而誘導(dǎo)供體特異性免疫耐受成為解決上述問題的根本辦法。調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs) 是一種具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞亞群，在移植術(shù)后免疫耐受的形成過程中發(fā)揮重要作用[2]。目前，大多數(shù)關(guān)于Tregs 的研究主要集中在CD4+CD25+Treg 亞群，但越來越多的證據(jù)表明CD8+Tregs 在維持機(jī)體免疫平衡以及誘導(dǎo)免疫耐受方面扮演關(guān)鍵的角色，誘導(dǎo)供體特異的CD8+Tregs 可能成為突破免疫耐受誘導(dǎo)新方向[3-4]。

1 Treg 的分類與分子標(biāo)志

Treg 的分類方法眾多，根據(jù)其來源、抗原特異性以及作用機(jī)制可分為自然調(diào)節(jié)性Treg(natural regulatory T cell，nTreg) 和適應(yīng)性調(diào)節(jié)性Treg(adaptive regulatory T cell，aTreg)，aTreg 又稱誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)性Treg(induced regulatory T cell，iTreg)。前者來源于胸腺髓質(zhì)T 細(xì)胞，主要在預(yù)防自身免疫性疾病過程中發(fā)揮作用；后者則是由T 細(xì)胞在多條件下經(jīng)過各種抗原刺激后發(fā)育而來，主要作用于微生物感染和移植免疫。根據(jù)表面分子CD4 或CD8 表達(dá)可分為CD4+Tregs 和CD8+Tregs，目前對(duì)于CD4+Tregs 亞群的作用機(jī)制已較為明確，而CD8+Tregs仍有著較大的研究空間。

1972 年，Gershon 等[5]首次發(fā)現(xiàn)CD8+Tregs 具有免疫抑制作用。但缺乏特異性分子標(biāo)志物及檢測(cè)手段落后成為研究CD8+Tregs 的最大瓶頸，導(dǎo)致CD8+Tregs 的研究停滯多年。國內(nèi)外免疫學(xué)家研究陸續(xù)報(bào)道了幾種具有特異性表型的CD8+Tregs，包括CD8+CD28-、CD8+CD25+、CD8+CD122+、CD8+CD45RClow和CD8+CD75s+Tregs，這些成果雖在一定程度上推動(dòng)了CD8+Treg 的研究進(jìn)展，但對(duì)于移植供體抗原特異性CD8+Tregs 表型仍存在許多的爭(zhēng)議。

叉頭轉(zhuǎn)錄蛋白(forkhead box protein，F(xiàn)oxp)-3特異性高表達(dá)于胸腺和外周的CD4+CD25+Treg 表面，是目前公認(rèn)的CD4+Tregs 的特征性表型，同時(shí)其也在CD8+CD28-、CD8+CD25+和CD8+CD45RClowTreg 上表達(dá)，在普通T 細(xì)胞活化后其表面也上調(diào)性地表達(dá)Foxp3[6]，因此Foxp3 是CD8+Tregs 亞群的重要標(biāo)志物，但它的缺失并不能排除CD8+Tregs的存在。CD28 缺失或低表達(dá)曾被認(rèn)為是CD8+Treg特有的表面標(biāo)志，并已證實(shí)CD8+CD28-Treg 細(xì)胞具有免疫抑制作用，可抑制輔助性T 細(xì)胞的活化與增殖，但從人體中分離出來的多克隆CD8+CD28-細(xì)胞卻未表現(xiàn)出免疫抑制功能[7]。

西班牙學(xué)者曾于1994 年報(bào)道CD45RC 低表達(dá)為T 淋巴細(xì)胞分化和激活的表面標(biāo)記物[8]，此后Yamacuchi 等[9]和Xystrakis 等[10]也 先 后 證 明CD45RC 可以作為大鼠CD8+Tregs 的表面標(biāo)志；我中心發(fā)現(xiàn)在大鼠同種異體原位肝移植免疫耐受誘導(dǎo)過程中CD45RClowTreg 顯著升高，并聚集于移植肝局部[11]。因此，CD45RClow被認(rèn)為是CD8+Tregs的表面標(biāo)志物。

除此之外，CD38、CD27、CD94、CD62L、神經(jīng)纖維因子(neuropilin，NRP)-1、程序性死亡分子(programmed death，PD)-1[12]、 纖 維 介 素 蛋 白(fibroleukin，F(xiàn)GL)-2 也是CD8+Tregs 分子表型的研究焦點(diǎn)。目前仍缺乏特異的分子表型來鑒別不同CD8+Tregs 亞群，無法得到高純度的相關(guān)細(xì)胞亞群，阻礙CD8+Tregs 的研究。

2 CD8+ Treg 誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)制

CD8+Treg 具有多種不同的作用機(jī)制，主要包括釋放特異性細(xì)胞因子、特異性殺傷機(jī)制和阻斷代謝等，原因可能是不同CD8+Treg 亞群在不同環(huán)節(jié)發(fā)揮不同作用，或存在一種占據(jù)主導(dǎo)地位的CD8+Treg 亞群通過不同抑制途徑參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)。

2.1 抑制性細(xì)胞因子途徑 CD8+Tregs 介導(dǎo)的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)過程中，具有免疫抑制效應(yīng)的細(xì)胞因子扮演重要角色。Treg 產(chǎn)生的抑制性細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-10、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β 和IL-35 等 已被證實(shí)在CD8+Treg 抑制特性中發(fā)揮重要作用。研究對(duì)象為小鼠時(shí)，IL-10 參與CD4+Tregs 和CD8+Tregs 的抑制作用，且根據(jù)這些細(xì)胞中IL-10 的表達(dá)水平來看，在CD8+CD122+Tregs 中IL-10 表達(dá)出比在CD4+Tregs 中更高的抑制活性[13]。同樣，TGF-β 在CD8+CD122+Tregs 介導(dǎo)的抑制中也發(fā)揮重要作用。以非抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC) 依 賴 機(jī) 制 阻 斷CD8+CD122+Tregs 對(duì)TGF-β1 的抑制作用，可逆轉(zhuǎn)T 細(xì)胞增殖。在共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，類似阻斷TGF-β 的實(shí)驗(yàn)已證明其參與多肽特異性CD8+iTregs、人角膜內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)Foxp3+CD25+CD8+Tregs 和人CD8+CD45RClowTregs的抑制功能[14-15]。IL-35 主要由Foxp3+nTregs 表達(dá)，是IL-12 異二聚體細(xì)胞因子家族的新成員，其在Tregs 最大抑制活性上發(fā)揮重要作用，IL-35 的異位表達(dá)可賦予原始T 細(xì)胞調(diào)節(jié)活性，重組IL-35可抑制體內(nèi)T 細(xì)胞增殖[16]。

Bézie 等[17]報(bào)道了一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子IL-34 在CD4+和CD8+Treg 功能中的作用。只有CD8+和CD4+Tregs 表達(dá)IL-34。通過共培養(yǎng)抑制實(shí)驗(yàn)中使用抗體阻斷IL-34，發(fā)現(xiàn)大鼠心臟移植模型中，IL-34 參與CD40Ig 誘導(dǎo)CD8+CD45RClowTregs 的抑制活性。同樣，阻斷IL-34 可部分消除人CD4+和CD8+CD45RClowTregs 介導(dǎo)的抑制作用[18]。2.2 細(xì)胞溶解途徑 Tregs 的細(xì)胞溶解機(jī)制在人體中由顆粒酶A 介導(dǎo)，在小鼠由顆粒酶B 介導(dǎo)。顆粒酶B 缺乏時(shí)會(huì)降低鼠類Treg 的體外抑制活性，同時(shí)Treg 誘導(dǎo)凋亡具有穿孔素依賴性[19]。穿孔素被一些CD8+Tregs 用來誘導(dǎo)靶細(xì)胞的細(xì)胞溶解。如當(dāng)Perf-/-Tregs 在體外不能抑制效應(yīng)性T 細(xì)胞增殖時(shí)，Qa-1 限制性CD8+Treg 通過穿孔素介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用直接殺傷靶細(xì)胞[20]。

2.3 阻斷代謝途徑 IL-2 是效應(yīng)性T 細(xì)胞增殖和發(fā)揮免疫作用所必需的細(xì)胞因子，而Tregs 可以抑制效應(yīng)性T 細(xì)胞中IL-2 的產(chǎn)生。首先，IL-2R、CD122 和( 或)CD25 的 高 表 達(dá)， 使CD8+Tregs 在擴(kuò)增同時(shí)消耗大量的效應(yīng)性T 細(xì)胞。CD122 主要由人CD8+T 細(xì)胞表達(dá)，包括CD8+Tregs 和記憶性CD8+T 細(xì)胞，CD122 或CD25 的表達(dá)使CD8+Treg對(duì)低劑量IL-2 具有較高的敏感度[21]。此外，CD8+CD28-Tregs 可影響效應(yīng)性T 細(xì)胞對(duì)APC 的反應(yīng)而減少IL-2 的產(chǎn)生，CD8+CD25+Tregs 能夠通過效應(yīng)性T 細(xì)胞下調(diào)IL-2R 的表達(dá)，從而抑制其增殖[22]。

2.4 調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞途徑 CD8+Treg 除通過以上途徑影響效應(yīng)T 細(xì)胞功能外，還可調(diào)節(jié)效應(yīng)T 細(xì)胞活化所需樹突狀細(xì)胞的成熟和功能。樹突狀細(xì)胞作為功能最強(qiáng)的APC，在效應(yīng)T 細(xì)胞發(fā)揮免疫作用過程中有著重要作用。已證實(shí)細(xì)胞毒性T 細(xì)胞相關(guān)抗原(cytotoxic T lymphocyte associated antigen，CTLA)-4 由Tregs 組成性表達(dá)，應(yīng)用CTLA-4 特異性阻斷抗體或CTLA-4 缺失，Tregs 都顯現(xiàn)出功能性CTLA-4 的缺失，使Tregs 通過樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)T 細(xì)胞的抑制效應(yīng)降低[23]。王盈等[24]也證實(shí)，活化CD8+Tregs 在生理或病理性免疫反應(yīng)中可以負(fù)向調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞的抗原遞呈功能，降低其刺激效應(yīng)T 細(xì)胞反應(yīng)的能力。

3 CD8+ Treg 與肝移植免疫耐受

肝具有肝動(dòng)脈和門靜脈的雙重血供，又是人體最大的實(shí)體器官，其含有的免疫細(xì)胞和抗原量也最多，被稱為免疫特惠器官。肝移植后排斥反應(yīng)發(fā)生率較其他器官移植低，急性排斥反應(yīng)也更容易治療和逆轉(zhuǎn)。肝移植對(duì)ABO 血型匹配程度、HLA 配型的要求也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他器官移植[25]。

免疫抑制劑的應(yīng)用使同種異體肝移植物在中短期內(nèi)存活成為可能，并極大地提高了移植物存活率。但其在改善移植物存活率和限制慢性排斥病變發(fā)展的同時(shí)也帶來了諸多的不良反應(yīng)。因而，對(duì)于肝移植后免疫問題的解決，最佳方法是誘導(dǎo)供者特異性的免疫抑制狀態(tài)，使移植物為宿主所接受，且不影響宿主的其他免疫功能，即移植免疫耐受。經(jīng)研究，器官移植排斥反應(yīng)的發(fā)病機(jī)制主要是由T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而CD8+Tregs作為T 細(xì)胞的一種重要細(xì)胞亞群，通過分泌多種細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答，在移植免疫中發(fā)揮重要作用[26]。

Sindhi 等[27]發(fā)現(xiàn)肝移植受體術(shù)后體內(nèi)CD8+Tregs 水平與受體術(shù)后穩(wěn)定程度呈正相關(guān)，與急性排斥反應(yīng)呈高度負(fù)相關(guān)。其將肝移植或小腸移植的16 例患兒分為三組并檢測(cè)各組CD8+Tregs 水平變化，結(jié)果顯示相比大量免疫抑制劑組，無免疫抑制劑組或少量免疫抑制劑組患兒體內(nèi)更易檢出CD8+Tregs，而在發(fā)生過急性排斥反應(yīng)的患兒體內(nèi)CD8+Tregs 水平較低。此后，Lin 等[28]也提出CD8+Tregs 的擴(kuò)增與降低急性或慢性排斥反應(yīng)發(fā)生率和維持良好的移植功能有關(guān)。這種結(jié)果提示大劑量免疫抑制劑治療抑制了CD8+Tregs 產(chǎn)生，而排斥反應(yīng)的發(fā)生消耗了大量的CD8+Tregs。因而，誘導(dǎo)CD8+Tregs 亞群的產(chǎn)生和增殖可為誘導(dǎo)免疫耐受提供新療法。

4 問題與展望

Tregs 或Tregs 相關(guān)的臨床試驗(yàn)近些年正在進(jìn)行中[29-30]，目前仍無CD8+Tregs 的臨床試驗(yàn)開展。識(shí)別特定的分子標(biāo)志，可促進(jìn)CD8+Tregs 免疫學(xué)功能研究。對(duì)于CD8+Tregs 免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究必將成為供者特異性免疫耐受誘導(dǎo)中十分關(guān)鍵的部分。已證實(shí)CD4+和CD8+Tregs 在誘導(dǎo)耐受中具有協(xié)同作用[31]，兩者在作用機(jī)制上的差異和協(xié)同作用需要在未來充分探索。在人或大型動(dòng)物中成功誘導(dǎo)穩(wěn)定的免疫耐受，并在臨床上推廣應(yīng)用，任重而道遠(yuǎn)。免疫耐受必將成為解決肝移植及其他器官移植術(shù)后排斥問題的最理想治療手段，推動(dòng)臨床和基礎(chǔ)器官移植不斷向前發(fā)展。